大鼠嗅球中凋亡相关基因蛋白和成纤维细胞因子表达的相关性及其意义
作者：关桂梅 董震 杨占泉
单位：130031 长春 白求恩医科大学第三临床学院耳鼻咽喉-头颈外科
关键词：大鼠；嗅球；脱噬作用；嗅觉缺失
中华耳鼻咽喉科杂志000507 【摘要】 目的 明确成纤维细胞因子(fibroblast growth factor, FGF) 和凋亡相关基因Bcl-2及Bax在大鼠嗅球中的表达及相关性，并探讨老化性嗅觉障碍的机制。方法 取健康大鼠青龄组(3个月)，老龄组(24个月)各10只，断头处死，取嗅球，经石蜡包埋，连续切片，免疫组化染色，光镜观察。结果 青龄组大鼠嗅球中Bcl-2和FGF阳性细胞表达率分别为(86.40±5.22)%和(70.25±6.01)%，显著高于老龄组的(30.00±4.12)%和(24.10±4.00)%，二者呈明显正相关(x±s，P<0.01, r=0.897 1)；Bax阳性细胞表达率老龄组为(98.24±6.50)%，虽高于青龄组的(82.25±6.37)%，但差异不显著。 结论 随着年龄的增长嗅球中FGF表达减少，抗凋亡基因Bcl-2明显减少，提示嗅球中抗凋亡基因Bcl-2表达受成纤维细胞生长因子的调控，且与老化密切相关。
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Expression of apoptotic gene and FGF on olfactory bulb of rat and its significance
GUAN Guimei DONG Zhen YANG Zhanquan
(Department of Otorhinolaryngology, Third College of Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130031, China)
【Abstract】 Objective To study the expression and distribution of apoptotic gene Bcl-2 and Bax on olfactory of rat , and its relation with the FGF and to investigate the mechanism of senile dysosmia.Methods Ten young (3 months) and ten senile rats (24 months) were used in this study. After the removal of the heads of these rats, olfactory bulb were immediately fixed with neutralized formalin, followed with paraffin-embedding, serial sectioning, immunohistochemiscal staining and microscopic observing. Results The positive expression rate of Bcl-2 and FGF on olfactory bulb in young rats was significantly stronger than that in senile rats (P<0.01). The positive expression rate of Bax in senile rats was a little stronger than that in young rats, but the differences were not statistically significant. (P>0.05) Conclusion The expression of FGF and anti-apoptotic gene Bcl-2 on olfactory bulb decrease with the increase of age. This suggests neuron apoptosis on olfactoy bulb are regulated by neurotrophic factor, and directly related with senile dysosmia. The mitral cell apoptosis as a result of FGF decreased on olfactory bulb may play a key role in the senile dysosmia .
, 百拇医药
【Key words】 Rats; Olfactory bulb; Apoptosis; Anosmia
嗅觉与人们的健康和生活密切相关，嗅觉障碍严重影响生活质量，目前老化性嗅觉障碍占有相当多的比例，已知在神经系统发育过程中有50%以上的神经元发生凋亡，如果细胞凋亡过盛，可导致某些退行性疾病，衰退过程与细胞凋亡密切相关。近来研究发现：神经细胞的存活及其突起的发生主要受神经营养因子的调控，大量的神经元的生理死亡与神经营养因子密切相关[1,2]。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)对多种神经细胞有营养和保护作用。目前，其作为神经营养因子，已成为人们关注的热点[3]。Bcl-2和Bax是与凋亡密切相关的基因，Bcl-2是最为熟悉的抗凋亡基因，Bax是促凋亡基因。本实验对不同年龄组大鼠嗅球中的FGF和Bcl-2及Bax蛋白的表达进行了观察和比较，探讨老化性嗅觉障碍机制 。
, http://www.100md.com 材料和方法
一、 材料
1.实验动物：所用Wistar大鼠均为雄性。青龄组(3个月)体重(112±10.23) kg，老龄组(24个月)体重(408±75.22) kg各10只，由吉林省药检所动物室提供。
2.免疫组化试剂：所用FGF兔抗人多克隆抗体，鼠抗人单克隆抗体Bcl-2和Bax为美国Vector公司产品，SP试剂盒均由中山生物工程公司提供。
二、方法
1.标本处理：将上述大鼠断头处死，取嗅球，经中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片4 μm厚。
2.免疫组化方法：整个免疫组化染色方法参照SP试剂盒产品说明书进行：组织切片脱蜡至水；3%过氧化阻断内源性过氧化物酶；枸橼酸盐抗原修复；羊血清孵育；一抗4℃过夜；DAB显色；苏木素复染。阴性对照用PBS代替一抗。阳性对照选已知表达高的组织切片。
, 百拇医药
3.阳性结果判定：胞浆棕色者为阳性细胞，随机选择5～10个高倍视野，记数1 000个嗅球神经元细胞中的阳性细胞比率，取其平均数作为阳性细胞表达率。以
±s表示。
4.统计学分析：本实验结果采用t检验和相关分析。
结果
所有染片背景清晰，阴性对照不着色。阳性产物呈棕色，FGF主要表达于大鼠嗅球的纤维细胞层和僧帽细胞层(图1,2)；Bcl-2(图3,4)和Bax主要表达在僧帽细胞，其他细胞散在。青龄组大鼠嗅球中Bcl-2和FGF阳性细胞表达率分别为(86.40±5.22)%和(70.25±6.01)%，显著高于老龄组的(30.00±4.12)%和(24.10±4.00)%，且二者呈明显的正相关(±s，r=0.897 1, P<0.01); 青龄组Bax阳性细胞表达率为(82.25±6.37)%，略低于老龄组的(98.24±6.50)%，但差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
讨论
嗅球系嗅觉系统中重要部位，对维持正常感受神经群以及嗅上皮内神经元的形成具有决定性作用[4,5]。其结构具有圆葱样板状分层，由4种神经元，即帽状细胞、刷状细胞、颗粒细胞和小球周细胞构成。
研究证实：嗅阈随年龄增长升高，嗅觉减退的发生率也随之增加，为老化表现之一。实验表明，神经老化过程可合并细胞凋亡，衰退过程与凋亡密切相关。Bcl-2和Bax是凋亡相关基因，二者具有同源性，Bcl-2是凋亡拮抗基因，在神经细胞中Bcl-2基因表达可抑制神经元的凋亡，Bax是促凋亡基因，Bcl-2抑制凋亡必须通过与Bax形成异源二聚体来实现。
本实验，青龄组大鼠嗅球神经元Bcl-2阳性细胞表达率显著高于老龄组。结果显示：随着年龄的增长嗅球中神经元抗凋亡基因蛋白表达明显减少，促凋亡基因虽逐渐增加但差异不显著。从而表明Bcl-2和Bax基因在嗅球神经元整个生长发育过程中呈竞争表达趋势。老化后Bcl-2表达显著下降，使得Bax表达占优势，从而促进了嗅球中神经细胞的凋亡，使其神经元数减少，终致老化。早年研究发现，嗅球中神经纤维随年龄的增长逐渐减少，推测老年人嗅觉减退系中枢神经系统组织萎缩之故。这可能也是由老化后神经元细胞凋亡增多所致。因此，有必要进一步探讨诱导嗅球神经元凋亡的调控因素。
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近年来有学者认为，神经细胞的存活主要受神经营养因子的调控，如神经生长因子(nerve growth factor, NGF)，FGF和表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)等。本研究老龄组嗅球FGF表达显著低于青龄组，表明随着年龄的增长嗅球中FGF的表达减少，结果对嗅神经元的营养及促分化作用明显减弱或丧失，终致嗅觉老化或障碍。
进一步观察发现：Bcl-2、Bax和FGF主要表达于僧帽细胞，不仅显示了僧帽细胞的FGF表达与凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的密切关系，也意味着该细胞在营养神经中的重要地位。僧帽细胞系嗅球中最大的三角形细胞，胞体发出数条较粗的树突构成突触小球，其轴突构成嗅束，而且嗅粘膜中的嗅细胞的轴突与嗅球中的僧帽细胞建立轴-树突触。因此，僧帽细胞对维持嗅路的正常结构和嗅觉传导均具有重要作用。本研究结果统计学分析显示：僧帽细胞中FGF的表达和Bcl-2呈明显的正相关。由此推测，FGF是嗅球中僧帽细胞抗凋亡基因Bcl-2上调因素之一。但其具体调控机制还有待进一步研究。
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凋亡与老化性嗅觉障碍密切相关。嗅球中FGF的减少，启动了凋亡信号，使抗凋亡基因减少，诱导了僧帽细胞凋亡增加，可能是引起老化性嗅觉障碍的主要机制。
图1 老龄组大鼠嗅球中FGF在僧帽细胞表达 SP染色×400
图2 青龄组大鼠嗅球中FGF在僧帽细胞表达 SP染色×400
图3 老龄组大鼠嗅球中Bcl-2在僧帽细胞表达 SP染色×400
, http://www.100md.com 图4 青龄组大鼠嗅球中Bcl-2在僧帽细胞表达 SP染色×400
参考文献
1，Loo DT, Copani A, Pike CJ, et al. Apoptosis is induced by beta-amy-loid in cultured centured central nervous system neurons. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90:7951-7955.
2，吴希如, 陈清棠, 主编. 神经系统疾病的分子生物学基础. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社， 1995. 63-64.
3，Walicke PA. Interactions between basic fibroblast growth factor (FGF) and flyco soaminoglycans in promoting neurite outgrowth. Exp Neurol,1998,102:144-148.
, http://www.100md.com
4，Inamitsu M, Nakashima T, Uemura T. Immunopathology of olfactory mucosa following injury to the olfactory bulb. J Laryngol Otol, 1990,104: 959-964.
5，Cuschieri A, Bannister LH. The development of the olfactory mucosa in the mouse: light-microscopy. J Anatomy, 1975, 119: 272-286.
(收稿日期：2000-03-17), http://www.100md.com
单位：130031 长春 白求恩医科大学第三临床学院耳鼻咽喉-头颈外科
关键词：大鼠；嗅球；脱噬作用；嗅觉缺失
中华耳鼻咽喉科杂志000507 【摘要】 目的 明确成纤维细胞因子(fibroblast growth factor, FGF) 和凋亡相关基因Bcl-2及Bax在大鼠嗅球中的表达及相关性，并探讨老化性嗅觉障碍的机制。方法 取健康大鼠青龄组(3个月)，老龄组(24个月)各10只，断头处死，取嗅球，经石蜡包埋，连续切片，免疫组化染色，光镜观察。结果 青龄组大鼠嗅球中Bcl-2和FGF阳性细胞表达率分别为(86.40±5.22)%和(70.25±6.01)%，显著高于老龄组的(30.00±4.12)%和(24.10±4.00)%，二者呈明显正相关(x±s，P<0.01, r=0.897 1)；Bax阳性细胞表达率老龄组为(98.24±6.50)%，虽高于青龄组的(82.25±6.37)%，但差异不显著。 结论 随着年龄的增长嗅球中FGF表达减少，抗凋亡基因Bcl-2明显减少，提示嗅球中抗凋亡基因Bcl-2表达受成纤维细胞生长因子的调控，且与老化密切相关。
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Expression of apoptotic gene and FGF on olfactory bulb of rat and its significance
GUAN Guimei DONG Zhen YANG Zhanquan
(Department of Otorhinolaryngology, Third College of Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130031, China)
【Abstract】 Objective To study the expression and distribution of apoptotic gene Bcl-2 and Bax on olfactory of rat , and its relation with the FGF and to investigate the mechanism of senile dysosmia.Methods Ten young (3 months) and ten senile rats (24 months) were used in this study. After the removal of the heads of these rats, olfactory bulb were immediately fixed with neutralized formalin, followed with paraffin-embedding, serial sectioning, immunohistochemiscal staining and microscopic observing. Results The positive expression rate of Bcl-2 and FGF on olfactory bulb in young rats was significantly stronger than that in senile rats (P<0.01). The positive expression rate of Bax in senile rats was a little stronger than that in young rats, but the differences were not statistically significant. (P>0.05) Conclusion The expression of FGF and anti-apoptotic gene Bcl-2 on olfactory bulb decrease with the increase of age. This suggests neuron apoptosis on olfactoy bulb are regulated by neurotrophic factor, and directly related with senile dysosmia. The mitral cell apoptosis as a result of FGF decreased on olfactory bulb may play a key role in the senile dysosmia .
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【Key words】 Rats; Olfactory bulb; Apoptosis; Anosmia
嗅觉与人们的健康和生活密切相关，嗅觉障碍严重影响生活质量，目前老化性嗅觉障碍占有相当多的比例，已知在神经系统发育过程中有50%以上的神经元发生凋亡，如果细胞凋亡过盛，可导致某些退行性疾病，衰退过程与细胞凋亡密切相关。近来研究发现：神经细胞的存活及其突起的发生主要受神经营养因子的调控，大量的神经元的生理死亡与神经营养因子密切相关[1,2]。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)对多种神经细胞有营养和保护作用。目前，其作为神经营养因子，已成为人们关注的热点[3]。Bcl-2和Bax是与凋亡密切相关的基因，Bcl-2是最为熟悉的抗凋亡基因，Bax是促凋亡基因。本实验对不同年龄组大鼠嗅球中的FGF和Bcl-2及Bax蛋白的表达进行了观察和比较，探讨老化性嗅觉障碍机制 。
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一、 材料
1.实验动物：所用Wistar大鼠均为雄性。青龄组(3个月)体重(112±10.23) kg，老龄组(24个月)体重(408±75.22) kg各10只，由吉林省药检所动物室提供。
2.免疫组化试剂：所用FGF兔抗人多克隆抗体，鼠抗人单克隆抗体Bcl-2和Bax为美国Vector公司产品，SP试剂盒均由中山生物工程公司提供。
二、方法
1.标本处理：将上述大鼠断头处死，取嗅球，经中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片4 μm厚。
2.免疫组化方法：整个免疫组化染色方法参照SP试剂盒产品说明书进行：组织切片脱蜡至水；3%过氧化阻断内源性过氧化物酶；枸橼酸盐抗原修复；羊血清孵育；一抗4℃过夜；DAB显色；苏木素复染。阴性对照用PBS代替一抗。阳性对照选已知表达高的组织切片。
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3.阳性结果判定：胞浆棕色者为阳性细胞，随机选择5～10个高倍视野，记数1 000个嗅球神经元细胞中的阳性细胞比率，取其平均数作为阳性细胞表达率。以
±s表示。4.统计学分析：本实验结果采用t检验和相关分析。
结果
所有染片背景清晰，阴性对照不着色。阳性产物呈棕色，FGF主要表达于大鼠嗅球的纤维细胞层和僧帽细胞层(图1,2)；Bcl-2(图3,4)和Bax主要表达在僧帽细胞，其他细胞散在。青龄组大鼠嗅球中Bcl-2和FGF阳性细胞表达率分别为(86.40±5.22)%和(70.25±6.01)%，显著高于老龄组的(30.00±4.12)%和(24.10±4.00)%，且二者呈明显的正相关(
±s，r=0.897 1, P<0.01); 青龄组Bax阳性细胞表达率为(82.25±6.37)%，略低于老龄组的(98.24±6.50)%，但差异无显著性(P>0.05)。, 百拇医药
讨论
嗅球系嗅觉系统中重要部位，对维持正常感受神经群以及嗅上皮内神经元的形成具有决定性作用[4,5]。其结构具有圆葱样板状分层，由4种神经元，即帽状细胞、刷状细胞、颗粒细胞和小球周细胞构成。
研究证实：嗅阈随年龄增长升高，嗅觉减退的发生率也随之增加，为老化表现之一。实验表明，神经老化过程可合并细胞凋亡，衰退过程与凋亡密切相关。Bcl-2和Bax是凋亡相关基因，二者具有同源性，Bcl-2是凋亡拮抗基因，在神经细胞中Bcl-2基因表达可抑制神经元的凋亡，Bax是促凋亡基因，Bcl-2抑制凋亡必须通过与Bax形成异源二聚体来实现。
本实验，青龄组大鼠嗅球神经元Bcl-2阳性细胞表达率显著高于老龄组。结果显示：随着年龄的增长嗅球中神经元抗凋亡基因蛋白表达明显减少，促凋亡基因虽逐渐增加但差异不显著。从而表明Bcl-2和Bax基因在嗅球神经元整个生长发育过程中呈竞争表达趋势。老化后Bcl-2表达显著下降，使得Bax表达占优势，从而促进了嗅球中神经细胞的凋亡，使其神经元数减少，终致老化。早年研究发现，嗅球中神经纤维随年龄的增长逐渐减少，推测老年人嗅觉减退系中枢神经系统组织萎缩之故。这可能也是由老化后神经元细胞凋亡增多所致。因此，有必要进一步探讨诱导嗅球神经元凋亡的调控因素。
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近年来有学者认为，神经细胞的存活主要受神经营养因子的调控，如神经生长因子(nerve growth factor, NGF)，FGF和表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)等。本研究老龄组嗅球FGF表达显著低于青龄组，表明随着年龄的增长嗅球中FGF的表达减少，结果对嗅神经元的营养及促分化作用明显减弱或丧失，终致嗅觉老化或障碍。
进一步观察发现：Bcl-2、Bax和FGF主要表达于僧帽细胞，不仅显示了僧帽细胞的FGF表达与凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的密切关系，也意味着该细胞在营养神经中的重要地位。僧帽细胞系嗅球中最大的三角形细胞，胞体发出数条较粗的树突构成突触小球，其轴突构成嗅束，而且嗅粘膜中的嗅细胞的轴突与嗅球中的僧帽细胞建立轴-树突触。因此，僧帽细胞对维持嗅路的正常结构和嗅觉传导均具有重要作用。本研究结果统计学分析显示：僧帽细胞中FGF的表达和Bcl-2呈明显的正相关。由此推测，FGF是嗅球中僧帽细胞抗凋亡基因Bcl-2上调因素之一。但其具体调控机制还有待进一步研究。
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凋亡与老化性嗅觉障碍密切相关。嗅球中FGF的减少，启动了凋亡信号，使抗凋亡基因减少，诱导了僧帽细胞凋亡增加，可能是引起老化性嗅觉障碍的主要机制。
图1 老龄组大鼠嗅球中FGF在僧帽细胞表达 SP染色×400
图2 青龄组大鼠嗅球中FGF在僧帽细胞表达 SP染色×400
图3 老龄组大鼠嗅球中Bcl-2在僧帽细胞表达 SP染色×400
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参考文献
1，Loo DT, Copani A, Pike CJ, et al. Apoptosis is induced by beta-amy-loid in cultured centured central nervous system neurons. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90:7951-7955.
2，吴希如, 陈清棠, 主编. 神经系统疾病的分子生物学基础. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社， 1995. 63-64.
3，Walicke PA. Interactions between basic fibroblast growth factor (FGF) and flyco soaminoglycans in promoting neurite outgrowth. Exp Neurol,1998,102:144-148.
, http://www.100md.com
4，Inamitsu M, Nakashima T, Uemura T. Immunopathology of olfactory mucosa following injury to the olfactory bulb. J Laryngol Otol, 1990,104: 959-964.
5，Cuschieri A, Bannister LH. The development of the olfactory mucosa in the mouse: light-microscopy. J Anatomy, 1975, 119: 272-286.
(收稿日期：2000-03-17), http://www.100md.com