喉癌中p16基因突变和甲基化的研究
作者：白素娟 高红 梁宏军 费声重 张学 孙开来
单位：白素娟 梁宏军(110003沈阳 中国医科大学第2临床学院耳鼻咽喉科)；高红(小儿外科四肢畸形卫生部重点实验室)；费声重(第一临床学院耳鼻咽喉科)；张学(基础医学院分子遗传室)；孙开来(基础医学院分子遗传室)
关键词：喉肿瘤；基因；p16；甲基化
中华耳鼻咽喉科杂志000415 【摘要】 目的 探讨p16基因在喉癌发生发展中的作用和在喉癌中的失活机制。方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism analysis, PCR-SSCP)银染方法和PCR甲基化敏感内切酶方法检测32例喉癌和相应癌旁组织的p16基因第1,第2外显子突变和甲基化热点区域部分内切酶位点的甲基化情况。结果 32例喉癌中p16第1第2外显子无一例发生突变;在第1外显子CfoⅠ位点有6例发生甲基化，SacⅡ位点有5例发生甲基化 ,HpaⅡ位点有4例发生甲基化,甲基化发生频率为(6/32)18.8%。在第2外显子HpaⅡ 位点有5例发生甲基化，CfoⅠ位点有6例发生甲基化，甲基化发生频率为(6/32)18.6%。结论 喉癌中p16基因的甲基化是该基因失活的重要机制之一，p16基因的失活与喉癌的发展和演进密切相关。
, 百拇医药
The study of p16 gene mutation and methylation in laryngeal squamous cell carcinoma
BAI Sujuan，GAO Hong，LIANG Hongjun
(Department of Otorhinolaryngology, The Second Clinical College, Chinese Medical University, Shenyang 110003, China)
【Abstract】 Objective To investigate the development and mechanism of the p16 gene inactivation in laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC).Methods With PCR-based methylation assay and PCR-SSCP, first and second exon mutation in p16 gene and methylation of endogenase in promoter in 32 cases of LSCC and paracancer tissue were studied. Results No mutation were found in first and second exon in the samples; methylation of CfoⅠwere detected in 6 cases in first exon , methylation of SacⅡ was found in 4 cases, and methylation of HpaⅡ in 4 cases. In second exon , methylation of HpaⅡ was detected in 5 cases and methylation of CfoⅠin 6 cases. Conclusion Methylation of promoter in p16 gene is one of the important mechanisms of the inactivation of the gene. The inactivation of p16 gene has a close relation with the development and progress of LSCC.
, 百拇医药
【Key words】 Laryngeal neoplasms； Gene, p16； Methylation
p16基因是 Kamb等[1]在1994年发现和定位的一种新的抑癌基因，定位于9号染色体9p21区域，在多种肿瘤中都发生失活。它以基因突变、启动子区域高甲基化和纯合性缺失的方式失活，但是他的失活方式在不同的肿瘤中各有不同，如在大肠癌中甲基化是其唯一的失活方式，而在卵巢癌则以缺失和突变形式为主。在头颈部肿瘤中p16基因的失活方式是既有缺失也有突变，同时还有启动子区域的甲基化。我们对32例喉癌组织的p16基因第1第2外显子的突变和甲基化进行了研究，现将研究结果报道如下。
材料与方法
1. 标本：喉癌标本取自我校第一和第二临床学院1993年～1994年喉癌手术切除新鲜标本，立即冻存于液氮中-70℃保存，包括癌组织和距癌组织1 cm以上的癌旁组织，经病理证实为喉鳞状细胞癌。按1987年国际UICC分期标准T1N0M0 7例，T2N0-1M0 8例, T3N0-2M0 10例，T4N0-2M0 5例; 声门型11例，声门上型18例，声门下型1例，分期、分型不明2例。
, 百拇医药
2. DNA提取和PCR扩增：按常规酚氯仿抽提法提取癌组织和癌旁组织基因组 DNA，稀释成100 mg/L 4℃保存。
根据文献[2]设计两对引物：
外显子1: 5′-AGC CTT CGG CTG ACT GGC TGG-3′, 5′-CTG GAT CGG CCT CCG ACC GTA-3′,片段长度为：122 bp。
外显子2: 5′-CTG CTT GGC GGT GAG GGGG-3′, 5′-CCT CAC CTG AGG GAC CTTC-3′ ,片段长度为：378 bp。
PCR扩增：取DNA提取液按25 μl体积进行常规扩增，条件为94℃ 3 min，然后进行循环，94℃1 min，55℃30 s，72℃ 40 s 30个循环后72℃保温1 min。
, 百拇医药
PCR-SSCP银染分析：取10 μl PCR产物,加5 μl 上样缓冲液，8%丙烯酰胺凝胶电泳，电压100 V、 电流12 A，电泳2 h，进行银染。
PCR-甲基化分析：根据文献[2]选用p16基因外显子1和2上甲基化热点区域，外显子1上限制酶切位点为1个SacⅡ,1个HpaⅡ，2个CfoⅠ位点, 外显子2上4个HpaⅡ ,和6个CfoⅠ位点，这样共选择3个内切酶检测第1和第2外显子的甲基化情况，这3种内切酶的识别序列为(* 表示内切酶识别的位点):
SacⅡ识别5′-CCGC*GG-3′ ， 3′-GG*CGCC-5′
HpaⅡ识别 5′-C*CGG-3′ ， 3′-GGC*C-5′
CfoⅠ识别 5′-GCG*C-3′ ， 3′-C*GCG-5′
, http://www.100md.com
当他们被甲基化后则不能切割此序列，而MspⅠ可识别5′-CCGG-3′, 3′-GGCC-5′，当该序列被甲基化成为Cm5CGG(m5C=5-甲基胞嘧啶) 则可切断此序列。因此用上述3种内切酶消化DNA, 用MspⅠ和非消化DNA作对照，将消化后的DNA再进行PCR扩增，如发生甲基化则可扩增出产物，否则扩增不出。为防止DNA 消化不完全和PCR 循环次数过多而出现的假阳性，每例DNA 消化2次，PCR循环次数控制在22循环次数内，同时用经MspⅠ消化DNA作对照同时进行PCR扩增，这样经PCR 扩增后再出现扩增条带的则为甲基化。
应用甲基化敏感限制性内切酶SacⅡ, HpaⅡ,CfoⅠ分别对DNA进行消化，同时用MspⅠ做对照，各种酶分别取10 U, 10×buffer 10 μl,DNA 10 μl, 37℃消化2 h，消化2次，用酚氯仿抽提法重新提取DNA, 分别用p16外显子1和2的引物重新扩增，取PCR扩增产物进行凝胶电泳,检测p16 基因是否出现甲基化。
, 百拇医药
结果
1. 32例喉癌患者 p16外显子1和2无一例发生突变(图1)。
2. 外显子1经过CfoⅠ酶切有6例喉癌组织发生甲基化，经HpaⅡ酶切后有4例发生甲基化，经SacⅡ酶切后有5例发生甲基化,甲基化发生的频率为(6/32)18.8%；外显子2经CfoⅠ酶切后发现有6例甲基化，经 HpaⅡ酶切后发现有5例发生甲基化，甲基化的频率为(6/32)18.8%(图2)。
N：癌旁组织 T：癌组织(下同)
图1 经 PCR-SSCP银染方法未发现的p16基因突变
, 百拇医药 A: 非消化的DNA
B: 经HpaⅡ消化的DNA,16T，22T为甲基化
C: 经CfoⅠ消化的 DNA,16T,22T为甲基化
D: 经MspⅠ消化的DNA
图2 部分肿瘤组织和癌旁组织经各种酶切后的情况
癌旁组织无一例发生甲基化。本组病例在1996年我们曾做过9号染色体9p21区域杂合性丢失分析[3]，在p16外显子2启动子区域发生甲基化的病例都有9p21区域的杂合性丢失，在外显子1启动子区域发生甲基化的病例仅有1例无此区域的杂合性丢失。9例p16甲基化和9p21区域杂合性丢失情况见表1。研究结果提示p16基因很可能是此区域缺失的靶基因。发生甲基化的病例仅有1例是T1N0M0，其他均为T2-4N0-2M0病例，说明p16基因的失活很可能与喉癌的进展相关。
, 百拇医药
表1 喉癌p16基因第1第2外显子甲基化
和9p21区域杂合性丢失情况 病例
外显子1
外显子2
9p21杂
合性丢失
CfoI
HpaII
SacII
CfoI
HpaII
LC1
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LC5
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讨论
自1994年Kamb等[1]将p16基因定位于染色体9p21区域后，人们发现在50%的肿瘤细胞系中都发生p16基因的失活，它的失活频率高于在人类肿瘤中失活频率很高的p53基因，因此p16基因成为肿瘤研究的又一热点基因之一。在头颈部肿瘤研究发现，在9p21区域的杂合性丢失频率高达70%[4]。我们对喉癌杂合性丢失的研究也得到同样的结果[3]，由此可以推测，在头颈部肿瘤包括喉癌9p21区域很可能存在有与肿瘤密切相关的基因。Zhang等[4]发现，在69例原发性头颈部肿瘤中仅有11例p16基因发生错义和无义突变，与9p21区域70%的杂合性丢失有很大的差距，因此认为，可能是p16基因不是该区域缺失的唯一基因，也可能是由于PCR-SSCP 检测方法不能查出所有的p16基因突变所致。
, 百拇医药
1995年Merlo等[5]的研究表明，鳞状细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈部肿瘤、黑色素瘤细胞系和原发肿瘤有20%的肿瘤是由于p16基因发生高甲基化而使基因失活。由此对基因的认识又前进了一步，从此对肿瘤中p16基因的甲基化研究成为一个新的热点问题。Gonzalez等[6]对头颈部肿瘤p16基因进行了研究，未发现p16的点突变，但却发现20%的缺失和20%的甲基化。我们在对喉癌9号染色体杂合性丢失的研究中发现，在9p21区域发生高频率的杂合性丢失，提示在此区域可能存在与喉癌密切相关的抑癌基因 ，p16恰位于此区域，为探讨p16基因是否为此区域缺失的靶基因，我们对p16基因第1、第2外显子的突变和甲基化情况进行了研究，结果也未发现突变，却发现 32例喉癌p16基因有18.8% 发生甲基化，而在第2外显子发生甲基化的病例都有9p21区域的杂合性丢失，说明p16基因是此区域缺失的基因之一。
在我们的研究中有1例病例在外显子1发生甲基化，但却没有9p21区域杂合性丢失，这有多种原因，如基因沉默，或是操作的原因等。由于没有对p16基因mRNA的表达情况和缺失情况进行研究，还不能完全说明p16在喉癌生物学行为中的作用，还有待于我们今后对p16的缺失，mRNA表达等情况进行研究。
, http://www.100md.com
基金项目：辽宁省科委博士启动基金资助项目(971002)
通信作者：白素娟(Email: baisu@pub.sy.ln.cn)
参考文献
1，Kamb A, Gruis NA, Feldhaus IW, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,2644:436-440.
2，Gonzalez-Zulueta M, Bender CHM, Yang AS, et al. Methylation of the 5′ CpG island of p16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing. Cancer Res, 1995, 55: 4531-4535.
, http://www.100md.com
3，白素娟，张学，王筠，等. 喉鳞状细胞癌组织中9号染色体的杂合性丢失分析. 中华医学遗传学杂志，1996,13:333-337.
4，Zhang SY, Andres JR, Klein-Szanto, et al. Higher frequency of alterations in the p16/CDKN2 gene in squamous cell carcinoma cell lines than in primary tumors of the head and neck. Cancer Res, 1994,54: 5050-5053.
5，Merlo A, Gabrielson E, Askin F, et al. Frequent loss of chromosome 9 in human primary nonsmall cell lung cancer. Cancer Res,1994,54:640-644.
6，Gonzalez MV, Pello MF, Lopez-Larrea C, et al. Deletion and methylation of the tumor suppressor gene p16/CDKN2 in primary head and neck squamous cell carcinoma. J Clin Pathol, 1997,50:509-521.
(收稿日期：1999-12-29), 百拇医药
单位：白素娟 梁宏军(110003沈阳 中国医科大学第2临床学院耳鼻咽喉科)；高红(小儿外科四肢畸形卫生部重点实验室)；费声重(第一临床学院耳鼻咽喉科)；张学(基础医学院分子遗传室)；孙开来(基础医学院分子遗传室)
关键词：喉肿瘤；基因；p16；甲基化
中华耳鼻咽喉科杂志000415 【摘要】 目的 探讨p16基因在喉癌发生发展中的作用和在喉癌中的失活机制。方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism analysis, PCR-SSCP)银染方法和PCR甲基化敏感内切酶方法检测32例喉癌和相应癌旁组织的p16基因第1,第2外显子突变和甲基化热点区域部分内切酶位点的甲基化情况。结果 32例喉癌中p16第1第2外显子无一例发生突变;在第1外显子CfoⅠ位点有6例发生甲基化，SacⅡ位点有5例发生甲基化 ,HpaⅡ位点有4例发生甲基化,甲基化发生频率为(6/32)18.8%。在第2外显子HpaⅡ 位点有5例发生甲基化，CfoⅠ位点有6例发生甲基化，甲基化发生频率为(6/32)18.6%。结论 喉癌中p16基因的甲基化是该基因失活的重要机制之一，p16基因的失活与喉癌的发展和演进密切相关。
, 百拇医药
The study of p16 gene mutation and methylation in laryngeal squamous cell carcinoma
BAI Sujuan，GAO Hong，LIANG Hongjun
(Department of Otorhinolaryngology, The Second Clinical College, Chinese Medical University, Shenyang 110003, China)
【Abstract】 Objective To investigate the development and mechanism of the p16 gene inactivation in laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC).Methods With PCR-based methylation assay and PCR-SSCP, first and second exon mutation in p16 gene and methylation of endogenase in promoter in 32 cases of LSCC and paracancer tissue were studied. Results No mutation were found in first and second exon in the samples; methylation of CfoⅠwere detected in 6 cases in first exon , methylation of SacⅡ was found in 4 cases, and methylation of HpaⅡ in 4 cases. In second exon , methylation of HpaⅡ was detected in 5 cases and methylation of CfoⅠin 6 cases. Conclusion Methylation of promoter in p16 gene is one of the important mechanisms of the inactivation of the gene. The inactivation of p16 gene has a close relation with the development and progress of LSCC.
, 百拇医药
【Key words】 Laryngeal neoplasms； Gene, p16； Methylation
p16基因是 Kamb等[1]在1994年发现和定位的一种新的抑癌基因，定位于9号染色体9p21区域，在多种肿瘤中都发生失活。它以基因突变、启动子区域高甲基化和纯合性缺失的方式失活，但是他的失活方式在不同的肿瘤中各有不同，如在大肠癌中甲基化是其唯一的失活方式，而在卵巢癌则以缺失和突变形式为主。在头颈部肿瘤中p16基因的失活方式是既有缺失也有突变，同时还有启动子区域的甲基化。我们对32例喉癌组织的p16基因第1第2外显子的突变和甲基化进行了研究，现将研究结果报道如下。
材料与方法
1. 标本：喉癌标本取自我校第一和第二临床学院1993年～1994年喉癌手术切除新鲜标本，立即冻存于液氮中-70℃保存，包括癌组织和距癌组织1 cm以上的癌旁组织，经病理证实为喉鳞状细胞癌。按1987年国际UICC分期标准T1N0M0 7例，T2N0-1M0 8例, T3N0-2M0 10例，T4N0-2M0 5例; 声门型11例，声门上型18例，声门下型1例，分期、分型不明2例。
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2. DNA提取和PCR扩增：按常规酚氯仿抽提法提取癌组织和癌旁组织基因组 DNA，稀释成100 mg/L 4℃保存。
根据文献[2]设计两对引物：
外显子1: 5′-AGC CTT CGG CTG ACT GGC TGG-3′, 5′-CTG GAT CGG CCT CCG ACC GTA-3′,片段长度为：122 bp。
外显子2: 5′-CTG CTT GGC GGT GAG GGGG-3′, 5′-CCT CAC CTG AGG GAC CTTC-3′ ,片段长度为：378 bp。
PCR扩增：取DNA提取液按25 μl体积进行常规扩增，条件为94℃ 3 min，然后进行循环，94℃1 min，55℃30 s，72℃ 40 s 30个循环后72℃保温1 min。
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PCR-SSCP银染分析：取10 μl PCR产物,加5 μl 上样缓冲液，8%丙烯酰胺凝胶电泳，电压100 V、 电流12 A，电泳2 h，进行银染。
PCR-甲基化分析：根据文献[2]选用p16基因外显子1和2上甲基化热点区域，外显子1上限制酶切位点为1个SacⅡ,1个HpaⅡ，2个CfoⅠ位点, 外显子2上4个HpaⅡ ,和6个CfoⅠ位点，这样共选择3个内切酶检测第1和第2外显子的甲基化情况，这3种内切酶的识别序列为(* 表示内切酶识别的位点):
SacⅡ识别5′-CCGC*GG-3′ ， 3′-GG*CGCC-5′
HpaⅡ识别 5′-C*CGG-3′ ， 3′-GGC*C-5′
CfoⅠ识别 5′-GCG*C-3′ ， 3′-C*GCG-5′
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当他们被甲基化后则不能切割此序列，而MspⅠ可识别5′-CCGG-3′, 3′-GGCC-5′，当该序列被甲基化成为Cm5CGG(m5C=5-甲基胞嘧啶) 则可切断此序列。因此用上述3种内切酶消化DNA, 用MspⅠ和非消化DNA作对照，将消化后的DNA再进行PCR扩增，如发生甲基化则可扩增出产物，否则扩增不出。为防止DNA 消化不完全和PCR 循环次数过多而出现的假阳性，每例DNA 消化2次，PCR循环次数控制在22循环次数内，同时用经MspⅠ消化DNA作对照同时进行PCR扩增，这样经PCR 扩增后再出现扩增条带的则为甲基化。
应用甲基化敏感限制性内切酶SacⅡ, HpaⅡ,CfoⅠ分别对DNA进行消化，同时用MspⅠ做对照，各种酶分别取10 U, 10×buffer 10 μl,DNA 10 μl, 37℃消化2 h，消化2次，用酚氯仿抽提法重新提取DNA, 分别用p16外显子1和2的引物重新扩增，取PCR扩增产物进行凝胶电泳,检测p16 基因是否出现甲基化。
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结果
1. 32例喉癌患者 p16外显子1和2无一例发生突变(图1)。
2. 外显子1经过CfoⅠ酶切有6例喉癌组织发生甲基化，经HpaⅡ酶切后有4例发生甲基化，经SacⅡ酶切后有5例发生甲基化,甲基化发生的频率为(6/32)18.8%；外显子2经CfoⅠ酶切后发现有6例甲基化，经 HpaⅡ酶切后发现有5例发生甲基化，甲基化的频率为(6/32)18.8%(图2)。
N：癌旁组织 T：癌组织(下同)
图1 经 PCR-SSCP银染方法未发现的p16基因突变
, 百拇医药 A: 非消化的DNA
B: 经HpaⅡ消化的DNA,16T，22T为甲基化
C: 经CfoⅠ消化的 DNA,16T,22T为甲基化
D: 经MspⅠ消化的DNA
图2 部分肿瘤组织和癌旁组织经各种酶切后的情况
癌旁组织无一例发生甲基化。本组病例在1996年我们曾做过9号染色体9p21区域杂合性丢失分析[3]，在p16外显子2启动子区域发生甲基化的病例都有9p21区域的杂合性丢失，在外显子1启动子区域发生甲基化的病例仅有1例无此区域的杂合性丢失。9例p16甲基化和9p21区域杂合性丢失情况见表1。研究结果提示p16基因很可能是此区域缺失的靶基因。发生甲基化的病例仅有1例是T1N0M0，其他均为T2-4N0-2M0病例，说明p16基因的失活很可能与喉癌的进展相关。
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表1 喉癌p16基因第1第2外显子甲基化
和9p21区域杂合性丢失情况 病例
外显子1
外显子2
9p21杂
合性丢失
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自1994年Kamb等[1]将p16基因定位于染色体9p21区域后，人们发现在50%的肿瘤细胞系中都发生p16基因的失活，它的失活频率高于在人类肿瘤中失活频率很高的p53基因，因此p16基因成为肿瘤研究的又一热点基因之一。在头颈部肿瘤研究发现，在9p21区域的杂合性丢失频率高达70%[4]。我们对喉癌杂合性丢失的研究也得到同样的结果[3]，由此可以推测，在头颈部肿瘤包括喉癌9p21区域很可能存在有与肿瘤密切相关的基因。Zhang等[4]发现，在69例原发性头颈部肿瘤中仅有11例p16基因发生错义和无义突变，与9p21区域70%的杂合性丢失有很大的差距，因此认为，可能是p16基因不是该区域缺失的唯一基因，也可能是由于PCR-SSCP 检测方法不能查出所有的p16基因突变所致。
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1995年Merlo等[5]的研究表明，鳞状细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈部肿瘤、黑色素瘤细胞系和原发肿瘤有20%的肿瘤是由于p16基因发生高甲基化而使基因失活。由此对基因的认识又前进了一步，从此对肿瘤中p16基因的甲基化研究成为一个新的热点问题。Gonzalez等[6]对头颈部肿瘤p16基因进行了研究，未发现p16的点突变，但却发现20%的缺失和20%的甲基化。我们在对喉癌9号染色体杂合性丢失的研究中发现，在9p21区域发生高频率的杂合性丢失，提示在此区域可能存在与喉癌密切相关的抑癌基因 ，p16恰位于此区域，为探讨p16基因是否为此区域缺失的靶基因，我们对p16基因第1、第2外显子的突变和甲基化情况进行了研究，结果也未发现突变，却发现 32例喉癌p16基因有18.8% 发生甲基化，而在第2外显子发生甲基化的病例都有9p21区域的杂合性丢失，说明p16基因是此区域缺失的基因之一。
在我们的研究中有1例病例在外显子1发生甲基化，但却没有9p21区域杂合性丢失，这有多种原因，如基因沉默，或是操作的原因等。由于没有对p16基因mRNA的表达情况和缺失情况进行研究，还不能完全说明p16在喉癌生物学行为中的作用，还有待于我们今后对p16的缺失，mRNA表达等情况进行研究。
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基金项目：辽宁省科委博士启动基金资助项目(971002)
通信作者：白素娟(Email: baisu@pub.sy.ln.cn)
参考文献
1，Kamb A, Gruis NA, Feldhaus IW, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,2644:436-440.
2，Gonzalez-Zulueta M, Bender CHM, Yang AS, et al. Methylation of the 5′ CpG island of p16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing. Cancer Res, 1995, 55: 4531-4535.
, http://www.100md.com
3，白素娟，张学，王筠，等. 喉鳞状细胞癌组织中9号染色体的杂合性丢失分析. 中华医学遗传学杂志，1996,13:333-337.
4，Zhang SY, Andres JR, Klein-Szanto, et al. Higher frequency of alterations in the p16/CDKN2 gene in squamous cell carcinoma cell lines than in primary tumors of the head and neck. Cancer Res, 1994,54: 5050-5053.
5，Merlo A, Gabrielson E, Askin F, et al. Frequent loss of chromosome 9 in human primary nonsmall cell lung cancer. Cancer Res,1994,54:640-644.
6，Gonzalez MV, Pello MF, Lopez-Larrea C, et al. Deletion and methylation of the tumor suppressor gene p16/CDKN2 in primary head and neck squamous cell carcinoma. J Clin Pathol, 1997,50:509-521.
(收稿日期：1999-12-29), 百拇医药