中耳胆脂瘤中增殖细胞核抗原及Ki67和p53蛋白的表达
作者：王小路 段玉贞 谷京城 王保华
单位：王小路 谷京城(121001 辽宁省 锦州医学院附属第一医院耳鼻咽喉科)；段玉贞(沈阳市电机股份有限公司卫生所)；王保华(中国医科大学第二临床医院耳鼻咽喉科)
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000321 评价胆脂瘤上皮的增殖状态对研究胆脂瘤的生物学特征，确定其临床过程及严重程度有重要意义。研究胆脂瘤增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、Ki67和p53表达的目的是确定它们的增殖行为，探讨其发生机制。
一、材料和方法
1. 材料来源：收集中国医科大学第二临床医院病理科1988年1月～1999年10月的手术标本，其中胆脂瘤标本18个(男10例、女8例，年龄6～65岁)；正常外耳道皮肤标本6个(男4例、女2例，年龄6～55岁)。标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，制成4 μm切片。复查确认胆脂瘤诊断无误。
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2. 试剂： 抗PCNA小鼠抗人单克隆抗体(PC10)、抗Ki67小鼠抗人单克隆抗体(MIB1)、抗p53蛋白小鼠抗人单克隆抗体(Pab 1801)、过氧化物酶标记的链霉卵白素(streptavidin peroxidase, SP)试剂盒、二氨基联苯胺(diaminobenaidine hydrogen, DAB)试剂均购于北京中山生物技术有限公司。
3. 方法：免疫组化SP染色法， DAB显色。阴性对照用磷酸缓冲液(PBS)取代一抗。用已知PCNA、Ki67、p53阳性表达的肺癌组织切片作为阳性对照。
4. 结果判断：染色细胞核着棕黄色为阳性。高倍镜下(× 400)每张组织切片随机计数4个视野，每视野至少计数300个细胞，计算阳性细胞百分比，即阳性率，判定细胞增殖能力。
5. 统计分析：结果以均数±标准差(
±s)表示，统计分析用t检验。
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二、结果
阴性对照未见棕黄色的细胞核。5例正常皮肤PCNA阳性，阳性细胞存在于基底层和基底上层，平均PCNA阳性细胞率为(6.3±3.5)%。18例胆脂瘤上皮均为阳性，可在基底层、基底上层、棘层和颗粒层观察到PCNA阳性细胞，7例阳性细胞呈全层分布(图1)，平均PCNA阳性细胞率为(47.8±20.7)%，t=4.816 6，P<0.001，差异有高度显著性。
正常皮肤Ki67均阳性，阳性细胞存在于基底层，平均Ki67阳性细胞率为(2.8±1.3)%。胆脂瘤上皮中17例阳性，可在基底层和基底上层观察到Ki67阳性细胞(图2)，平均Ki67阳性细胞率为(14.4±7.9)%，t=3.565 9，P<0.01，差异有非常显著性。
正常皮肤中2例p53蛋白阳性，阳性细胞局限在基底层，平均p53细胞阳性率为(0.4±0.6)%。胆脂瘤上皮中13例阳性，p53阳性细胞分布基底层和基底上层，棘细胞层和颗粒层也散在分布(图3)，平均p53细胞阳性率为(8.3±8.1)%，t=2.2867，P<0.05，差异有显著性。
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三、讨论
PCNA是原位检测细胞增殖活性的探针，由261个氨基酸组成的酸性细胞核蛋白，不含组蛋白，其免疫反应多局限于增殖细胞的核内。PCNA参与 DNA合成和细胞增殖。我们的PCNA实验结果与Tanaka等[1]的结果基本相同，证实胆脂瘤上皮基底上层和更上层细胞，及基底层具有继续分裂的能力。可能在胆脂瘤中存在某种不正常的分化过程，导致脱离基底层的细胞仍然不成熟，保持继续增殖的能力。
抗Ki67抗体MIB1可识别细胞周期中G1后期、S期、G2期和M期表达与细胞增殖相关的人类细胞核抗原的表达。G0 和G1早期消失，Ki67抗体是一种好的评估增殖细胞数的标记方式，可以迅速地评估正常组织的生长片段和新生物的细胞数，也可用于石蜡包埋的组织切片。我们的结果与许昱等[2]的结果基本相同，可见胆脂瘤上皮的Ki67表达增加。
p53基因是近年发现的抗癌基因，p53蛋白在细胞凋亡、细胞周期控制分化、角化细胞增殖和新生物形成过程中起基础作用。正常细胞进入DNA合成以至复制需要G1后期的野生型p53蛋白暂短升高。细胞遭受DNA损伤或攻击、缺氧、热作用、营养饥饿时，诱导p53表达增强，导致细胞增殖停滞在G1期或程序细胞(programmed cell)死亡中。Shinoda等[3]的研究表明人的胆脂瘤组织的c-jun和 p53蛋白增加，提出这些蛋白对角质细胞的分化、增殖、凋亡起一定作用。
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图1 胆脂瘤上皮PCNA阳性细胞(棕黄色细胞核)存在于基底层和基底上层，也可在棘层和颗粒层观察到阳性细胞。免疫组化SP染色×400
图2 胆脂瘤上皮Ki67阳性细胞(棕黄色细胞核)存在于基底层和基底上层。免疫组化SP染色×400
图3 胆脂瘤上皮p53蛋白免疫反应阳性细胞(棕黄色细胞核)分布基底层和基底上层，且棘细胞层和颗粒层也散在分布。免疫组化SP染色×400
志谢 中国医科大学第二临床医院病理科王之章教授、吕庆杰老师、姜卫国老师、中国医科大学公共卫生学院黄文元教授给予指导
通信作者：王小路(Email: wbaohua @ mail. sy. ln. cn)
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参考文献
1，Tanaka Y，Shiwa M，Kojima H，et al. A study on epidermal proliferation ability in cholesteatoma. Larygoscope, 1998,108(4 Pt 1):537-542.
2，许昱,金康业,董卫国.Ki67和转化生长因子α在中耳胆脂瘤中的表达.中华耳鼻咽喉科杂志,1999,34:320-320.
3，Shinoda H,Huang CC.Expressions of c-jun and p53 proteins in human middle ear cholesteatoma: relationship to keratinocyte proliferation, differentiation, and programmed cell death. Laryngoscope,1995,105:1232-1237.
(收稿日期：1999-11-12), 百拇医药
单位：王小路 谷京城(121001 辽宁省 锦州医学院附属第一医院耳鼻咽喉科)；段玉贞(沈阳市电机股份有限公司卫生所)；王保华(中国医科大学第二临床医院耳鼻咽喉科)
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000321 评价胆脂瘤上皮的增殖状态对研究胆脂瘤的生物学特征，确定其临床过程及严重程度有重要意义。研究胆脂瘤增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、Ki67和p53表达的目的是确定它们的增殖行为，探讨其发生机制。
一、材料和方法
1. 材料来源：收集中国医科大学第二临床医院病理科1988年1月～1999年10月的手术标本，其中胆脂瘤标本18个(男10例、女8例，年龄6～65岁)；正常外耳道皮肤标本6个(男4例、女2例，年龄6～55岁)。标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，制成4 μm切片。复查确认胆脂瘤诊断无误。
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2. 试剂： 抗PCNA小鼠抗人单克隆抗体(PC10)、抗Ki67小鼠抗人单克隆抗体(MIB1)、抗p53蛋白小鼠抗人单克隆抗体(Pab 1801)、过氧化物酶标记的链霉卵白素(streptavidin peroxidase, SP)试剂盒、二氨基联苯胺(diaminobenaidine hydrogen, DAB)试剂均购于北京中山生物技术有限公司。
3. 方法：免疫组化SP染色法， DAB显色。阴性对照用磷酸缓冲液(PBS)取代一抗。用已知PCNA、Ki67、p53阳性表达的肺癌组织切片作为阳性对照。
4. 结果判断：染色细胞核着棕黄色为阳性。高倍镜下(× 400)每张组织切片随机计数4个视野，每视野至少计数300个细胞，计算阳性细胞百分比，即阳性率，判定细胞增殖能力。
5. 统计分析：结果以均数±标准差(
±s)表示，统计分析用t检验。, 百拇医药
二、结果
阴性对照未见棕黄色的细胞核。5例正常皮肤PCNA阳性，阳性细胞存在于基底层和基底上层，平均PCNA阳性细胞率为(6.3±3.5)%。18例胆脂瘤上皮均为阳性，可在基底层、基底上层、棘层和颗粒层观察到PCNA阳性细胞，7例阳性细胞呈全层分布(图1)，平均PCNA阳性细胞率为(47.8±20.7)%，t=4.816 6，P<0.001，差异有高度显著性。
正常皮肤Ki67均阳性，阳性细胞存在于基底层，平均Ki67阳性细胞率为(2.8±1.3)%。胆脂瘤上皮中17例阳性，可在基底层和基底上层观察到Ki67阳性细胞(图2)，平均Ki67阳性细胞率为(14.4±7.9)%，t=3.565 9，P<0.01，差异有非常显著性。
正常皮肤中2例p53蛋白阳性，阳性细胞局限在基底层，平均p53细胞阳性率为(0.4±0.6)%。胆脂瘤上皮中13例阳性，p53阳性细胞分布基底层和基底上层，棘细胞层和颗粒层也散在分布(图3)，平均p53细胞阳性率为(8.3±8.1)%，t=2.2867，P<0.05，差异有显著性。
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三、讨论
PCNA是原位检测细胞增殖活性的探针，由261个氨基酸组成的酸性细胞核蛋白，不含组蛋白，其免疫反应多局限于增殖细胞的核内。PCNA参与 DNA合成和细胞增殖。我们的PCNA实验结果与Tanaka等[1]的结果基本相同，证实胆脂瘤上皮基底上层和更上层细胞，及基底层具有继续分裂的能力。可能在胆脂瘤中存在某种不正常的分化过程，导致脱离基底层的细胞仍然不成熟，保持继续增殖的能力。
抗Ki67抗体MIB1可识别细胞周期中G1后期、S期、G2期和M期表达与细胞增殖相关的人类细胞核抗原的表达。G0 和G1早期消失，Ki67抗体是一种好的评估增殖细胞数的标记方式，可以迅速地评估正常组织的生长片段和新生物的细胞数，也可用于石蜡包埋的组织切片。我们的结果与许昱等[2]的结果基本相同，可见胆脂瘤上皮的Ki67表达增加。
p53基因是近年发现的抗癌基因，p53蛋白在细胞凋亡、细胞周期控制分化、角化细胞增殖和新生物形成过程中起基础作用。正常细胞进入DNA合成以至复制需要G1后期的野生型p53蛋白暂短升高。细胞遭受DNA损伤或攻击、缺氧、热作用、营养饥饿时，诱导p53表达增强，导致细胞增殖停滞在G1期或程序细胞(programmed cell)死亡中。Shinoda等[3]的研究表明人的胆脂瘤组织的c-jun和 p53蛋白增加，提出这些蛋白对角质细胞的分化、增殖、凋亡起一定作用。
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图1 胆脂瘤上皮PCNA阳性细胞(棕黄色细胞核)存在于基底层和基底上层，也可在棘层和颗粒层观察到阳性细胞。免疫组化SP染色×400
图2 胆脂瘤上皮Ki67阳性细胞(棕黄色细胞核)存在于基底层和基底上层。免疫组化SP染色×400
图3 胆脂瘤上皮p53蛋白免疫反应阳性细胞(棕黄色细胞核)分布基底层和基底上层，且棘细胞层和颗粒层也散在分布。免疫组化SP染色×400
志谢 中国医科大学第二临床医院病理科王之章教授、吕庆杰老师、姜卫国老师、中国医科大学公共卫生学院黄文元教授给予指导
通信作者：王小路(Email: wbaohua @ mail. sy. ln. cn)
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参考文献
1，Tanaka Y，Shiwa M，Kojima H，et al. A study on epidermal proliferation ability in cholesteatoma. Larygoscope, 1998,108(4 Pt 1):537-542.
2，许昱,金康业,董卫国.Ki67和转化生长因子α在中耳胆脂瘤中的表达.中华耳鼻咽喉科杂志,1999,34:320-320.
3，Shinoda H,Huang CC.Expressions of c-jun and p53 proteins in human middle ear cholesteatoma: relationship to keratinocyte proliferation, differentiation, and programmed cell death. Laryngoscope,1995,105:1232-1237.
(收稿日期：1999-11-12), 百拇医药