当前位置: 首页 > 期刊 > 《中华耳鼻咽喉头颈外科杂志》 > 2000年第6期
编号:10268963
c-myc异常表达与KB细胞多药耐药性的关系及其意义
http://www.100md.com 《中华耳鼻咽喉头颈外科杂志》 2000年第6期
     作者:何英 张积仁 张健 汪森明

    单位:何英(第一军医大学南方医院耳鼻咽喉科 广州 510510);张积仁 张健 汪森明(第一军医大学珠江医院肿瘤治疗中心)

    关键词:基因;myc;KB细胞;化学疗法;辅助;抗多种药物性;基因表达调控

    中华耳鼻咽喉科杂志000616 【摘要】 目的 了解c-myc基因异常表达与KB细胞多药耐药性(multidrug resistance, MDR)的关系。方法 将含Ribozyme基因的真核细胞表达克隆转染KB细胞,应用免疫组织化学方法及流式细胞术检测经抗mdr1-ribozyme处理前后KB细胞中c-myc基因产物Myc蛋白及多药耐药基因mdr1产物P糖蛋白( P-glycoprotein,P-gp) 表达的改变。结果 耐药株 KBv和敏感株KB均有Myc蛋白表达,但KBv强于KB, 经抗mdr1-ribozyme部分逆转MDR表型后,KBv/5mR3及KB/5mR3 Myc蛋白表达减弱;耐药株逆转前后P-gp表达有明显变化,而敏感株则无明显改变。结论 在MDR状态下,Myc蛋白表达增高与肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性有关,c-myc参与了mdr1的调控。Myc蛋白有可能作为一种新的监测手段来协助临床判断 c-myc高表达的肿瘤细胞是否产生多药耐药。
, http://www.100md.com
    Study on the relationship between the abnormal expression of c-myc and multidrug resistance in KB cell lines

    HE Ying, ZHANG Jiren, ZHANG Jian, et al.

    (Department of Otorhinolaryngolgy, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510510, China)

    【Abstract】 Objective To investigate the relationship between expression of c-myc and the regulation of mdr1, and find out the best way for gene therapy of the proliferative diseases with c-myc overexpression and reverse the multidrug resistance phenotype. Methods The changes of c-Myc protein and P-gp in the KB cell lines were detected by using immunohistochemistry and flow cytometry methods before and after treatment with anti-mdr1- ribozyme. Results All KB cell lines could express c-Myc protein. The expression of c-myc in multidrug resistant cell KBv displayed higher than that in sensitive cell KB. However, after reversing the multidrug resistance phenotype by anti-mdr1-ribozyme, the level of c-Myc protein expression was lower in KBv/5mR3 and KB/5mR3. The level of P-gp expression was lower in KBv/5mR3 than that in KBv but no difference in KB/5mR3 and KB.Conclusion There are a close relationship between Myc protein and MDR phenotype. The c-myc involves in regulating expression of mdr1. Myc protein can be used as a new assistant implement to monitor the formation of MDR.
, 百拇医药
    【Key words】 Genes, myc; KB cells; Chemotherapy, adjuvant; Multidrug-resistant; Gene expression regulation

    肿瘤细胞多药耐药性(multidrug resistance, MDR)的产生是肿瘤化学治疗面临的最常见和最棘手的问题,而及时发现和判断肿瘤细胞是否产生耐药,对调整用药、提高疗效和生存率有着重要的现实意义。随着研究的不断深入,发现c-myc基因与mdr1基因密切相关。本研究运用免疫组化及流式细胞术研究和探讨了经抗mdr1-ribozyme处理前后KB细胞c-Myc蛋白和P-糖蛋白(P-glyooprotein, P-gp)表达的改变及其意义,为研究MDR产生的分子机理及寻找新的逆转肿瘤MDR的方法进行一些探索性的工作。

    材料和方法

    一、材料
, 百拇医药
    1. KB细胞株 (人口咽腔表皮样癌细胞株): 敏感株KB及耐药株KBv (以敏感的KB细胞为亲本,通过诱变剂甲基磺酸乙酯刺激,然后在培养液中加入浓度递增的长春新碱(Vincristine, VCR)诱导而得,在VCR浓度为200 nmol/L时生长良好。VCR对敏感的KB细胞的半数致死量(IC50)为29 nmol/L,耐药细胞KBv较亲本的KB细胞对VCR抗药100倍,由第一军医大学珠江医院肿瘤治疗中心张健博士后惠赠。

    2.菌株与质粒:① pHβApr-1 neo:带有β-肌动蛋白(β-actin)启动子的载体质粒;pHβApr-1 neo/5mR3:含能特异性切割mdr1mRNA Ribozyme的真核表达质粒,由第一军医大学珠江医院肿瘤治疗中心袁亚维博士构建并惠赠;②JM105、MC1061由中国科学院上海生化所陆长德教授惠赠。

    3.其他主要试剂来源 Lipofectin和G418购自美国Gibco-BRL公司; c-Myc蛋白单克隆抗体(鼠抗人IgG)及FITC荧光抗体、SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物制品公司(进口分装); P-gp单克隆抗体(JSB-1)购自德国Boehringer Mannheim公司。
, 百拇医药
    二、方法

    1. 质粒DNA转染肿瘤细胞:用脂质体转染技术,将含Ribozyme的质粒pHβApr-1neo/5mR3及空载体pHβApr-1 neo导入耐药细胞KBv及其亲本KB细胞内,经G418筛选约4周,待抗性克隆形成后,消化同种共转染细胞的各克隆,继续培养。通过以上方法筛选获得了稳定表达Ribozyme的KB细胞克隆(KBv/5mR3、KB/5mR3)及稳定复制空载体的KB细胞(KBv/vec、KB/vec)。

    2.肿瘤细胞耐药实验 (MTT法) :分别将转染前后的靶细胞 (KB、KBv、KB/5mR3、KBv/5mR3、KB/vec、KBv/vec) 接种于96孔板中,分别加入不同浓度的VCR 100~400 nmol/L,1式3份继续培养3 d,加入 10 μL MTT (Fluka 5 mg/ml) ,37℃,5%CO2继续培养4 h,加入二甲亚砜100 μL,用酶联仪570 nm测吸光度(A)值,求出半数抑制浓度(IC50)。
, 百拇医药
    3. 免疫组化SABC法:将各组细胞 (KB、KBv、KB/5mR3、KBv/5mR3、KB/vec、KBv/vec) 接种于96孔板中,4%多聚甲醛固定,0.1% Triton-100浸泡后,用H2O2阻断,血清封闭,加一抗(c-myc单抗/P-gp单抗)(1∶50)4℃过夜,次日加二抗和SABC复合物,DAB显色。用已知有上述一抗强表达的人乳腺癌细胞株做阳性对照, 以PBS代替一抗做阴性对照,操作步骤同上。

    4.FCM检查:常规方法收集各组细胞,参照Jurgen等建立的方法[1],先用0.1% Triton-100给细胞膜打孔,以利抗体穿过细胞膜进入细胞内与细胞核内相应的抗原结合, 小牛血清蛋白封闭后, 然后加入特异的c-myc单抗(1∶50)4℃过夜,次日加入FITC标记的二抗(1∶20)上机检查。

    结果

    一、KB 和KBv 耐药性的差异
, 百拇医药
    细胞KB、KBv、KB/5mR3、KBv/5mR3、KB/vec、KBv/vec加入不同浓度的VCR后,随剂量和时间而增殖减慢。各种数据经统计学处理 (SPSS 7.5软件) ,KB与KBv 、KBv/5mR3之间差异有显著性。细胞增殖药物半数致死量 (IC50) 测定结果显示KBv的IC50值 (338.8 nmol) 是KB的 (105.4 nmol) 3倍,是KBv/5mR3的 (200 nmol) 1.7倍。

    二、Myc蛋白与MDR的关系

    免疫组化结果显示在耐药株KBv和KBv/vec中c-Myc蛋白的表达较强,而KBv/5mR3则明显减弱(图1)。在敏感株KB和KB/vec中c-Myc蛋白的表达较弱,KB/5mR3则更弱。流式细胞术结果示:第二峰代表c-Myc蛋白表达量,耐药株KBv、空载对照KBv/vec及经特异性抗mdr1mRNA Ribozyme切割后的KBv/5mR3,其Myc蛋白含量的变化有明显差异分别为49.5%、46.1%及6.9%。而敏感株KB、空载对照KB/vec及经特异性抗mdr1mRNA Ribozyme切割后的KB/5mR3, 三者Myc蛋白含量水平无明显差异分别为6.5%,5.2%及4.8%。显然耐药株Myc蛋白含量随mdr1基因被切割由49.5%下调至6.9%,而敏感株Myc蛋白含量并未因mdr1基因被切割而有所改变。
, http://www.100md.com
    三、MDR与P-gp的关系

    免疫组化结果显示耐药株KBv、KBv/vec表达为阳性,KBv/5mR3为弱阳性(图2)。而敏感株KB、KB/vec和 KB/5mR3 P-gp的表达均为阴性。

    讨论

    化学治疗是肿瘤治疗的主要手段之一,但肿瘤细胞产生原药耐药和多药耐药却是肿瘤治疗面临的难题之一。

    人类c-myc原癌基因位于染色体8q24,由3个外显子和2个内含子组成,其编码蛋白属核蛋白类。c-myc作为转录因子,在细胞周期调控、细胞增殖及肿瘤发生、转移等生理病理过程中发挥重要的作用。近期研究还发现,c-myc与mdr1密切相关[2]。mdr1的表达与临床上常见的肿瘤细胞多药耐药性有关。人mdr1基因的过度表达在肿瘤细胞多药耐药的发生中起着极其重要的作用。人多药耐药基因mdr1定位于染色体7q21,有28个外显子和1个开放读码框架 (OKF) ,mRNA长度为4.5 kb,表达产物相对分子质量为170 000的跨膜蛋白,称为P-gp。MDR特性的出现与mdr1 基因过度表达及其编码的产物P-gp有关。P-gp是一种依赖ATP能量的药物泵,将大部分脂溶性药物或异物从细胞内排出,使得药物不能在细胞内积累,从而产生耐药性[1]。作用底物包括许多临床常用的抗癌药物如紫杉醇类、长春碱类、秋水仙碱、蒽环类抗生素、放线菌素D和其他许多生物异源性物质如荧光染料等。Mdr1表达增强的耐药细胞中对上述药物的蓄积浓度减低。最新的研究表明[3,4]:原癌基因c-myc表达在耐药细胞中显著增高;染色体重排可以激活mdr1而致抗药性产生;c-myc基因表达的下调可增加肿瘤耐药细胞对化学治疗药物的敏感性;反义c-myc可以提高肿瘤细胞对化学治疗药物的敏感性而杀灭肿瘤细胞。然而有关c-myc基因与mdr1基因关系研究的结果,目前国内外尚未得出一致的结论。Nomi认为c-myc基因产物能促进mdr1基因高表达而产生MDR,而Deloprote等[5]却得出相反的结论。
, http://www.100md.com
    本实验结果表明在体外培养KB细胞中,Myc蛋白表达在耐药株KBv中显著增高,使用特异性核酶切割耐药基因后,KBv/5mR3在P-gp降低的同时Myc蛋白表达也随之下降,并对VCR敏感性增强。而敏感株KB细胞株经特异性核酶处理后,Myc蛋白表达略下调, P-gp表达无改变。提示早期反应基因c-myc在耐药性形成中扮演了重要角色,c-myc表达增高与肿瘤细胞对化学治疗药物产生耐药性有关。c-myc基因可能参与了肿瘤多药抗性的表达调节[6],其基因产物能促使mdr1基因表达而产生较高水平耐药糖蛋白P-gp,从而使KB细胞获得并维持MDR表型,这可能是c-myc基因能增强mdr1启动子的调节作用,进而促进mdr1基因表达的结果。欲论证两者之间的关系,有待于今后进一步探讨。

    我们的研究结果还表明Myc蛋白有可能作为一种新的监测手段来协助临床判断c-myc高表达的肿瘤细胞是否产生多药耐药,这对及时发现和判断肿瘤细胞是否产生耐药,随时调整用药,以进一步提高疗效和生存率有着重要的现实意义。
, 百拇医药
    图1 Myc蛋白在耐药株KBV中表达较强(右),而在KBv/5mR3中的表达则明显减弱(左).SABC×200

    图2 P糖蛋白在耐药株KBv表达为阳性(右),KBv/5mR3中的表达为弱阳性(左).SABC×200

    基金项目:国家自然科学基金资助项目(C03031906)

    参考文献

    1,Cianfriglia M, Poloni F, Signoretti C, et al. Topology of MDR1-P-glycoprotein as indicated by epitope mapping of monoclonal antibodies to human MDR cells. Cytoectechnology, 1996, 19: 247-251.
, http://www.100md.com
    2,Knutsen T, Mickley LA, Ried T, et al. Cytogenetic and molecular characterization of random chromosomal rearrangements activating the drug resistance gene, MDR1/P-glycoprotein, in drug-selected cell lines and patients with drug refractory ALL. Genes Chromosomrs Cancer, 1998, 23: 44-54.

    3,el-Deiry WS .Role of oncogenes in resistance and killing by cancer therapeutic agents. Curr Opin Oncol, 1997, 9: 79-87.

    4,Motomura S, Motoji T, Takanashi M, et al. Inhibition of P-glycoprotein and recovery of drug sensitivity of human acute leukemic blast cells by multidrug resistance gene (mdr1) antisense oligonucleotides. Blood, 1998, 91: 3163-3171.
, 百拇医药
    5,Delaporte C, Dautry F, Sablon AJ, et al. Induction of pgp53 expression and reversion of the multidrug resistance phenotype in 9-OH-ellipticine-resistant Chinese hamster lung fibroblasts transfected with the MYC oncogene. Biochem Pharmacol, 1997, 53: 59-66.

    6,Ogretmen B, Safa AR. Expression of the mutated p53 tumor suppressor protein and its molecular and biochemical characterization in multidrug resistant MCF-7/Adr human breast cancer cells. Oncogene, 1997, 14: 499-507.

    (收稿日期:2000-01-05), 百拇医药