鼻咽癌基因FHIT区域的微卫星不稳定性研究
作者：邓燕飞 田芳 杨新明 谢鼎华 卢永德 邵细芸 陈主初
单位：邓燕飞 杨新明 谢鼎华 卢永德(410011 长沙湖南医科大学附属第二医院耳鼻咽喉科)；田芳 邵细芸 陈主初(湖南医科大学肿瘤研究所细胞生物研究室)
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000318 我们选取FHIT基因附近的6个微卫星多态标记，对32例鼻咽癌组织进行了(微卫星不稳定性(microsatellite instability, MI)的检测和分析。
一、 材料和方法
1. 临床资料：未经治疗的32例原发性鼻咽癌组织及其配对的外周血组织来自湖南医科大学附属第二医院。活组织检查组织被分成2份，一份送病理检查，一份立即保存于液氮中。30例低分化鳞癌，2例泡状核细胞癌，其临床分期根据1987 UICC的TNM分期法。
, 百拇医药
2. DNA 提取: 常规蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提癌组织及正常组织DNA，紫外分光光度计定量后保存备用。
3.PCR扩增: 6个微卫星多态标记由中国医学遗传学国家重点实验室(湖南医科大学)合成。25 μl 反应体系中加入基因组DNA 100 ng，10×PCR缓冲液2.5 μl, 2 mol/L dNTP 1.25 μl,上、下游引物各20 ng, Taq DNA聚合酶1U。经94 ℃30 s，57～62 ℃30 s，72 ℃40 s，28个循
环后72 ℃延伸5 min。
4.凝胶电泳和结果判定：5 μl PCR产物97 ℃变性5 min，上样于8%或10%的聚丙稀酰胺凝胶(含8 mol/L尿素)，电泳后银染，对比同时上样的肿瘤组织与相应正常外周血DNA的PCR产物电泳图谱，若前者比后者出现等位基因条带的增多、大小的改变或浓度的增加记为MI，在检测的6个微卫星位点中，如果有两个或两个以上位点表现MI，则定义为复制错误(replication errors, RER)阳性[1]。
, 百拇医药
5.统计学处理:采用χ2检验。
二、结果
65.6%(21/32)表现MI，RER阳性11例，占34.4%。D3S3631位点未检测到MI，其余5个位点平均MI频率为26.3%，MI频率较高的位点是D3S1547(33.3%)、D3S1313(32.1%)、D3S1300(34.6%)。2例泡状核细胞癌均只在一个位点表现 MI，30例低分化鳞癌中，有19例表现MI，占63.3%，其中11例为RER阳性。Ⅰ、Ⅱ期MI频率为100%(7/7)，Ⅲ、Ⅳ期为56%(14/25)，可见，MI较多出现在临床分期较早的患者中(χ2= 4.69,P<0.05)。
三、讨论
DNA不稳定性表现在DNA复制后微卫星重复次数的改变，PCR后出现扩增片段的改变，称为MI。目前已发现多个错配修复基因，其中任何一个失活均可引起MI[2]。细胞遗传学已证明鼻咽癌存在明显的非随机性染色体畸变和脆性部位，提示鼻咽癌患者染色体稳定性较差，通常认为这种不稳定性可能与其DNA修复酶系统的缺陷及脆性部位存在有关。鼻咽癌染色体畸变主要集中在1p、3p，且在3p12-21出现高频率的脆性断裂点。我们应用微卫星多态标记技术分析32例鼻咽癌的MI，结果显示65.6%的鼻咽癌存在MI，且RER阳性率为34.4%，提示MI在鼻咽癌的发病中起着较为重要的作用。我们的结果进一步表明MI较多出现在瘤期相对较早的患者中，提示在鼻咽癌发生中遗传物质早期阶段的改变表现为MI。
, http://www.100md.com
MI与鼻咽癌病理类型的关系有待扩大样本。本组MI阳性率为65.6%，且较多发生在疾病的较早阶段，因此选择高频率的微卫星位点可作为鼻咽癌易感人群筛选的一项分子标记。
本课题受国家自然科学基金资助(编号39500172)
通信作者：邓燕飞(Email:mingda@public.cs.hn.cn)
参考文献
1，Aaltonen LA, Peltomaki P, Mecklin JP, et al. Replication errors in benign and maliginant tumor from HNPCC patients. Cancer Res,1994,54:1645-1648.
2，Gurin CC, Federici MG, Kang L, et al. Causes and consequences of microsatellite instability in endometrial carcinoma.Cancer Res,1999,59:462-466.
(收稿日期：2000-01-25), 百拇医药
单位：邓燕飞 杨新明 谢鼎华 卢永德(410011 长沙湖南医科大学附属第二医院耳鼻咽喉科)；田芳 邵细芸 陈主初(湖南医科大学肿瘤研究所细胞生物研究室)
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000318 我们选取FHIT基因附近的6个微卫星多态标记，对32例鼻咽癌组织进行了(微卫星不稳定性(microsatellite instability, MI)的检测和分析。
一、 材料和方法
1. 临床资料：未经治疗的32例原发性鼻咽癌组织及其配对的外周血组织来自湖南医科大学附属第二医院。活组织检查组织被分成2份，一份送病理检查，一份立即保存于液氮中。30例低分化鳞癌，2例泡状核细胞癌，其临床分期根据1987 UICC的TNM分期法。
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2. DNA 提取: 常规蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提癌组织及正常组织DNA，紫外分光光度计定量后保存备用。
3.PCR扩增: 6个微卫星多态标记由中国医学遗传学国家重点实验室(湖南医科大学)合成。25 μl 反应体系中加入基因组DNA 100 ng，10×PCR缓冲液2.5 μl, 2 mol/L dNTP 1.25 μl,上、下游引物各20 ng, Taq DNA聚合酶1U。经94 ℃30 s，57～62 ℃30 s，72 ℃40 s，28个循
环后72 ℃延伸5 min。
4.凝胶电泳和结果判定：5 μl PCR产物97 ℃变性5 min，上样于8%或10%的聚丙稀酰胺凝胶(含8 mol/L尿素)，电泳后银染，对比同时上样的肿瘤组织与相应正常外周血DNA的PCR产物电泳图谱，若前者比后者出现等位基因条带的增多、大小的改变或浓度的增加记为MI，在检测的6个微卫星位点中，如果有两个或两个以上位点表现MI，则定义为复制错误(replication errors, RER)阳性[1]。
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5.统计学处理:采用χ2检验。
二、结果
65.6%(21/32)表现MI，RER阳性11例，占34.4%。D3S3631位点未检测到MI，其余5个位点平均MI频率为26.3%，MI频率较高的位点是D3S1547(33.3%)、D3S1313(32.1%)、D3S1300(34.6%)。2例泡状核细胞癌均只在一个位点表现 MI，30例低分化鳞癌中，有19例表现MI，占63.3%，其中11例为RER阳性。Ⅰ、Ⅱ期MI频率为100%(7/7)，Ⅲ、Ⅳ期为56%(14/25)，可见，MI较多出现在临床分期较早的患者中(χ2= 4.69,P<0.05)。
三、讨论
DNA不稳定性表现在DNA复制后微卫星重复次数的改变，PCR后出现扩增片段的改变，称为MI。目前已发现多个错配修复基因，其中任何一个失活均可引起MI[2]。细胞遗传学已证明鼻咽癌存在明显的非随机性染色体畸变和脆性部位，提示鼻咽癌患者染色体稳定性较差，通常认为这种不稳定性可能与其DNA修复酶系统的缺陷及脆性部位存在有关。鼻咽癌染色体畸变主要集中在1p、3p，且在3p12-21出现高频率的脆性断裂点。我们应用微卫星多态标记技术分析32例鼻咽癌的MI，结果显示65.6%的鼻咽癌存在MI，且RER阳性率为34.4%，提示MI在鼻咽癌的发病中起着较为重要的作用。我们的结果进一步表明MI较多出现在瘤期相对较早的患者中，提示在鼻咽癌发生中遗传物质早期阶段的改变表现为MI。
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MI与鼻咽癌病理类型的关系有待扩大样本。本组MI阳性率为65.6%，且较多发生在疾病的较早阶段，因此选择高频率的微卫星位点可作为鼻咽癌易感人群筛选的一项分子标记。
本课题受国家自然科学基金资助(编号39500172)
通信作者：邓燕飞(Email:mingda@public.cs.hn.cn)
参考文献
1，Aaltonen LA, Peltomaki P, Mecklin JP, et al. Replication errors in benign and maliginant tumor from HNPCC patients. Cancer Res,1994,54:1645-1648.
2，Gurin CC, Federici MG, Kang L, et al. Causes and consequences of microsatellite instability in endometrial carcinoma.Cancer Res,1999,59:462-466.
(收稿日期：2000-01-25), 百拇医药