鼻息肉组织中T-细胞亚群的分布及2种白细胞介素表达的初步研究
作者：袁晓培 于德林 虞有智
单位：袁晓培 于德林(100044 北京 北京大学人民医院耳鼻咽喉科)；虞有智(100044 北京 北京大学人民医院病理科)
关键词：鼻息肉；细胞活素类；T淋巴细胞；免疫组织化学
中华耳鼻咽喉科杂志000512
【摘要】 目的 探讨T-淋巴细胞及细胞因子白细胞介素(interleukin, IL)调节功能的紊乱在鼻息肉发病中的重要作用。方法 应用免疫组织化学的方法检测32例鼻息肉标本和6例下鼻甲粘膜对照标本中T-细胞亚群(CD4+和CD8+细胞)以及细胞因子IL-5、IL-10阳性细胞的表达情况。并进行统计学分析。结果 鼻息肉组织中可见各种炎细胞浸润，CD4+和CD8+细胞数增多(P<0.001)；其中CD4+细胞明显多于CD8+细胞(P<0.001)。鼻息肉组织IL-5和IL-10阳性细胞明显增多， (P<0.001)，且IL-5+细胞多于IL-10+细胞(P<0.05)。IL-5+细胞以浆细胞和淋巴细胞为主。在鼻息肉血管和腺体周围，CD4+/CD8+细胞数比值与IL-5+/IL-10+细胞数比值呈显著正相关(r=0.78，P<0.01)。结论 鼻息肉的形成与CD4+ T-淋巴细胞和细胞因子IL-5的高表达有关。以浆细胞和淋巴细胞浸润为主的鼻息肉应作为鼻息肉病理学特征的一个必要补充。细胞免疫和体液免疫紊乱以及细胞因子分布失衡在鼻息肉免疫病理中发挥着至关重要的作用。
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T-lymphocyte subsets and inflammatory cytokines of interleukin-5 and interleukin-10 expression in human nasal polyp tissue
YUAN Xiaopei YU Delin YU Youzhi
(Department of Otorhinolaryngology, People′s Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044, China)
【Abstract】 Objective To investigate the distribution of T-lymphocyte subsets (CD4+ and CD8+ cells) and the expression of IL-5 and IL-10 protein-positive cells in nasal polyps. Methods The specimens of thirty-two nasal polyps and six control subjects were studied by Immunohistochemical method to detect CD4+, CD8+, IL-5+ and IL-10+ cells. A mean numbers of positive cells per high power field (10×40) were counted. All data were analyzed with t-test and correl-test. Results There were significantly large number of CD4+ and CD8+ cells in nasal polyps (P<0.001). A significant predominance of CD4+ cells over CD8+ cells was found in the two subgroups (subepithelia, arounding glands and blood vessels) of nasal polyp (P<0.001). There were an abundant number of IL-5+、IL-10+ cells, whereas significantly difference higher concentrations than that in the controls (P<0.001) . IL-5+ cells were more than IL-10+ cells in nasal polyps (P<0.05), and most of IL-5+ cells were plasmacytes and lymphocytes . There was a significant correlation between the counts of CD4+/CD8+ and IL-5+/IL-10+ in the subgroup of nasal polyps arounding glands and blood vessels (r=0.78, P<0.01).Conclusions This study indicated that CD4+ T-lymphocytes and IL-5 high expression may play an important role in the nasal polyps . Migration of plasmacytes and lymphocytes in polyps may participate in the inflammatory reaction . The disturbance of cellular and humoral immunity and imbalance of cytokines distribution may play a crucial role in the pathogenes of nasal polyps.
, 百拇医药
【Key words】 Nasal polyps； Cytokines； T-lymphocyte； Immunohistochemistry
研究表明作为传递免疫调节信息的细胞因子在鼻息肉发病中发挥着重要作用。白细胞介素-5(interleukin-5,IL-5)为强致炎活性因子之一，IL-10为活性抗炎因子之一，应用免疫组织化学的方法检测它们在鼻息肉组织中的表达情况以及相关T-淋巴细胞亚群的分布特征，从免疫病理学角度对鼻息肉组织中是否存在免疫调节紊乱作初步研究。
材料与方法
一、标本来源及制备
32例鼻息肉标本源自我科住院手术的慢性鼻窦炎鼻息肉患者，男22例，女10例；年龄25～71岁，平均52岁。其中II型1～3期19例，III型13例[1]。所有患者均经鼻内窥镜、鼻窦CT检查以及术后病理诊断证实。6例对照组鼻粘膜标本源自我科鼻中隔偏曲行鼻中隔成型术患者的下鼻甲。2组患者均无变应性鼻炎、哮喘、阿司匹林特异反应性、支气管扩张、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病等典型病史，近期(4周内)无急性呼吸道感染及类固醇药物应用史。2组患者均用皮内试验法进行了吸入性变应原检测及血液中特异性IgE过筛检测，均为阴性。所有标本均于手术中取材，其中对照组标本为正常侧鼻粘膜, 取下标本迅速放入10%中性缓冲福尔马林液中充分固定、石蜡包埋后备检。
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二、免疫组织化学染色
1.试剂：IL-5和IL-10单克隆抗体购自美国Pharmingen公司，CD4和CD8单克隆抗体购自丹麦Dako公司，SP试剂盒购自美国Zymed公司。
2.染色方法：按照试剂盒提供的酶标记链霉素亲和生物素法(labelled streptavidin biotin, LSAB)染色步骤进行免疫组织化学染色。每例标本均同时做HE染色。
三、阳性细胞计数
组织切片于光学显微镜下观察。CD4或CD8阳性细胞呈典型深棕色胞膜表达；IL-5、IL-10阳性细胞胞浆呈棕黄染色，可出现颗粒或环形沉淀。在高倍显微镜(10×40)下，分别于上皮下和血管腺体周围各选取10个视野，进行阳性细胞计数，取平均值，为每高倍视野平均阳性细胞数。并计算出各组CD4+/CD8+细胞数和IL-5+/IL-10+细胞数比值。
, 百拇医药
四、统计学处理
应用SAS统计软件对实验组和对照组各数据进行分析，做t检验及相关性检验，计算出P值(取P<0.05为差异有显著性)和r值。
结果
一、 HE染色
鼻息肉组织上皮增生变厚，可见鳞状上皮化生，上皮下基质明显水肿，间质为疏松结缔组织，其间可见少量扩张的微血管和腺体，可见有囊状扩张的腺体。组织间有各种炎细胞浸润，其中以浆细胞和淋巴细胞浸润为主，而以嗜酸粒细胞浸润为主的约占28.1% 。对照组为假复层纤毛柱状上皮，其下为大量微血管和小腺体，也可见散在炎细胞。
二、CD4和CD8阳性细胞的分布
鼻息肉组织中可见大量CD4和适量CD8阳性细胞，特点：①其分布呈丛集性，多集中在上皮下和腺体血管周围，而在间质中则呈较均匀散在分布(图1,2)；②CD4阳性细胞数明显多于CD8阳性细胞数(P<0.001)，CD4+/CD8+细胞数比值>1(表1,2)。
, 百拇医药
表1 鼻息肉组与对照组上皮下CD4+
和CD8+细胞数比较(
±s) 组别
例数
CD4+细胞数
CD8+细胞数
CD4+/CD8+
鼻息肉组
32
, 百拇医药
50.85±32.22
29.49±18.47
1.97±0.85
对照组
6
13.08±10.62
16.22± 8.16
0.71±0.12
P值
< 0.001
< 0.001
< 0.001
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表2 鼻息肉组与对照组腺体血管周围
CD4+和CD8+细胞数比较(±s) 组别
例数
CD4+细胞数
CD8+细胞数
CD4+/CD8+
鼻息肉组
32
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37.02±21.85
21.38±10.88
1.98±1.16
对照组
6
7.02± 6.43
15.03±13.74
0.51±0.16
P值
< 0.001
< 0.001
< 0.001
, 百拇医药
对照组中亦可见CD4和CD8阳性细胞，数量较少，在上皮下，腺体血管周围和间质中较均匀散在分布(图3，4)，CD4+/CD8+细胞数比值<1。
三、IL-5和IL-10阳性表达细胞及分布
鼻息肉组织中可见到较多的IL-5和IL-10阳性细胞，特点：①阳性细胞也呈丛集性分布，多集中在上皮下和腺体血管周围，在间质中散在分布；②阳性细胞呈多样性，可见淋巴细胞、浆细胞、嗜酸粒细胞、上皮细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞多种细胞表达(图5～7)；③IL-5阳性细胞数多于IL-10阳性细胞数(P<0.05)；IL-5+/IL-10+细胞数比值>1(表3，4)； ④IL-5阳性细胞以浆细胞和淋巴细胞为主，嗜酸粒细胞只占IL-5阳性细胞的少数，约8.7%(平均值)。对照组中IL-5和IL-10阳性细胞数很少，多散在分布于间质中，细胞类型无特异性(图8，9), IL-5+/IL-10+细胞数平均值<1。表3 鼻息肉组与对照组上皮下IL-5+
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和IL-10+细胞数比较(±s) 组别
例数
IL-5+细胞数
IL-10+细胞数
IL-5+/IL-10+
鼻息肉组
32
12.94±9.71
9.28±8.05
, 百拇医药 1.67±1.01
对照组
6
2.10±1.70
3.85±2.96
0.85±0.78
P值
< 0.001
< 0.001
<0.001
表4 腺体血管周围鼻息肉组与对照组IL-5+和
IL-10+细胞数比较(±s) 组别
, 百拇医药
例数
IL-5+细胞数
IL-10+细胞数
IL-5+/IL-10+
鼻息肉组
32
12.18±6.40
8.79±6.02
1.91±1.32
对照组
6
, 百拇医药
1.27±1.19
2.35±1.84
0.50±0.10
P值
< 0.001
< 0.001
< 0.001
四、 统计结果
由于上述阳性细胞多密集分布于上皮下以及腺体血管周围，所以对以上2个区域的阳性细胞数进行统计学比较，从而判断不同区域的免疫效应是否存在差异性。
1.t检验：①鼻息肉组与对照组CD4和CD8阳性细胞数、CD4+/CD8+细胞数比值差异有显著性(P值均<0.001， 表1，2)； ②鼻息肉组上皮下和腺体、血管周围的CD4+细胞数、CD8+细胞数以及CD4+/CD8+细胞数比值差异无显著性(P值均>0.05)；③鼻息肉组与对照组IL-5+细胞数、IL-10+细胞数以及IL-5+/IL-10+细胞数比值差异有显著性(P值均<0.001，表3，4)； ④鼻息肉组上皮下和腺体血管周围IL-5+细胞数、IL-10+细胞数以及IL-5+/IL-10+细胞数比值无显著性差异(P值均>0.05)。
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2.相关性检验：①鼻息肉组中腺体和血管周围区域的CD4+/CD8+细胞数比值与IL-5+/IL-10+细胞数比值呈显著正相关(r=0.78，P<0.01)；②鼻息肉组中上皮下以及对照组上皮下和腺体、血管周围上述比值则无显著相关性(r值分别为0.19，0.25，0.47， P值均>0.05)。讨论
现在多认为慢性炎症和变态反应是鼻息肉发病的两大要素，但无论哪一种因素的作用都离不开免疫系统的参与和调节。本实验结果显示： 鼻息肉组织中的CD4阳性细胞数明显多于对照组。Larocca等[2]和Hamilos等[3]的研究中发现CD4阳性细胞增多，指出在鼻息肉免疫中，由于激活了T-辅助细胞，致使一系列细胞因子释放，最终导致鼻息肉的形成。说明在鼻息肉组织中免疫反应性呈活化和扩大状态。近年来有关鼻息肉发病中细胞因子作用的研究已证实，有多种相关的重要细胞因子在鼻息肉组织中过度表达，并且诸多实验已证实这些细胞因子是T-辅助细胞的主要产物 。例如Min等[4]研究发现，在感染性和变应性鼻炎导致的鼻息肉组织中IL-4、IL-5和INF-γ mRNA高表达；Ohno等[5]发现鼻息肉组织中可检测出GM-CSF mRNA，而在正常下鼻甲粘膜中没有；Ghaffar等[6]发现在变应性和非变应性鼻窦炎、鼻息肉上皮和上皮下IL-6 mRNA表达显著增高，而变应性和非变应性鼻窦炎、鼻息肉之间无差别。T-辅助细胞是免疫应答中的核心淋巴细胞，当鼻腔局部受到致病原的刺激，通过抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)的加工处理，使T-辅助细胞得以识别和活化，释放多种相关细胞因子，使各种炎细胞聚集、增殖和激活，发挥局部抗炎作用，但由于抗原作用的持久性，使局部炎症反应长期存在，呈慢性改变，在发挥抗炎作用的同时也造成了组织的损伤和演变，最终导致鼻息肉的形成。荷兰学者Stoop等[7]也提出上呼吸道粘膜慢性炎症在鼻息肉病因、病理中起重要作用，并指出与T-细胞亚群分布失衡有关，但是在他的研究中指出鼻息肉组织中的CD8阳性细胞明显多于CD4阳性细胞，所以抑制和降低了局部免疫反应性，改变了T-细胞介导的免疫防御过程。台湾学者Liu等[8]的实验中得出了相似的结果。本实验中CD4阳性细胞聚集于上皮下和腺体、血管周围，说明在鼻息肉上皮和腺体血管的典型病理改变过程中， T-辅助细胞发挥着同样重要的作用。
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IL-5是近年来研究比较多的细胞因子之一，它主要由抗原活化的T-辅助细胞产生，具有多种生物学活性[9]。 它对鼻息肉组织中嗜酸粒细胞浸润有重要作用。Hamilos等[10]认为IL-5在变应性鼻息肉中高表达，变应性鼻息肉和非变应性鼻息肉中嗜酸粒细胞浸润的机理不同。Bachert等[11] 提出IL-5在变应性鼻息肉和非变应性鼻息肉中均高表达，二者无显著性差异，且69.5%的IL-5阳性细胞为嗜酸粒细胞。在本实验中，鼻息肉组织中IL-5阳性细胞数明显高于对照组(P<0.001)，阳性细胞呈多样性(有浆细胞、淋巴细胞、嗜酸粒细胞、上皮细胞和血管内皮细胞等)。而以浆细胞和淋巴细胞表达为主，IL-5阳性嗜酸粒细胞只约占阳性细胞8.7%(平均值)。阳性细胞多集中在上皮下和腺体、血管周围。可见：①IL-5阳性细胞的多样性反映了IL-5在鼻息肉免疫病理中有着多重作用，体现了IL-5功能的多样性，它可以促进免疫炎性细胞的增殖活化，维持局部炎症反应；也可以促进血管内皮细胞表达血管粘附分子(vascular cell adhension molecule-1, VCAM-1)，使各种炎细胞在组织局部聚集并发挥作用；②IL-5阳性浆细胞明显增多，间接证实了IL-5对B-细胞的作用，即促进其增殖、分化，成为抗体合成及分泌细胞。同时也说明鼻息肉免疫中，局部体液免疫因素占有相当的比例，在维持局部免疫应答的同时，也造成了组织的损伤。最近复习我院鼻息肉的病理切片，发现一类嗜酸粒细胞很多；一类嗜酸粒细胞很少，而浆细胞和淋巴细胞很多，而国外则强调嗜酸细胞浸润是鼻息肉的特点。这可能由于主要致病因素不同及个体差异引起的。 所以，以浆细胞和淋巴细胞浸润为主的鼻息肉应作为鼻息肉病理学特征的一个必要补充。它可能与以嗜酸粒细胞浸润为主的鼻息肉有着不同的病理过程。
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IL-10又称细胞因子合成的抑制因子，可由CD4+ T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸粒细胞等多种细胞产生，可以抑制Th1类细胞因子(如IFN-γ、IL-2、TNF-β等)，可以抑制抗原呈递细胞表达主要组织相容性复合物Ⅱ(major histocompability complex, MHC II)分子。通过上述功能来减弱和抑制局部的免疫炎性反应，在一定程度上保护组织不受损伤。Lalani等[12]指出与哮喘患者的肺组织相比，健康肺组织内的APC不能传递抗原多肽并且与IL-10的抑制作用有关。Borish等[13]指出哮喘患者的IL-10基因表达较健康人明显下降。本组中鼻息肉组IL-10阳性细胞数校对照组明显增多(P<0.001),同时IL-5阳性细胞数又明显多于IL-10阳性细胞数(P=0.03)，IL-5/IL-10阳性细胞数平均比值大于1。由此初步推测，在鼻息肉免疫中两种免疫效应共同存在。一方面抗原刺激前炎症细胞因子高表达，使局部免疫炎性反应持续进行，一方面又同时启动了抗炎因子(IL-10)的表达或通过细胞因子网络的反馈调节，来抑制免疫反应的进行。但是在双方作用的较量下，抗炎因子不足以抑制炎症反应的进程，最终形成了鼻息肉病理的慢性、长期性和进行性的特点。
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本实验发现在鼻息肉腺体血管周围区域CD4+/CD8+细胞数比值与IL-5+/IL-10+细胞数比值呈显著正相关。这一结果间接反映了鼻息肉免疫中APC加工传递抗原多肽，T-淋巴细胞活化，分泌相关细胞因子，产生免疫病理反应这一病理过程。因此认为，鼻息肉是微环境调控失衡下的炎症反应。由于鼻腔解剖结构的异常和/或遗传特异性体质，使机体对外来抗原(细菌、病毒及变应原等)得以识别，将信息传递给T，B淋巴细胞，并使之活化，使宿主免疫反应增强。已有实验表明鼻息肉中抗原传递细胞明显多于下鼻甲和中鼻甲粘膜，鼻息肉中免疫活性B-细胞也较多[14]，本实验中CD4阳性淋巴细胞明显增多，提示这些免疫活性细胞产生各种细胞因子，通过各种细胞因子的不同功能及网络调节异常最终导致鼻息肉这一病理过程。
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图1 鼻息肉组CD4+细胞。LSAB法×200
图2 鼻息肉组CD8+细胞。LSAB法×200
图3 对照组CD4+细胞。LSAB法×200
图4 对照组CD8+细胞。LSAB法×200
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图5 鼻息肉组IL-5+细胞，大量浆细胞表达。LSAB×200
图6 鼻息肉组IL-5+细胞内皮及上皮细胞表达。LSAB法×200
图7 鼻息肉组IL-10+细胞。LSAB法×200
图8 对照组IL-5+细胞。ISAB法×200
图9 对照组IL-10+。LSAB法×200
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参考文献
1，中华医学会耳鼻咽喉科分会, 中华耳鼻咽喉科杂志编辑委员会. 慢性鼻窦炎鼻息肉临床分型分期及内窥镜鼻窦手术疗效评定标准(1997年，海口). 中华耳鼻咽喉科杂志, 1998,33:134.
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3，Hamilos DL, LeungDY, Wood R, et al. Chronic hyperplastic sinusitis: association of tissue eosinophilia with mRNA expression of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-3. J Allergy Clin Immunol, 1993, 92: 39-48.
, 百拇医药
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5，Ohno I, Lea R, Finotto S, et al. Granulocyte/macrophage colony-stimulating gene expression by eosinophils in nasal polyposis.Am J Respir Cell Mol Biol, 1991,5:505-510.
6，Ghaffar O, Lavigne F, Kamil A, et al. IL-6 expression in chronic sinusitis: colocalization of gene transcripts to osinophils, macrophages, T lymphocytes and mast cells. Otolaryngol Head Neck Surg, 1998,118:504-511.
, 百拇医药
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8，Liu CM, Shun CT, Hsu MM. Lymphocyte subset and antigen-specific IgE antibody in nasal polyps. Ann Allergy, 1994, 72: 19-24.
9，Bagley CJ, Lopez AF, Vadas MA, et al. New frontiers for IL-5. J Allergy Clin Immunol, 1997, 99: 725-728.
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, 百拇医药
11，Bachert C, Wagenmann M, Hauser U, et al. IL-5 synthesis upregulated in human nasal polyp tissue. J Allergy Clin Immunol, 1997, 99: 837-842.
12，Lalani I, Bhol K, Ahmed AR. Interleukin-10: biology, role in inflammation and autoimmunity. Ann Allergy Asthma Immunology, 1997, 79: 469-479.
13，Borish L. IL-10: evolving concepts. J Allergy Clin Immunol, 1998, 101: 293-297.
14，Shatkin JS，Delsupehe KG，Thisted RA，et al. Mucosal allergy in the absence of systemic allergy in nasal polyposis and rhinitis :a meta-analysis.Otolaryngol Head Neck Surg,1994,111:553-559.
(收稿日期：2000-04-30), 百拇医药
单位：袁晓培 于德林(100044 北京 北京大学人民医院耳鼻咽喉科)；虞有智(100044 北京 北京大学人民医院病理科)
关键词：鼻息肉；细胞活素类；T淋巴细胞；免疫组织化学
中华耳鼻咽喉科杂志000512
【摘要】 目的 探讨T-淋巴细胞及细胞因子白细胞介素(interleukin, IL)调节功能的紊乱在鼻息肉发病中的重要作用。方法 应用免疫组织化学的方法检测32例鼻息肉标本和6例下鼻甲粘膜对照标本中T-细胞亚群(CD4+和CD8+细胞)以及细胞因子IL-5、IL-10阳性细胞的表达情况。并进行统计学分析。结果 鼻息肉组织中可见各种炎细胞浸润，CD4+和CD8+细胞数增多(P<0.001)；其中CD4+细胞明显多于CD8+细胞(P<0.001)。鼻息肉组织IL-5和IL-10阳性细胞明显增多， (P<0.001)，且IL-5+细胞多于IL-10+细胞(P<0.05)。IL-5+细胞以浆细胞和淋巴细胞为主。在鼻息肉血管和腺体周围，CD4+/CD8+细胞数比值与IL-5+/IL-10+细胞数比值呈显著正相关(r=0.78，P<0.01)。结论 鼻息肉的形成与CD4+ T-淋巴细胞和细胞因子IL-5的高表达有关。以浆细胞和淋巴细胞浸润为主的鼻息肉应作为鼻息肉病理学特征的一个必要补充。细胞免疫和体液免疫紊乱以及细胞因子分布失衡在鼻息肉免疫病理中发挥着至关重要的作用。
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T-lymphocyte subsets and inflammatory cytokines of interleukin-5 and interleukin-10 expression in human nasal polyp tissue
YUAN Xiaopei YU Delin YU Youzhi
(Department of Otorhinolaryngology, People′s Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044, China)
【Abstract】 Objective To investigate the distribution of T-lymphocyte subsets (CD4+ and CD8+ cells) and the expression of IL-5 and IL-10 protein-positive cells in nasal polyps. Methods The specimens of thirty-two nasal polyps and six control subjects were studied by Immunohistochemical method to detect CD4+, CD8+, IL-5+ and IL-10+ cells. A mean numbers of positive cells per high power field (10×40) were counted. All data were analyzed with t-test and correl-test. Results There were significantly large number of CD4+ and CD8+ cells in nasal polyps (P<0.001). A significant predominance of CD4+ cells over CD8+ cells was found in the two subgroups (subepithelia, arounding glands and blood vessels) of nasal polyp (P<0.001). There were an abundant number of IL-5+、IL-10+ cells, whereas significantly difference higher concentrations than that in the controls (P<0.001) . IL-5+ cells were more than IL-10+ cells in nasal polyps (P<0.05), and most of IL-5+ cells were plasmacytes and lymphocytes . There was a significant correlation between the counts of CD4+/CD8+ and IL-5+/IL-10+ in the subgroup of nasal polyps arounding glands and blood vessels (r=0.78, P<0.01).Conclusions This study indicated that CD4+ T-lymphocytes and IL-5 high expression may play an important role in the nasal polyps . Migration of plasmacytes and lymphocytes in polyps may participate in the inflammatory reaction . The disturbance of cellular and humoral immunity and imbalance of cytokines distribution may play a crucial role in the pathogenes of nasal polyps.
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【Key words】 Nasal polyps； Cytokines； T-lymphocyte； Immunohistochemistry
研究表明作为传递免疫调节信息的细胞因子在鼻息肉发病中发挥着重要作用。白细胞介素-5(interleukin-5,IL-5)为强致炎活性因子之一，IL-10为活性抗炎因子之一，应用免疫组织化学的方法检测它们在鼻息肉组织中的表达情况以及相关T-淋巴细胞亚群的分布特征，从免疫病理学角度对鼻息肉组织中是否存在免疫调节紊乱作初步研究。
材料与方法
一、标本来源及制备
32例鼻息肉标本源自我科住院手术的慢性鼻窦炎鼻息肉患者，男22例，女10例；年龄25～71岁，平均52岁。其中II型1～3期19例，III型13例[1]。所有患者均经鼻内窥镜、鼻窦CT检查以及术后病理诊断证实。6例对照组鼻粘膜标本源自我科鼻中隔偏曲行鼻中隔成型术患者的下鼻甲。2组患者均无变应性鼻炎、哮喘、阿司匹林特异反应性、支气管扩张、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病等典型病史，近期(4周内)无急性呼吸道感染及类固醇药物应用史。2组患者均用皮内试验法进行了吸入性变应原检测及血液中特异性IgE过筛检测，均为阴性。所有标本均于手术中取材，其中对照组标本为正常侧鼻粘膜, 取下标本迅速放入10%中性缓冲福尔马林液中充分固定、石蜡包埋后备检。
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二、免疫组织化学染色
1.试剂：IL-5和IL-10单克隆抗体购自美国Pharmingen公司，CD4和CD8单克隆抗体购自丹麦Dako公司，SP试剂盒购自美国Zymed公司。
2.染色方法：按照试剂盒提供的酶标记链霉素亲和生物素法(labelled streptavidin biotin, LSAB)染色步骤进行免疫组织化学染色。每例标本均同时做HE染色。
三、阳性细胞计数
组织切片于光学显微镜下观察。CD4或CD8阳性细胞呈典型深棕色胞膜表达；IL-5、IL-10阳性细胞胞浆呈棕黄染色，可出现颗粒或环形沉淀。在高倍显微镜(10×40)下，分别于上皮下和血管腺体周围各选取10个视野，进行阳性细胞计数，取平均值，为每高倍视野平均阳性细胞数。并计算出各组CD4+/CD8+细胞数和IL-5+/IL-10+细胞数比值。
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四、统计学处理
应用SAS统计软件对实验组和对照组各数据进行分析，做t检验及相关性检验，计算出P值(取P<0.05为差异有显著性)和r值。
结果
一、 HE染色
鼻息肉组织上皮增生变厚，可见鳞状上皮化生，上皮下基质明显水肿，间质为疏松结缔组织，其间可见少量扩张的微血管和腺体，可见有囊状扩张的腺体。组织间有各种炎细胞浸润，其中以浆细胞和淋巴细胞浸润为主，而以嗜酸粒细胞浸润为主的约占28.1% 。对照组为假复层纤毛柱状上皮，其下为大量微血管和小腺体，也可见散在炎细胞。
二、CD4和CD8阳性细胞的分布
鼻息肉组织中可见大量CD4和适量CD8阳性细胞，特点：①其分布呈丛集性，多集中在上皮下和腺体血管周围，而在间质中则呈较均匀散在分布(图1,2)；②CD4阳性细胞数明显多于CD8阳性细胞数(P<0.001)，CD4+/CD8+细胞数比值>1(表1,2)。
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表1 鼻息肉组与对照组上皮下CD4+
和CD8+细胞数比较(
±s) 组别例数
CD4+细胞数
CD8+细胞数
CD4+/CD8+
鼻息肉组
32
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50.85±32.22
29.49±18.47
1.97±0.85
对照组
6
13.08±10.62
16.22± 8.16
0.71±0.12
P值
< 0.001
< 0.001
< 0.001
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表2 鼻息肉组与对照组腺体血管周围
CD4+和CD8+细胞数比较(
±s) 组别例数
CD4+细胞数
CD8+细胞数
CD4+/CD8+
鼻息肉组
32
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37.02±21.85
21.38±10.88
1.98±1.16
对照组
6
7.02± 6.43
15.03±13.74
0.51±0.16
P值
< 0.001
< 0.001
< 0.001
, 百拇医药
对照组中亦可见CD4和CD8阳性细胞，数量较少，在上皮下，腺体血管周围和间质中较均匀散在分布(图3，4)，CD4+/CD8+细胞数比值<1。
三、IL-5和IL-10阳性表达细胞及分布
鼻息肉组织中可见到较多的IL-5和IL-10阳性细胞，特点：①阳性细胞也呈丛集性分布，多集中在上皮下和腺体血管周围，在间质中散在分布；②阳性细胞呈多样性，可见淋巴细胞、浆细胞、嗜酸粒细胞、上皮细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞多种细胞表达(图5～7)；③IL-5阳性细胞数多于IL-10阳性细胞数(P<0.05)；IL-5+/IL-10+细胞数比值>1(表3，4)； ④IL-5阳性细胞以浆细胞和淋巴细胞为主，嗜酸粒细胞只占IL-5阳性细胞的少数，约8.7%(平均值)。对照组中IL-5和IL-10阳性细胞数很少，多散在分布于间质中，细胞类型无特异性(图8，9), IL-5+/IL-10+细胞数平均值<1。表3 鼻息肉组与对照组上皮下IL-5+
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和IL-10+细胞数比较(
±s) 组别例数
IL-5+细胞数
IL-10+细胞数
IL-5+/IL-10+
鼻息肉组
32
12.94±9.71
9.28±8.05
, 百拇医药 1.67±1.01
对照组
6
2.10±1.70
3.85±2.96
0.85±0.78
P值
< 0.001
< 0.001
<0.001
表4 腺体血管周围鼻息肉组与对照组IL-5+和
IL-10+细胞数比较(
±s) 组别, 百拇医药
例数
IL-5+细胞数
IL-10+细胞数
IL-5+/IL-10+
鼻息肉组
32
12.18±6.40
8.79±6.02
1.91±1.32
对照组
6
, 百拇医药
1.27±1.19
2.35±1.84
0.50±0.10
P值
< 0.001
< 0.001
< 0.001
四、 统计结果
由于上述阳性细胞多密集分布于上皮下以及腺体血管周围，所以对以上2个区域的阳性细胞数进行统计学比较，从而判断不同区域的免疫效应是否存在差异性。
1.t检验：①鼻息肉组与对照组CD4和CD8阳性细胞数、CD4+/CD8+细胞数比值差异有显著性(P值均<0.001， 表1，2)； ②鼻息肉组上皮下和腺体、血管周围的CD4+细胞数、CD8+细胞数以及CD4+/CD8+细胞数比值差异无显著性(P值均>0.05)；③鼻息肉组与对照组IL-5+细胞数、IL-10+细胞数以及IL-5+/IL-10+细胞数比值差异有显著性(P值均<0.001，表3，4)； ④鼻息肉组上皮下和腺体血管周围IL-5+细胞数、IL-10+细胞数以及IL-5+/IL-10+细胞数比值无显著性差异(P值均>0.05)。
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2.相关性检验：①鼻息肉组中腺体和血管周围区域的CD4+/CD8+细胞数比值与IL-5+/IL-10+细胞数比值呈显著正相关(r=0.78，P<0.01)；②鼻息肉组中上皮下以及对照组上皮下和腺体、血管周围上述比值则无显著相关性(r值分别为0.19，0.25，0.47， P值均>0.05)。讨论
现在多认为慢性炎症和变态反应是鼻息肉发病的两大要素，但无论哪一种因素的作用都离不开免疫系统的参与和调节。本实验结果显示： 鼻息肉组织中的CD4阳性细胞数明显多于对照组。Larocca等[2]和Hamilos等[3]的研究中发现CD4阳性细胞增多，指出在鼻息肉免疫中，由于激活了T-辅助细胞，致使一系列细胞因子释放，最终导致鼻息肉的形成。说明在鼻息肉组织中免疫反应性呈活化和扩大状态。近年来有关鼻息肉发病中细胞因子作用的研究已证实，有多种相关的重要细胞因子在鼻息肉组织中过度表达，并且诸多实验已证实这些细胞因子是T-辅助细胞的主要产物 。例如Min等[4]研究发现，在感染性和变应性鼻炎导致的鼻息肉组织中IL-4、IL-5和INF-γ mRNA高表达；Ohno等[5]发现鼻息肉组织中可检测出GM-CSF mRNA，而在正常下鼻甲粘膜中没有；Ghaffar等[6]发现在变应性和非变应性鼻窦炎、鼻息肉上皮和上皮下IL-6 mRNA表达显著增高，而变应性和非变应性鼻窦炎、鼻息肉之间无差别。T-辅助细胞是免疫应答中的核心淋巴细胞，当鼻腔局部受到致病原的刺激，通过抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)的加工处理，使T-辅助细胞得以识别和活化，释放多种相关细胞因子，使各种炎细胞聚集、增殖和激活，发挥局部抗炎作用，但由于抗原作用的持久性，使局部炎症反应长期存在，呈慢性改变，在发挥抗炎作用的同时也造成了组织的损伤和演变，最终导致鼻息肉的形成。荷兰学者Stoop等[7]也提出上呼吸道粘膜慢性炎症在鼻息肉病因、病理中起重要作用，并指出与T-细胞亚群分布失衡有关，但是在他的研究中指出鼻息肉组织中的CD8阳性细胞明显多于CD4阳性细胞，所以抑制和降低了局部免疫反应性，改变了T-细胞介导的免疫防御过程。台湾学者Liu等[8]的实验中得出了相似的结果。本实验中CD4阳性细胞聚集于上皮下和腺体、血管周围，说明在鼻息肉上皮和腺体血管的典型病理改变过程中， T-辅助细胞发挥着同样重要的作用。
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IL-5是近年来研究比较多的细胞因子之一，它主要由抗原活化的T-辅助细胞产生，具有多种生物学活性[9]。 它对鼻息肉组织中嗜酸粒细胞浸润有重要作用。Hamilos等[10]认为IL-5在变应性鼻息肉中高表达，变应性鼻息肉和非变应性鼻息肉中嗜酸粒细胞浸润的机理不同。Bachert等[11] 提出IL-5在变应性鼻息肉和非变应性鼻息肉中均高表达，二者无显著性差异，且69.5%的IL-5阳性细胞为嗜酸粒细胞。在本实验中，鼻息肉组织中IL-5阳性细胞数明显高于对照组(P<0.001)，阳性细胞呈多样性(有浆细胞、淋巴细胞、嗜酸粒细胞、上皮细胞和血管内皮细胞等)。而以浆细胞和淋巴细胞表达为主，IL-5阳性嗜酸粒细胞只约占阳性细胞8.7%(平均值)。阳性细胞多集中在上皮下和腺体、血管周围。可见：①IL-5阳性细胞的多样性反映了IL-5在鼻息肉免疫病理中有着多重作用，体现了IL-5功能的多样性，它可以促进免疫炎性细胞的增殖活化，维持局部炎症反应；也可以促进血管内皮细胞表达血管粘附分子(vascular cell adhension molecule-1, VCAM-1)，使各种炎细胞在组织局部聚集并发挥作用；②IL-5阳性浆细胞明显增多，间接证实了IL-5对B-细胞的作用，即促进其增殖、分化，成为抗体合成及分泌细胞。同时也说明鼻息肉免疫中，局部体液免疫因素占有相当的比例，在维持局部免疫应答的同时，也造成了组织的损伤。最近复习我院鼻息肉的病理切片，发现一类嗜酸粒细胞很多；一类嗜酸粒细胞很少，而浆细胞和淋巴细胞很多，而国外则强调嗜酸细胞浸润是鼻息肉的特点。这可能由于主要致病因素不同及个体差异引起的。 所以，以浆细胞和淋巴细胞浸润为主的鼻息肉应作为鼻息肉病理学特征的一个必要补充。它可能与以嗜酸粒细胞浸润为主的鼻息肉有着不同的病理过程。
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IL-10又称细胞因子合成的抑制因子，可由CD4+ T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸粒细胞等多种细胞产生，可以抑制Th1类细胞因子(如IFN-γ、IL-2、TNF-β等)，可以抑制抗原呈递细胞表达主要组织相容性复合物Ⅱ(major histocompability complex, MHC II)分子。通过上述功能来减弱和抑制局部的免疫炎性反应，在一定程度上保护组织不受损伤。Lalani等[12]指出与哮喘患者的肺组织相比，健康肺组织内的APC不能传递抗原多肽并且与IL-10的抑制作用有关。Borish等[13]指出哮喘患者的IL-10基因表达较健康人明显下降。本组中鼻息肉组IL-10阳性细胞数校对照组明显增多(P<0.001),同时IL-5阳性细胞数又明显多于IL-10阳性细胞数(P=0.03)，IL-5/IL-10阳性细胞数平均比值大于1。由此初步推测，在鼻息肉免疫中两种免疫效应共同存在。一方面抗原刺激前炎症细胞因子高表达，使局部免疫炎性反应持续进行，一方面又同时启动了抗炎因子(IL-10)的表达或通过细胞因子网络的反馈调节，来抑制免疫反应的进行。但是在双方作用的较量下，抗炎因子不足以抑制炎症反应的进程，最终形成了鼻息肉病理的慢性、长期性和进行性的特点。
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本实验发现在鼻息肉腺体血管周围区域CD4+/CD8+细胞数比值与IL-5+/IL-10+细胞数比值呈显著正相关。这一结果间接反映了鼻息肉免疫中APC加工传递抗原多肽，T-淋巴细胞活化，分泌相关细胞因子，产生免疫病理反应这一病理过程。因此认为，鼻息肉是微环境调控失衡下的炎症反应。由于鼻腔解剖结构的异常和/或遗传特异性体质，使机体对外来抗原(细菌、病毒及变应原等)得以识别，将信息传递给T，B淋巴细胞，并使之活化，使宿主免疫反应增强。已有实验表明鼻息肉中抗原传递细胞明显多于下鼻甲和中鼻甲粘膜，鼻息肉中免疫活性B-细胞也较多[14]，本实验中CD4阳性淋巴细胞明显增多，提示这些免疫活性细胞产生各种细胞因子，通过各种细胞因子的不同功能及网络调节异常最终导致鼻息肉这一病理过程。
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图1 鼻息肉组CD4+细胞。LSAB法×200
图2 鼻息肉组CD8+细胞。LSAB法×200
图3 对照组CD4+细胞。LSAB法×200
图4 对照组CD8+细胞。LSAB法×200
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图5 鼻息肉组IL-5+细胞，大量浆细胞表达。LSAB×200
图6 鼻息肉组IL-5+细胞内皮及上皮细胞表达。LSAB法×200
图7 鼻息肉组IL-10+细胞。LSAB法×200
图8 对照组IL-5+细胞。ISAB法×200
图9 对照组IL-10+。LSAB法×200
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参考文献
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(收稿日期：2000-04-30), 百拇医药