辣椒辣素治疗实验性变应性鼻炎的组织病理学及免疫组织化学研究
作者：张范英 韩德民 诸小侬 王鸿 黄美珠 张笑明
单位：100081 北京 解放军466 医院(张范英)；北京市耳鼻咽喉研究所(韩德民，诸小侬，王鸿)；北京市北新桥医院(黄美珠)；解放军301 医院(张笑明)
关键词：辣椒辣素；；免疫组织化学；；病理学；；P物质；；鼻炎；变应性；常年性
中华耳鼻烟喉科杂志990411 摘要 目的 明确辣椒辣素(capsaicin)对实验性变应性鼻炎的治疗作用。方法 采用甲苯-2，4-二异氰酸酯(toluene-2，4-diisocyanate,TDI) 致敏新西兰兔制作变应性鼻炎动物模型, 观察给予辣椒辣素处理前后症状和体征的变化，同时应用组织病理学和免疫组织化学方法观察鼻粘膜的改变。结果 应用辣椒辣素处理后, 症状和体征明显改善。免疫组织化学表明，辣椒辣素处理后P 物质免疫反应 (substance P immunoreactive,SP-IR) 纤维减少, 而对照组中明显增加。HE 染色显示辣椒辣素处理后，鼻粘膜未见水肿及炎性细胞浸润, 对照组均为鼻粘膜水肿、血管扩张及炎细胞浸润。结论 辣椒辣素能缓解流涕及喷嚏, 减少SP-IR纤维密度和数量, 而达到治疗变应性鼻炎的目的。
, 百拇医药
Immunohistochemical and pathological study of capsaicin in the treatment of rabbit animal model with allergic rhinitis
ZHANG Fanying*, HAN Demin, ZHU Xiaonong,et al
.*PLA 466 Hospital,Beijing 100081
Abstract Objective To determine the desensitization effect of capsaicin. Methods Toluene-2,4-diisocyanate(TDI) sensitized white rabbits used as animal models of allergic rhinitis were treated with capsaicin. At the end of treatment, the changes in the nasal mucosa were studied by immunohistochemical and pathological methods. Results Our results showed that the symptoms of allergic rhinitis were remarkably relieved after capsaicin treatment. Immunohistochemical study revealed that substance P immunoreactive fibers in the nasal mucosa showed a marked decrease after capasicin application, but the density and number of SP-IR fibers were significantly increased in the control group. Hematoxylin and eosin staining demonstrated that no edema was found in the nasal mucosa and small vessels were normal after capsaicin application,but edema ,vasodilation and inflammatory cell infiltration were discovered in the control group. Conclusion The results suggested that local capsaicin treatment was a selective, and non-traumatic method to induce a long lasting desensitization of the nasal mucosa, to alleviate nasal congestion, rhinorrhea and sneezing, and to reduce the sensory neuron sensitivity of the mucosa.
, http://www.100md.com
Key words Capsaicin Immunohistochemistry Pathology Substance P Rhinitis, allergic, perennial
近年来发现，辣椒辣素(capsaicin) 对无髓C 型感觉神经传入纤维的作用具有选择性, 通过耗竭其末端释放的递质P物质(substance P, SP)和减低感觉神经敏感性，而发挥治疗作用。辣椒辣素能显著地缓解或消除致敏动物鼻粘膜变应性反应[1]。本研究采用辣椒辣素处理致敏动物模型鼻粘膜, 用组织病理学及免疫组织化学方法研究辣椒辣素对实验性变应性鼻炎的治疗作用。
材料及方法
一、 动物及试剂配制
新西兰兔22只, 雄性14只, 雌性8 只, 体重1.8 ～2.4 kg, 由北京市动物管理委员会实验中心提供。试剂: 甲苯-2,4- 二异氰酸酯(toluene-2,4-diisocyanate, TDI) 溶液, 上海化学试剂站中心化工厂产品,用橄榄油将其配成浓度为10% 溶液作为致敏剂。辣椒辣素(Sigma，美国), 用70% 酒精配制成3.3 mmol/L,再用蒸馏水稀释成终浓度为0.656 μmol/L的溶液用于治疗。无辣椒辣素载体液为1.4%酒精, 用于对照组与正常组治疗。免疫组织化学药盒为链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组织化学染色试剂盒(Zymed, 美国, 购于福州迈新生物技术开展公司)。P 物质标准品作为阳性对照。
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二、动物分组及致敏方法
22只兔分为3组, 实验组6 只, 对照组8 只, 正常组8只。致敏方法参照文献[2]。 实验组与对照组用10% TDI 溶液滴入兔鼻腔致敏鼻粘膜, 正常组用生理盐水代替10% TDI滴鼻。方法:每侧0.5 ml,每天1次, 连续7 d, 然后每2天1次, 共4 次。致敏时间共15 d。
三、辣椒辣素治疗
实验组于致敏结束后第2天开始，以辣椒辣素滴入双侧鼻腔进行治疗。每侧0.1 ml, 每天1次, 连续15 d(共15次) 。对照组与正常组均给予等量1.4%酒精滴鼻, 方法同实验组。治疗期间实验组与对照组均每2天给予10%TDI 0.5 ml激发1次，以观察症状和体征。
四、症状和体征观察
治疗期间每次激发后观察动物30 min, 内容包括鼻分泌量, 喷嚏数目，抓痒，鼻粘膜色泽，下鼻甲肿胀及鼻腔通气情况。鼻分泌物采用滤纸法收集[3], 滤纸条40 mm×5 mm，称重后将滤纸条放入鼻腔30 min 后取出称重, 计算鼻分泌量(mg)。对鼻分泌量和喷嚏次数进行统计学处理，采用组间t检验。
, 百拇医药
五、组织病理学检查
于末次治疗后第2天，经兔左耳浅静脉注入2 ml 空气, 将其处死。立即取双侧鼻甲粘膜置于10% 福尔马林液(pH 6.0)中固定, 常规脱水, 石蜡包埋、切片(5 μm)、HE染色, 光镜检查。
六、P物质免疫组织化学检查
动物处死后，即刻取鼻甲组织标本，用10% 福尔马林液固定1 h, 然后做石蜡切片(5 μm)，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连结法(streptavidin peroxidase conjugataed method, SP 方法)，行免疫组化染色[4] 。组织标本与第一抗体兔P 物质抗血清孵育，依次与生物素标记第二抗体及链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结后显影，置于显微镜下观察，苏木素复染，中性树胶封固及拍照。 P 物质免疫反应(substance P immunoreactive,SP-IR)纤维显示为索条状、网状，散在或集束存在于鼻粘膜固有层内，染色呈淡黑色或黑色。操作程序见S-P免疫组织化学试剂盒说明书。
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结果
一、 症状和体征观察
TDI 致敏后, 实验组与对照组所有动物均出现典型变应性鼻炎症状和体征。如鼻分泌量明显增加, 多为清涕, 喷嚏及抓痒次数增加, 鼻粘膜苍白, 下鼻甲肿胀, 通气受阻。实验组经辣椒辣素处理后, 鼻分泌量、喷嚏次数逐渐减少, 至第15天接近正常；鼻粘膜颜色淡红, 鼻甲肿胀减轻及通气好转。而对照组症状无明显改变, 仍见鼻粘膜苍白及下鼻甲肿胀。治疗第15天,鼻分泌量及喷嚏次数经统计学处理后，实验组与对照组对比差异有显著性(t值分别为7.82和4.18，P<0.01) 而实验组与正常组对比差异无显著性(P>0.05)(图1,2)。
图1 辣椒辣素对变应性鼻炎兔模型鼻分泌物的治疗效果(
±s，表2同)
, 百拇医药
图2 辣椒辣素对变应性鼻炎兔模型喷嚏的治疗效果
二、 组织病理学改变
对照组鼻粘膜水肿，血管扩张，固有层内可见散在或灶状以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润 ；实验组经辣椒辣素处理后,粘膜上皮完整, 固有层内见有极少量、散在的炎性细胞浸润；正常组兔鼻粘膜下未见炎性细胞浸润(图3)。
图3 辣椒辣素治疗前后鼻粘膜组织病理学改变。a 对照组鼻粘膜可见粘膜下炎症细胞浸润(E),粘膜上皮脱落；b 实验组粘膜上皮无剥脱，炎症细胞减少(E)；c 正常组鼻粘膜细胞上皮排列整齐，未见炎症细胞浸润。HE ×200
, 百拇医药
三、 免疫组织化学检查
经免疫组织化学染色发现正常组鼻粘膜可见有少量SP-IR纤维散在分布于上皮与细胞间。对照组鼻粘膜SP-IR 纤维密度及数量增加,染色加深。处理后SP-IR 纤维较对照组明显减少(图4)。
图4 辣椒辣素治疗前后鼻粘膜SP神经纤维变化。a 正常组鼻粘膜中见 SP神经纤维散在分布于鼻粘膜上皮及细胞间，SP神经纤维呈条索状、淡黑色(IR)；b对照组鼻粘膜SP神经纤维密度及数量增加，呈集束状、网状存在于粘膜上皮下，染色加重(IR)；c 实验组SP神经纤维明显减少。SP 染色×200
, 百拇医药 讨论
变应性鼻炎发病机理与感觉神经中无髓C 型感觉神经传入纤维的高敏感性有关, 变应原物质进入鼻腔后剌激鼻粘膜引起感觉神经末梢大量释放神经递质如P 物质、血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide, VIP)及降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, cGRP)等, 从而导致血浆蛋白渗出, 而且腺体分泌增加形成神经原性炎症并诱发喷嚏反应[5]。
本研究结果表明辣椒辣素具有明显抑制或消除变应性鼻炎临床表现的作用, 使鼻分泌量和喷嚏次数明显减少, 各种症状明显减轻。组织病理学显示，经辣椒辣素处理后, 炎性细胞明显减少, 粘膜结构恢复正常，SP-IR纤维密度和数量减少，表明辣椒辣素通过抑制感觉神经超敏性，而使过强的免疫反应恢复至基本正常状态[6]。研究表明,SP-IR纤维在变应性鼻炎发病机理中具有重要作用, 而辣椒辣素确有消除SP-IR 纤维的作用[2]。其作用机理为耗竭感觉神经末梢释放的神经肽物质(如SP),引起感觉神经的电生理及生化变化, 使感觉神经敏感性下降，尤其是重复使用或大剂量使用时效果更为明显[7]。作用机理的研究还表明，辣椒辣素耗竭作用与治疗作用相关，耗竭作用明显，治疗作用也明显。因此采用辣椒辣素治疗可以使SP-IR纤维大量或明显减少，通过降低感觉神经敏感性, 缓解并消除变应性鼻炎的炎症反应。从而达到治疗效果。
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志谢 解放军总医院耳鼻咽喉科姜泗长、杨伟炎、王荣光教授给予指导与帮助!解放军军事医学科学院病理研究室王德文教授对病理研究方面给予指导与帮助
参考文献
1 Lundblad L，Brodin E，Lundberg JM，et al. Effects of nasal capsaicin pretreatment and cryosurgery on sneezing reflexes neurogenic plasma extravasation sensory and sympathetic neurons. Acta Otolaryngol，1985, 100:117-127.
2 Kitajiri M，Kubo N，Ikeda H,et al. Effects of topical capsaicin on autonomic nerves in experimentally-induced nasal hypersensitivity. An immunocytochemical study. Acta Otolaryngol Suppl, 1993,500:88-91.
, http://www.100md.com
3 Knowles GK,Townsend P,Turner-Warwick M.A standardized filter paper technique for assessing nasal secretory activity. Clin Allergy，1981,11:287-292.
4 施作榕.链霉菌亲生物素蛋白-生物素酶标免疫组化染色的初步研究.中国免疫学杂志,1986,2:169-171.
5 赵长青,陶正德.神经肽在常年性鼻炎发病作用.国外医学耳鼻喉科学分册，1994,18:85-88.
6 Norlander T, Bolger WE，Stierna P，et al. A comparison of morphological effects on the rabbit nasal and sinus mucosa after surgical denervation and topical capsaicin application. Eur Arch Otorhinolaryngol，1996，253:205-213.
7 Lundblad L. Protective reflexes and vascular effects in the nasal mucosa elicited by activation of capsaicin-sensitive substance P-immunoreactive trigeminal neurons. Acta Physiol Scand Supp1，1984,529:1-42.
(收稿：1998-09-15 修回：1999-04-30), 百拇医药
单位：100081 北京 解放军466 医院(张范英)；北京市耳鼻咽喉研究所(韩德民，诸小侬，王鸿)；北京市北新桥医院(黄美珠)；解放军301 医院(张笑明)
关键词：辣椒辣素；；免疫组织化学；；病理学；；P物质；；鼻炎；变应性；常年性
中华耳鼻烟喉科杂志990411 摘要 目的 明确辣椒辣素(capsaicin)对实验性变应性鼻炎的治疗作用。方法 采用甲苯-2，4-二异氰酸酯(toluene-2，4-diisocyanate,TDI) 致敏新西兰兔制作变应性鼻炎动物模型, 观察给予辣椒辣素处理前后症状和体征的变化，同时应用组织病理学和免疫组织化学方法观察鼻粘膜的改变。结果 应用辣椒辣素处理后, 症状和体征明显改善。免疫组织化学表明，辣椒辣素处理后P 物质免疫反应 (substance P immunoreactive,SP-IR) 纤维减少, 而对照组中明显增加。HE 染色显示辣椒辣素处理后，鼻粘膜未见水肿及炎性细胞浸润, 对照组均为鼻粘膜水肿、血管扩张及炎细胞浸润。结论 辣椒辣素能缓解流涕及喷嚏, 减少SP-IR纤维密度和数量, 而达到治疗变应性鼻炎的目的。
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Immunohistochemical and pathological study of capsaicin in the treatment of rabbit animal model with allergic rhinitis
ZHANG Fanying*, HAN Demin, ZHU Xiaonong,et al
.*PLA 466 Hospital,Beijing 100081
Abstract Objective To determine the desensitization effect of capsaicin. Methods Toluene-2,4-diisocyanate(TDI) sensitized white rabbits used as animal models of allergic rhinitis were treated with capsaicin. At the end of treatment, the changes in the nasal mucosa were studied by immunohistochemical and pathological methods. Results Our results showed that the symptoms of allergic rhinitis were remarkably relieved after capsaicin treatment. Immunohistochemical study revealed that substance P immunoreactive fibers in the nasal mucosa showed a marked decrease after capasicin application, but the density and number of SP-IR fibers were significantly increased in the control group. Hematoxylin and eosin staining demonstrated that no edema was found in the nasal mucosa and small vessels were normal after capsaicin application,but edema ,vasodilation and inflammatory cell infiltration were discovered in the control group. Conclusion The results suggested that local capsaicin treatment was a selective, and non-traumatic method to induce a long lasting desensitization of the nasal mucosa, to alleviate nasal congestion, rhinorrhea and sneezing, and to reduce the sensory neuron sensitivity of the mucosa.
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Key words Capsaicin Immunohistochemistry Pathology Substance P Rhinitis, allergic, perennial
近年来发现，辣椒辣素(capsaicin) 对无髓C 型感觉神经传入纤维的作用具有选择性, 通过耗竭其末端释放的递质P物质(substance P, SP)和减低感觉神经敏感性，而发挥治疗作用。辣椒辣素能显著地缓解或消除致敏动物鼻粘膜变应性反应[1]。本研究采用辣椒辣素处理致敏动物模型鼻粘膜, 用组织病理学及免疫组织化学方法研究辣椒辣素对实验性变应性鼻炎的治疗作用。
材料及方法
一、 动物及试剂配制
新西兰兔22只, 雄性14只, 雌性8 只, 体重1.8 ～2.4 kg, 由北京市动物管理委员会实验中心提供。试剂: 甲苯-2,4- 二异氰酸酯(toluene-2,4-diisocyanate, TDI) 溶液, 上海化学试剂站中心化工厂产品,用橄榄油将其配成浓度为10% 溶液作为致敏剂。辣椒辣素(Sigma，美国), 用70% 酒精配制成3.3 mmol/L,再用蒸馏水稀释成终浓度为0.656 μmol/L的溶液用于治疗。无辣椒辣素载体液为1.4%酒精, 用于对照组与正常组治疗。免疫组织化学药盒为链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组织化学染色试剂盒(Zymed, 美国, 购于福州迈新生物技术开展公司)。P 物质标准品作为阳性对照。
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二、动物分组及致敏方法
22只兔分为3组, 实验组6 只, 对照组8 只, 正常组8只。致敏方法参照文献[2]。 实验组与对照组用10% TDI 溶液滴入兔鼻腔致敏鼻粘膜, 正常组用生理盐水代替10% TDI滴鼻。方法:每侧0.5 ml,每天1次, 连续7 d, 然后每2天1次, 共4 次。致敏时间共15 d。
三、辣椒辣素治疗
实验组于致敏结束后第2天开始，以辣椒辣素滴入双侧鼻腔进行治疗。每侧0.1 ml, 每天1次, 连续15 d(共15次) 。对照组与正常组均给予等量1.4%酒精滴鼻, 方法同实验组。治疗期间实验组与对照组均每2天给予10%TDI 0.5 ml激发1次，以观察症状和体征。
四、症状和体征观察
治疗期间每次激发后观察动物30 min, 内容包括鼻分泌量, 喷嚏数目，抓痒，鼻粘膜色泽，下鼻甲肿胀及鼻腔通气情况。鼻分泌物采用滤纸法收集[3], 滤纸条40 mm×5 mm，称重后将滤纸条放入鼻腔30 min 后取出称重, 计算鼻分泌量(mg)。对鼻分泌量和喷嚏次数进行统计学处理，采用组间t检验。
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五、组织病理学检查
于末次治疗后第2天，经兔左耳浅静脉注入2 ml 空气, 将其处死。立即取双侧鼻甲粘膜置于10% 福尔马林液(pH 6.0)中固定, 常规脱水, 石蜡包埋、切片(5 μm)、HE染色, 光镜检查。
六、P物质免疫组织化学检查
动物处死后，即刻取鼻甲组织标本，用10% 福尔马林液固定1 h, 然后做石蜡切片(5 μm)，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连结法(streptavidin peroxidase conjugataed method, SP 方法)，行免疫组化染色[4] 。组织标本与第一抗体兔P 物质抗血清孵育，依次与生物素标记第二抗体及链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结后显影，置于显微镜下观察，苏木素复染，中性树胶封固及拍照。 P 物质免疫反应(substance P immunoreactive,SP-IR)纤维显示为索条状、网状，散在或集束存在于鼻粘膜固有层内，染色呈淡黑色或黑色。操作程序见S-P免疫组织化学试剂盒说明书。
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结果
一、 症状和体征观察
TDI 致敏后, 实验组与对照组所有动物均出现典型变应性鼻炎症状和体征。如鼻分泌量明显增加, 多为清涕, 喷嚏及抓痒次数增加, 鼻粘膜苍白, 下鼻甲肿胀, 通气受阻。实验组经辣椒辣素处理后, 鼻分泌量、喷嚏次数逐渐减少, 至第15天接近正常；鼻粘膜颜色淡红, 鼻甲肿胀减轻及通气好转。而对照组症状无明显改变, 仍见鼻粘膜苍白及下鼻甲肿胀。治疗第15天,鼻分泌量及喷嚏次数经统计学处理后，实验组与对照组对比差异有显著性(t值分别为7.82和4.18，P<0.01) 而实验组与正常组对比差异无显著性(P>0.05)(图1,2)。
图1 辣椒辣素对变应性鼻炎兔模型鼻分泌物的治疗效果(
±s，表2同), 百拇医药
图2 辣椒辣素对变应性鼻炎兔模型喷嚏的治疗效果
二、 组织病理学改变
对照组鼻粘膜水肿，血管扩张，固有层内可见散在或灶状以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润 ；实验组经辣椒辣素处理后,粘膜上皮完整, 固有层内见有极少量、散在的炎性细胞浸润；正常组兔鼻粘膜下未见炎性细胞浸润(图3)。
图3 辣椒辣素治疗前后鼻粘膜组织病理学改变。a 对照组鼻粘膜可见粘膜下炎症细胞浸润(E),粘膜上皮脱落；b 实验组粘膜上皮无剥脱，炎症细胞减少(E)；c 正常组鼻粘膜细胞上皮排列整齐，未见炎症细胞浸润。HE ×200
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三、 免疫组织化学检查
经免疫组织化学染色发现正常组鼻粘膜可见有少量SP-IR纤维散在分布于上皮与细胞间。对照组鼻粘膜SP-IR 纤维密度及数量增加,染色加深。处理后SP-IR 纤维较对照组明显减少(图4)。
图4 辣椒辣素治疗前后鼻粘膜SP神经纤维变化。a 正常组鼻粘膜中见 SP神经纤维散在分布于鼻粘膜上皮及细胞间，SP神经纤维呈条索状、淡黑色(IR)；b对照组鼻粘膜SP神经纤维密度及数量增加，呈集束状、网状存在于粘膜上皮下，染色加重(IR)；c 实验组SP神经纤维明显减少。SP 染色×200
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变应性鼻炎发病机理与感觉神经中无髓C 型感觉神经传入纤维的高敏感性有关, 变应原物质进入鼻腔后剌激鼻粘膜引起感觉神经末梢大量释放神经递质如P 物质、血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide, VIP)及降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, cGRP)等, 从而导致血浆蛋白渗出, 而且腺体分泌增加形成神经原性炎症并诱发喷嚏反应[5]。
本研究结果表明辣椒辣素具有明显抑制或消除变应性鼻炎临床表现的作用, 使鼻分泌量和喷嚏次数明显减少, 各种症状明显减轻。组织病理学显示，经辣椒辣素处理后, 炎性细胞明显减少, 粘膜结构恢复正常，SP-IR纤维密度和数量减少，表明辣椒辣素通过抑制感觉神经超敏性，而使过强的免疫反应恢复至基本正常状态[6]。研究表明,SP-IR纤维在变应性鼻炎发病机理中具有重要作用, 而辣椒辣素确有消除SP-IR 纤维的作用[2]。其作用机理为耗竭感觉神经末梢释放的神经肽物质(如SP),引起感觉神经的电生理及生化变化, 使感觉神经敏感性下降，尤其是重复使用或大剂量使用时效果更为明显[7]。作用机理的研究还表明，辣椒辣素耗竭作用与治疗作用相关，耗竭作用明显，治疗作用也明显。因此采用辣椒辣素治疗可以使SP-IR纤维大量或明显减少，通过降低感觉神经敏感性, 缓解并消除变应性鼻炎的炎症反应。从而达到治疗效果。
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参考文献
1 Lundblad L，Brodin E，Lundberg JM，et al. Effects of nasal capsaicin pretreatment and cryosurgery on sneezing reflexes neurogenic plasma extravasation sensory and sympathetic neurons. Acta Otolaryngol，1985, 100:117-127.
2 Kitajiri M，Kubo N，Ikeda H,et al. Effects of topical capsaicin on autonomic nerves in experimentally-induced nasal hypersensitivity. An immunocytochemical study. Acta Otolaryngol Suppl, 1993,500:88-91.
, http://www.100md.com
3 Knowles GK,Townsend P,Turner-Warwick M.A standardized filter paper technique for assessing nasal secretory activity. Clin Allergy，1981,11:287-292.
4 施作榕.链霉菌亲生物素蛋白-生物素酶标免疫组化染色的初步研究.中国免疫学杂志,1986,2:169-171.
5 赵长青,陶正德.神经肽在常年性鼻炎发病作用.国外医学耳鼻喉科学分册，1994,18:85-88.
6 Norlander T, Bolger WE，Stierna P，et al. A comparison of morphological effects on the rabbit nasal and sinus mucosa after surgical denervation and topical capsaicin application. Eur Arch Otorhinolaryngol，1996，253:205-213.
7 Lundblad L. Protective reflexes and vascular effects in the nasal mucosa elicited by activation of capsaicin-sensitive substance P-immunoreactive trigeminal neurons. Acta Physiol Scand Supp1，1984,529:1-42.
(收稿：1998-09-15 修回：1999-04-30), 百拇医药