喉癌相关抗原免疫电镜的定位研究
作者：倪志立 衣京梅 许亚辉 郭丽娟 王利一 刘桂芳
单位：100730 北京 卫生部北京医院耳鼻咽喉科(倪志立、王利一、刘桂芳);解放军总医院儿科免疫室(衣京梅);白求恩医科大学第二临床学院耳鼻咽喉科(许亚辉、郭丽娟)
关键词：喉肿瘤；抗体；单克隆；免疫疗法；相关抗原；；定位
中华耳鼻咽喉科杂志/990114 【摘要】 目的 研究喉癌混合单克隆抗体相关抗原的定位，为喉癌的早期诊断及导向药物治疗奠定理论基础。方法 采用三株喉癌单克隆抗体LC9、LC11、LC12混合对90例病理证实的喉癌组织切片(病理Ⅰ级49例，Ⅱ级41例)、14例喉癌前病变及10例正常喉粘膜进行免疫组化染色(ABC法)光镜观察，同时采用LSAB法对9例新鲜喉癌组织细胞行免疫过氧化物酶标记电镜包埋前染色，对混合单克隆抗体相应抗原进行超微结构的定位观察。结果 喉癌组织中喉癌相关抗原检出率(97.7%)与正常喉粘膜相比明显增高(P<0.01)；混合单克隆抗体相应抗原主要定位于细胞膜性结构，即细胞膜、核膜、线粒体膜和内质网膜。结论 混合喉癌单克隆抗体具有良好的特异性，带有药物的单克隆抗体可通过膜性结构来攻击癌细胞，达到治疗作用。混合单克隆抗体检测的相关抗原均分布于细胞膜和/或细胞浆中，细胞核无着色。
, 百拇医药
Studies on localization of laryngeal carcinoma associated antigen by immunoelectromicroscopy NI Zhili, YI Jingmei , XU Yahui, et al. Department of Otorhinolaryngology, Beijing Hospital, Beijing 100730
【Abstract】 Objective To study the localization of laryngeal carcinoma associated antigen (LCAA) in the carcinoma tissue. Methods ninety cases of laryngeal carcinoma and 14 cases of laryngeal precancerous lesion and 10 cases of normal laryngeal mucosa were detected with three strains of monoclonal antibodies LC9, LC11, LC12 by immunochemistry . The positive sections of laryngeal carcinoma were observed under light microscope and electromicroscopy. Results The positive rates of LCAA were dramatically higher than that in normal epithelial and precancerous tissues (P<0.01 ). The results showed that the mixed monoclonal antibody had tissue specificity . The MLC associated antigens only distributed in cell membranes and /or cytoplasm . No cell nucleus was stained .Conclusion The LCAA is mainly located in cell membranous structure . This study may provide morphological basis for immunoimaging diagnosis and targeting chemotherapy by application of laryngeal carcinoma McAb.
, 百拇医药
【Key words】 Laryngeal neoplasms Antibodies,monoclonal Immuotherapy Associated antigen Localization
众多的研究表明，肿瘤细胞表面具有与正常细胞不同的表面抗原，即肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原的发现对肿瘤的研究及血清学诊断具有重要的意义[1]。Corteina等[2]用喉癌单克隆抗体对喉癌相关抗原进行了研究，发现抗原主要存在于细胞膜,偶见于细胞浆内，我们选择三种喉癌单克隆抗体混合，用免疫组织化学和免疫电镜的方法对喉癌相关抗原进行定位研究。
材料与方法
材料与方法
1.材料：选择90例病理证实的喉癌组织(其中病理Ⅰ级49例，Ⅱ级41例)，14例喉癌前病变(喉乳头状瘤5例，喉角化症及喉白斑各2例，喉重度不典型增生5例)及10例正常喉粘膜，进行免疫组化染色光镜观察；选择9例新鲜的喉癌组织，行免疫电镜观察。
, 百拇医药
2.主要试剂：喉癌单克隆抗体LC9、LC11及LC12均为白求恩医科大学第二临床学院耳鼻咽喉科实验室提供[3]。酶标羊抗鼠 IgG 由长春农牧大学军事兽医研究所生产。 ABC 试剂盒购自Vector公司，SP试剂盒购自北京中山技术有限公司。
3.方法：喉癌相关抗原免疫组化检测，按Hsu等[4]的ABC检测法进行，免疫电镜亚细胞定位分析根据田欣田等[5]介绍的方法进行。
结果
1.喉癌相关抗原的检出率：用3种喉癌单克隆体的混合物对90例喉癌和14 例喉癌前病变及10例正常喉粘膜进行免疫组化检测，结果见表1。喉癌组与对照组相比，其相关抗原阳性率明显增高(χ2检验 , P<0.01)。 7例喉癌前病变混合单克隆抗体染色阳性的病例(喉乳头状瘤 2例，喉角化症、喉白斑病各1例，喉粘膜重度不典型增生3例)中6例半年～3年后发展为喉癌，其余病例仍在随访中。
, 百拇医药
表1 喉癌、喉癌前病变及正常喉粘膜相关
抗原免疫组化检测 分组
例数
阳性例数
阳性率(%)
喉癌
90
88
97.7
喉癌前病变
14
7
50
, 百拇医药
正常喉粘膜
10
0
0
2.喉癌相关抗原光镜定位观察：免疫组化染色后，光镜下可见与喉癌混合单克隆抗体相结合的相关抗原均分布于细胞膜和/或细胞浆中，量不等，异质性分布，呈棕褐色，细胞核无着色(图1)。
图1 混合单克隆抗体染色。喉癌相关抗原均匀分布于细胞膜或细胞浆中，呈棕褐色，胞核无着色。ABC法×400
3.喉癌相关抗原免疫酶标电镜的定位观察：经免疫过氧化物酶染色后，喉癌细胞中可见细胞膜性结构(细胞膜、核膜、扩张的粗面内质网膜及肿胀扩张的线粒体膜)中均可见到阳性反应沉积物，细胞基质中也散在有混合单克隆抗体结合的相关抗原的阳性物质，且电子密度大(图2、 3)。未加混合单克隆抗体的对照组喉癌细胞电镜观察时，在细胞膜性结构中均未见到免疫复合物的沉积，但在胞质中可见到大量扩张肿胀的线粒体及内质网，由膜形成管状或泡状，并可见溶酶体呈单位膜包围的圆球状液泡，电子密度大(图 4)。
, 百拇医药
图2 混合单克隆抗体免疫电镜包埋前染色。可见核膜、肿胀扩张的线粒体膜上有阳性反应沉积物(箭头)。LSAB法×20 000
图3 混合单克隆抗体免疫电镜包埋前染色。可见粗面内质网膜上有阳性反应沉积物，并可见张力微丝 LSAB×20 000
图4 未加抗体的对照组喉癌细胞电镜观察。线粒体及内质网肿胀成管泡状，并可见圆球液泡状溶酶体，未见免疫复合物沉积。 ×20 000
讨论
肿瘤具有较大的异质性，也表现在其相关抗原的异质性，肿瘤抗原有逃避、调变、飘移甚至脱落排出等现象，其抗原结合位点的多寡以及结合部位都影响抗体进入细胞或与细胞结合的速度与容量[6]，所以形态学上的定位极有必要。我们以往的实验结果显示血清中喉癌相关抗原水平与临床分型、分期密切相关，且随着肿瘤范围扩大，血清中喉癌相关抗原水平呈上升趋势，但喉癌组织中相关抗原的表达与临床分型、分期无明显关系，而抗原着色强度、阳性细胞比例与组织病理分化程度、生物学行为有关，这可能与细胞分化好，抗原表达较完全有关[7]。在此基础上我们选择分化程度高的喉癌组织，应用3种喉癌单克隆抗体混合检测喉癌组织中相关抗原。Kawahara等[8]曾报道应用4种单克隆抗体联合检测肿瘤相关抗原，认为多种单克隆抗体混合应用可明显提高检测的敏感性。我们用Lc9 、11、12 三株单克隆抗体对喉癌组织中相关抗原检出率由单一单克隆抗体的80.0%～86.6%[7]提高到97.7%，也进一步证实了Kawahara等的观点。经免疫组化染色光镜观察发现这种混合单克隆抗体的相关抗原均分布于细胞膜和/细胞浆中，量不等 ，异质性分布，胞核无着色。我们又采用免疫电镜从亚细胞水平对喉癌抗原进行定位观察，结果表明，混合单克隆抗体识别的喉癌相关抗原主要定位于细胞膜性结构中，包括细胞膜、核膜、内质网膜及线粒体膜。这为应用混合单克隆抗体开展免疫显像诊断及药物导向治疗提供了形态学参考，也可作为导向治疗机理研究及效果观察的参考指标之一。一般说来，单克隆抗体较易与膜抗原结合，表达在胞膜上的靶抗原不以游离蛋白的形式分泌或脱落，不发生调变，有利于交联物中抗体与抗原的结合，形成帽状结构，实现对肿瘤细胞的杀伤作用。本研究证实了喉癌细胞膜性结构中有大量的相关抗原分布，提示带有药物的单克隆抗体有可能通过这些膜性结构来攻击癌细胞，从而起到对肿瘤细胞的杀伤作用。
, 百拇医药
本课题为国家自然科学基金资助项目(39070861)
《参考文献》
[1] Hakomori S. Tumor associated carbohydrate antigens. Ann Rev Immunol,1984, 2:103-105.
[2] Corteina G, Lavall GP, Macario M , et al. Monoclonal antibodies against epithelial antigens in laryngeal carcinoma. J Laryngol Otol, 1988,102:709-712.
[3] 管国芳，许亚辉，孙立群，等.抗人喉癌单克隆抗体的制备及其特性研究.中华耳鼻咽喉科杂志，1995，30：50-52.
, 百拇医药
[4] Hsu SM, Raine L, Fanger H. Use of avidin biotin peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J Histochem Cytoche, 1981, 29:577-582.
[5] 田欣田，童文德 ，邱震东. 现代动物病理学实验技术. 北京：北京农业大学出版社, 1992.195-237.
[6] Sedlacek HH,Schulz G, Steinstraesser A, et al. Monoclonal antibodies in tumor therapy :present stage chance and limitations. Basel: Karger,1988.5-19.
[7] 陈鸥，管国芳，金春顺，等.喉癌单克隆抗体三株混合应用检测喉癌组织及血清中喉癌相关抗原.中华耳鼻咽喉科杂志，1996，31：43-46.
[8] Kawahara M,Terasaki PL, Chia D, et al . Use of monoclonal antibodies to detect tumor . Cancer , 1986,58 : 208-212.
(收稿:1998-05-13 修回:1998-09-15), 百拇医药
单位：100730 北京 卫生部北京医院耳鼻咽喉科(倪志立、王利一、刘桂芳);解放军总医院儿科免疫室(衣京梅);白求恩医科大学第二临床学院耳鼻咽喉科(许亚辉、郭丽娟)
关键词：喉肿瘤；抗体；单克隆；免疫疗法；相关抗原；；定位
中华耳鼻咽喉科杂志/990114 【摘要】 目的 研究喉癌混合单克隆抗体相关抗原的定位，为喉癌的早期诊断及导向药物治疗奠定理论基础。方法 采用三株喉癌单克隆抗体LC9、LC11、LC12混合对90例病理证实的喉癌组织切片(病理Ⅰ级49例，Ⅱ级41例)、14例喉癌前病变及10例正常喉粘膜进行免疫组化染色(ABC法)光镜观察，同时采用LSAB法对9例新鲜喉癌组织细胞行免疫过氧化物酶标记电镜包埋前染色，对混合单克隆抗体相应抗原进行超微结构的定位观察。结果 喉癌组织中喉癌相关抗原检出率(97.7%)与正常喉粘膜相比明显增高(P<0.01)；混合单克隆抗体相应抗原主要定位于细胞膜性结构，即细胞膜、核膜、线粒体膜和内质网膜。结论 混合喉癌单克隆抗体具有良好的特异性，带有药物的单克隆抗体可通过膜性结构来攻击癌细胞，达到治疗作用。混合单克隆抗体检测的相关抗原均分布于细胞膜和/或细胞浆中，细胞核无着色。
, 百拇医药
Studies on localization of laryngeal carcinoma associated antigen by immunoelectromicroscopy NI Zhili, YI Jingmei , XU Yahui, et al. Department of Otorhinolaryngology, Beijing Hospital, Beijing 100730
【Abstract】 Objective To study the localization of laryngeal carcinoma associated antigen (LCAA) in the carcinoma tissue. Methods ninety cases of laryngeal carcinoma and 14 cases of laryngeal precancerous lesion and 10 cases of normal laryngeal mucosa were detected with three strains of monoclonal antibodies LC9, LC11, LC12 by immunochemistry . The positive sections of laryngeal carcinoma were observed under light microscope and electromicroscopy. Results The positive rates of LCAA were dramatically higher than that in normal epithelial and precancerous tissues (P<0.01 ). The results showed that the mixed monoclonal antibody had tissue specificity . The MLC associated antigens only distributed in cell membranes and /or cytoplasm . No cell nucleus was stained .Conclusion The LCAA is mainly located in cell membranous structure . This study may provide morphological basis for immunoimaging diagnosis and targeting chemotherapy by application of laryngeal carcinoma McAb.
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【Key words】 Laryngeal neoplasms Antibodies,monoclonal Immuotherapy Associated antigen Localization
众多的研究表明，肿瘤细胞表面具有与正常细胞不同的表面抗原，即肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原的发现对肿瘤的研究及血清学诊断具有重要的意义[1]。Corteina等[2]用喉癌单克隆抗体对喉癌相关抗原进行了研究，发现抗原主要存在于细胞膜,偶见于细胞浆内，我们选择三种喉癌单克隆抗体混合，用免疫组织化学和免疫电镜的方法对喉癌相关抗原进行定位研究。
材料与方法
材料与方法
1.材料：选择90例病理证实的喉癌组织(其中病理Ⅰ级49例，Ⅱ级41例)，14例喉癌前病变(喉乳头状瘤5例，喉角化症及喉白斑各2例，喉重度不典型增生5例)及10例正常喉粘膜，进行免疫组化染色光镜观察；选择9例新鲜的喉癌组织，行免疫电镜观察。
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2.主要试剂：喉癌单克隆抗体LC9、LC11及LC12均为白求恩医科大学第二临床学院耳鼻咽喉科实验室提供[3]。酶标羊抗鼠 IgG 由长春农牧大学军事兽医研究所生产。 ABC 试剂盒购自Vector公司，SP试剂盒购自北京中山技术有限公司。
3.方法：喉癌相关抗原免疫组化检测，按Hsu等[4]的ABC检测法进行，免疫电镜亚细胞定位分析根据田欣田等[5]介绍的方法进行。
结果
1.喉癌相关抗原的检出率：用3种喉癌单克隆体的混合物对90例喉癌和14 例喉癌前病变及10例正常喉粘膜进行免疫组化检测，结果见表1。喉癌组与对照组相比，其相关抗原阳性率明显增高(χ2检验 , P<0.01)。 7例喉癌前病变混合单克隆抗体染色阳性的病例(喉乳头状瘤 2例，喉角化症、喉白斑病各1例，喉粘膜重度不典型增生3例)中6例半年～3年后发展为喉癌，其余病例仍在随访中。
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表1 喉癌、喉癌前病变及正常喉粘膜相关
抗原免疫组化检测 分组
例数
阳性例数
阳性率(%)
喉癌
90
88
97.7
喉癌前病变
14
7
50
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正常喉粘膜
10
0
0
2.喉癌相关抗原光镜定位观察：免疫组化染色后，光镜下可见与喉癌混合单克隆抗体相结合的相关抗原均分布于细胞膜和/或细胞浆中，量不等，异质性分布，呈棕褐色，细胞核无着色(图1)。
图1 混合单克隆抗体染色。喉癌相关抗原均匀分布于细胞膜或细胞浆中，呈棕褐色，胞核无着色。ABC法×400
3.喉癌相关抗原免疫酶标电镜的定位观察：经免疫过氧化物酶染色后，喉癌细胞中可见细胞膜性结构(细胞膜、核膜、扩张的粗面内质网膜及肿胀扩张的线粒体膜)中均可见到阳性反应沉积物，细胞基质中也散在有混合单克隆抗体结合的相关抗原的阳性物质，且电子密度大(图2、 3)。未加混合单克隆抗体的对照组喉癌细胞电镜观察时，在细胞膜性结构中均未见到免疫复合物的沉积，但在胞质中可见到大量扩张肿胀的线粒体及内质网，由膜形成管状或泡状，并可见溶酶体呈单位膜包围的圆球状液泡，电子密度大(图 4)。
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图2 混合单克隆抗体免疫电镜包埋前染色。可见核膜、肿胀扩张的线粒体膜上有阳性反应沉积物(箭头)。LSAB法×20 000
图3 混合单克隆抗体免疫电镜包埋前染色。可见粗面内质网膜上有阳性反应沉积物，并可见张力微丝 LSAB×20 000
图4 未加抗体的对照组喉癌细胞电镜观察。线粒体及内质网肿胀成管泡状，并可见圆球液泡状溶酶体，未见免疫复合物沉积。 ×20 000
讨论
肿瘤具有较大的异质性，也表现在其相关抗原的异质性，肿瘤抗原有逃避、调变、飘移甚至脱落排出等现象，其抗原结合位点的多寡以及结合部位都影响抗体进入细胞或与细胞结合的速度与容量[6]，所以形态学上的定位极有必要。我们以往的实验结果显示血清中喉癌相关抗原水平与临床分型、分期密切相关，且随着肿瘤范围扩大，血清中喉癌相关抗原水平呈上升趋势，但喉癌组织中相关抗原的表达与临床分型、分期无明显关系，而抗原着色强度、阳性细胞比例与组织病理分化程度、生物学行为有关，这可能与细胞分化好，抗原表达较完全有关[7]。在此基础上我们选择分化程度高的喉癌组织，应用3种喉癌单克隆抗体混合检测喉癌组织中相关抗原。Kawahara等[8]曾报道应用4种单克隆抗体联合检测肿瘤相关抗原，认为多种单克隆抗体混合应用可明显提高检测的敏感性。我们用Lc9 、11、12 三株单克隆抗体对喉癌组织中相关抗原检出率由单一单克隆抗体的80.0%～86.6%[7]提高到97.7%，也进一步证实了Kawahara等的观点。经免疫组化染色光镜观察发现这种混合单克隆抗体的相关抗原均分布于细胞膜和/细胞浆中，量不等 ，异质性分布，胞核无着色。我们又采用免疫电镜从亚细胞水平对喉癌抗原进行定位观察，结果表明，混合单克隆抗体识别的喉癌相关抗原主要定位于细胞膜性结构中，包括细胞膜、核膜、内质网膜及线粒体膜。这为应用混合单克隆抗体开展免疫显像诊断及药物导向治疗提供了形态学参考，也可作为导向治疗机理研究及效果观察的参考指标之一。一般说来，单克隆抗体较易与膜抗原结合，表达在胞膜上的靶抗原不以游离蛋白的形式分泌或脱落，不发生调变，有利于交联物中抗体与抗原的结合，形成帽状结构，实现对肿瘤细胞的杀伤作用。本研究证实了喉癌细胞膜性结构中有大量的相关抗原分布，提示带有药物的单克隆抗体有可能通过这些膜性结构来攻击癌细胞，从而起到对肿瘤细胞的杀伤作用。
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本课题为国家自然科学基金资助项目(39070861)
《参考文献》
[1] Hakomori S. Tumor associated carbohydrate antigens. Ann Rev Immunol,1984, 2:103-105.
[2] Corteina G, Lavall GP, Macario M , et al. Monoclonal antibodies against epithelial antigens in laryngeal carcinoma. J Laryngol Otol, 1988,102:709-712.
[3] 管国芳，许亚辉，孙立群，等.抗人喉癌单克隆抗体的制备及其特性研究.中华耳鼻咽喉科杂志，1995，30：50-52.
, 百拇医药
[4] Hsu SM, Raine L, Fanger H. Use of avidin biotin peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J Histochem Cytoche, 1981, 29:577-582.
[5] 田欣田，童文德 ，邱震东. 现代动物病理学实验技术. 北京：北京农业大学出版社, 1992.195-237.
[6] Sedlacek HH,Schulz G, Steinstraesser A, et al. Monoclonal antibodies in tumor therapy :present stage chance and limitations. Basel: Karger,1988.5-19.
[7] 陈鸥，管国芳，金春顺，等.喉癌单克隆抗体三株混合应用检测喉癌组织及血清中喉癌相关抗原.中华耳鼻咽喉科杂志，1996，31：43-46.
[8] Kawahara M,Terasaki PL, Chia D, et al . Use of monoclonal antibodies to detect tumor . Cancer , 1986,58 : 208-212.
(收稿:1998-05-13 修回:1998-09-15), 百拇医药