正常鼻咽上皮和鼻咽癌中FHIT基因变化的初步研究
作者：邓燕飞 田芳 卢永德 陈主初 谢鼎华 杨新明 何执鼎 邵细芸
单位：邓燕飞 卢永德 谢鼎华 杨新明(410011 长沙 湖南医科大学附属第二医院耳鼻咽喉科)；田芳 陈主初 邵细芸(湖南医科大学肿瘤所肿瘤细胞生物研究室)；何执鼎(湖南省肿瘤医院)
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000523 以往研究表明，鼻咽癌频发染色体3p14的缺失，故推测该缺失区存在与鼻咽癌发生发展密切相关的抑癌基因[1]。脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)基因是1996年由Ohta等[2]克隆的一个位于3p14.2区域的候选抑癌基因。其编码蛋白与二腺苷四磷酸(Ap4A)不对称水解酶有69%的同源性，具有Ap4A水解酶活性，主要参与细胞生长与生长抑制信号的调控[3]。我们用巢式RT-PCR及自动测序法对鼻咽癌组织和正常鼻咽上皮组织中FHIT基因的改变情况进行了研究。
, 百拇医药
一、材料与方法
1. 标本：28例鼻咽癌及11例恐癌患者的正常鼻咽上皮组织取自湖南医科大学附属第二医院和湖南省肿瘤医院。活检组织被分成两份，一份送病理检查，一份置液氮中保存。
2.总RNA提取：采用TRIzol试剂(Gibco/BRL)提取组织总RNA，紫外分光光度计定量后-70℃保存备用。
3.逆转录：取1 μg总RNA用Promega公司的Reverse Transcription System进行逆转录反应，以Oligo(dT)15为引物。
4.巢式PCR ：引物序列参照文献[2]。
5.产物检测: 取8μl第二轮PCR产物上样于1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色后紫外线灯下观察结果。
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6.回收与纯化PCR产物: 取200 μl PCR产物进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色后以聚丙烯酰胺凝胶“压碎与浸泡”法回收并纯化目的片段。
7.测序分析：按PE公司PRISM BigDye Terminator cycle sequencing kit方法用下游引物3D1在ABI 377 DNA sequencer上进行自动测序。并将所得序列在DNA Star 软件中自动反转后与FHIT基因序列对比。
二、结果
1.RT-PCR分析：鼻咽癌与正常鼻咽上皮组织的巢式RT-PCR 产物用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳EB染色后可以直接检测。11例正常鼻咽上皮组织未检测到FHIT异常转录本，28例鼻咽癌组织中有12例检出异常，占42.9%。其中9例同时出现正常大小的转录本，8例存在2个或2个以上的异常转录本，占66.7%(8/12)，且1例为插入型。
, http://www.100md.com
2.测序分析：随机取2例鼻咽癌(C2、C5)异常转录本，经纯化后进行DNA直接测序，测序结果证实存在FHIT基因外显子的缺失。C2缺失的片段长80 bp，包括外显子8全部缺失和外显子10 5′端的11个碱基。C5存在外显子4、5、6和7的全部缺失，长达389 bp，另在外显子8和9之间插入一53 bp的小片段。C2、C5缺失和插入的起止处均为外显子之间的连接部位。
三、讨论
11例正常鼻咽上皮组织未检出异常转录本，28例鼻咽癌组织发现12例异常转录本，即42.9%的转录本存在不同程度的缺失。经测序发现，1例鼻咽癌FHIT基因转录本缺失了第4～7全部外显子，且在外显子8和9之间插入一53 bp的小片段；另一例主要缺失了第8外显子，两例缺失的起止处恰好是外显子的拼接部位，与Ohta等[2]的报道一致。提示FHIT基因异常转录主要见于鼻咽癌，而不存在于正常鼻咽上皮，且由于缺失多涉及FHIT基因两个重要的结构功能区外显子5和8，从而影响FHIT蛋白功能及Ap3A水解酶活性。
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本组鼻咽癌12例异常转录本中66.7%同时出现2个或2个以上的异常转录本，说明鼻咽癌FHIT基因的缺失常涉及多个外显子，且一例为正常序列中插入DNA片段的异常转录本，比较少见。综合文献及我们的研究，FHIT异常转录本形式可分为以下5类：①外显子E4～E6缺失；②外显子E4～E8缺失；③单个外显子如E4或E8的缺失；④E4下游插入大小不等的DNA片段；⑤整个转录本的缺失。这些异常转录本的出现常异致FHIT蛋白功能的丧失，从而使细胞生长与生长的抑制信号的调控失衡，最终细胞生长控而致癌。
已有研究提示EB病毒致鼻咽癌的可能途径是将病毒的DNA整合入FRA3B区域，最后灭活FHIT基因[2]。由于目前对FHIT基因是否作为一种典型的抑癌基因在肿瘤中起作用尚存在争议，因此应进行深入研究。
资助项目：国家自然科学基金(39500172)和卫生部科研基金(96-1-131)
, 百拇医药 参考文献
1，Lo KW, Huang DP, Lee CKJ, Genetic changes in nasopharyngeal carcinoma. Chin Med J, 1997, 110:548-559.
2，Ohta M, Inoue H, Cotticelli M, et al. The FHIT gene, spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t (3;8) breakpoint, is abnormal in digestive tract cancer. Cell, 1996, 84:587-597.
3，Barnes LD, Garrison PN, Siprashvili Z, et al. FHIT, a putastive tumor suppressor in humans, is a dinucleoside 5′,5-P1，P3-triphosphate hydrolase. Biochemistry, 1996, 35:11529-11535.
(收稿日期：1999-12-15), http://www.100md.com
单位：邓燕飞 卢永德 谢鼎华 杨新明(410011 长沙 湖南医科大学附属第二医院耳鼻咽喉科)；田芳 陈主初 邵细芸(湖南医科大学肿瘤所肿瘤细胞生物研究室)；何执鼎(湖南省肿瘤医院)
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000523 以往研究表明，鼻咽癌频发染色体3p14的缺失，故推测该缺失区存在与鼻咽癌发生发展密切相关的抑癌基因[1]。脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)基因是1996年由Ohta等[2]克隆的一个位于3p14.2区域的候选抑癌基因。其编码蛋白与二腺苷四磷酸(Ap4A)不对称水解酶有69%的同源性，具有Ap4A水解酶活性，主要参与细胞生长与生长抑制信号的调控[3]。我们用巢式RT-PCR及自动测序法对鼻咽癌组织和正常鼻咽上皮组织中FHIT基因的改变情况进行了研究。
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一、材料与方法
1. 标本：28例鼻咽癌及11例恐癌患者的正常鼻咽上皮组织取自湖南医科大学附属第二医院和湖南省肿瘤医院。活检组织被分成两份，一份送病理检查，一份置液氮中保存。
2.总RNA提取：采用TRIzol试剂(Gibco/BRL)提取组织总RNA，紫外分光光度计定量后-70℃保存备用。
3.逆转录：取1 μg总RNA用Promega公司的Reverse Transcription System进行逆转录反应，以Oligo(dT)15为引物。
4.巢式PCR ：引物序列参照文献[2]。
5.产物检测: 取8μl第二轮PCR产物上样于1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色后紫外线灯下观察结果。
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6.回收与纯化PCR产物: 取200 μl PCR产物进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色后以聚丙烯酰胺凝胶“压碎与浸泡”法回收并纯化目的片段。
7.测序分析：按PE公司PRISM BigDye Terminator cycle sequencing kit方法用下游引物3D1在ABI 377 DNA sequencer上进行自动测序。并将所得序列在DNA Star 软件中自动反转后与FHIT基因序列对比。
二、结果
1.RT-PCR分析：鼻咽癌与正常鼻咽上皮组织的巢式RT-PCR 产物用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳EB染色后可以直接检测。11例正常鼻咽上皮组织未检测到FHIT异常转录本，28例鼻咽癌组织中有12例检出异常，占42.9%。其中9例同时出现正常大小的转录本，8例存在2个或2个以上的异常转录本，占66.7%(8/12)，且1例为插入型。
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2.测序分析：随机取2例鼻咽癌(C2、C5)异常转录本，经纯化后进行DNA直接测序，测序结果证实存在FHIT基因外显子的缺失。C2缺失的片段长80 bp，包括外显子8全部缺失和外显子10 5′端的11个碱基。C5存在外显子4、5、6和7的全部缺失，长达389 bp，另在外显子8和9之间插入一53 bp的小片段。C2、C5缺失和插入的起止处均为外显子之间的连接部位。
三、讨论
11例正常鼻咽上皮组织未检出异常转录本，28例鼻咽癌组织发现12例异常转录本，即42.9%的转录本存在不同程度的缺失。经测序发现，1例鼻咽癌FHIT基因转录本缺失了第4～7全部外显子，且在外显子8和9之间插入一53 bp的小片段；另一例主要缺失了第8外显子，两例缺失的起止处恰好是外显子的拼接部位，与Ohta等[2]的报道一致。提示FHIT基因异常转录主要见于鼻咽癌，而不存在于正常鼻咽上皮，且由于缺失多涉及FHIT基因两个重要的结构功能区外显子5和8，从而影响FHIT蛋白功能及Ap3A水解酶活性。
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本组鼻咽癌12例异常转录本中66.7%同时出现2个或2个以上的异常转录本，说明鼻咽癌FHIT基因的缺失常涉及多个外显子，且一例为正常序列中插入DNA片段的异常转录本，比较少见。综合文献及我们的研究，FHIT异常转录本形式可分为以下5类：①外显子E4～E6缺失；②外显子E4～E8缺失；③单个外显子如E4或E8的缺失；④E4下游插入大小不等的DNA片段；⑤整个转录本的缺失。这些异常转录本的出现常异致FHIT蛋白功能的丧失，从而使细胞生长与生长的抑制信号的调控失衡，最终细胞生长控而致癌。
已有研究提示EB病毒致鼻咽癌的可能途径是将病毒的DNA整合入FRA3B区域，最后灭活FHIT基因[2]。由于目前对FHIT基因是否作为一种典型的抑癌基因在肿瘤中起作用尚存在争议，因此应进行深入研究。
资助项目：国家自然科学基金(39500172)和卫生部科研基金(96-1-131)
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1，Lo KW, Huang DP, Lee CKJ, Genetic changes in nasopharyngeal carcinoma. Chin Med J, 1997, 110:548-559.
2，Ohta M, Inoue H, Cotticelli M, et al. The FHIT gene, spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t (3;8) breakpoint, is abnormal in digestive tract cancer. Cell, 1996, 84:587-597.
3，Barnes LD, Garrison PN, Siprashvili Z, et al. FHIT, a putastive tumor suppressor in humans, is a dinucleoside 5′,5-P1，P3-triphosphate hydrolase. Biochemistry, 1996, 35:11529-11535.
(收稿日期：1999-12-15), http://www.100md.com