内源性一氧化氮对大鼠慢性缺氧性肺动脉高压的调节作用
作者：100034 北京医科大学第一医院儿科(杜军保、李万镇);北京积水谭医院(赵斌、黎文)
单位：杜军保 李万镇 赵斌 黎文
关键词：一氧化氮；低氧；高血压；肺性；大鼠
中华儿科杂志980208.htm
本课题由国家自然科学基金(基金编号：39470735)及卫生部全国优秀青年科技人才专项基金资助
【摘要】 目的 探讨一氧化氮对慢性缺氧性肺动脉高压的调节作用。方法 采用Wistar大鼠18只，随机将各配伍组大鼠分别分配到组Ⅰ(对照组)、组Ⅱ(缺氧组)及组Ⅲ[缺氧加一氧化氮合酶抑制剂Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME组)]。研究L-NAME对缺氧性肺动脉高压的影响。结果 与对照组相比，缺氧加L-NAME注射的大鼠肺动脉平均压上升百分数(58%±12%)明显高于单纯缺氧大鼠(34%±15%)(t=3.013，P<0.01);缺氧加L-NAME注射大鼠血浆一氧化氮下降百分数(38%±4%)明显大于单纯缺氧大鼠(12%±12%)(t=27；0.05>P>0.02)。结论 大鼠慢性缺氧时一氧化氮释放减少，而一氧化氮释放减少可能参与缺氧性肺动脉高压的形成。
, http://www.100md.com
The modulatory role of endogenous nitric oxide in the development of chronically hypoxic pulmonary hypertension in rats Du Junbao*, Li Wanzhen, Zhao Bin, et al. *Department of Pediatrics, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective The aim of this study was to examine the modulatory role of endogenous nitric oxide in the development of chronically hypoxic pulmonary hypertension.Methods Eighteen Wistar rats were randomly divided into the following groups: group Ⅰ(control group), group Ⅱ (hypoxia group) and group Ⅲ [hypoxia+ Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) group]. The impacts of L-NAME on hypoxic pulmonary hypertension were studied. Results The percentage of increase in pulmonary artery mean pressure as well as the percentage of decrease in plasma level of nitric oxide was more obvious in hypoxic pulmonary hypertensive rats with L -NAME treatment than those without L-NAME treatment (58±12%, 34±15%; 38±4%, 12±12%, all P<0.05).Conclusion Nitric oxide release decreased during chronic hypoxia, which was probably involved in the mechanism of hypoxic pulmonary hypertension.
, 百拇医药
【Key words】 Nitric oxide Anoxia Hypertension, pulmonary Rats
至今为止，慢性缺氧性肺动脉高压的发生及调节机制还不十分清楚[1]。近来发现慢性缺氧时一氧化氮(nitric oxide， NO)释放减少[2]。而NO是一种内皮衍生舒张因子[3]，它能激活肺动脉的鸟苷酸环化酶，使环磷酸鸟苷(cGMP)水平升高，从而使肺动脉扩张[4，5]。但目前缺乏关于内源性NO对慢性缺氧性肺动脉高压调节作用的研究资料。我们采用大鼠慢性缺氧性肺动脉高压模型，通过NO合酶抑制剂Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)，探讨内源性NO对缺氧性肺动脉高压的影响。
材料及方法
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一、实验动物及给药
选择体重210～300 g雄性Wistar大鼠18只。将同年龄、同体重的每3只大鼠配成1个配伍组，共配成6个配伍组，按随机原则将各配伍组大鼠分别分配到组Ⅰ(对照组)、组Ⅱ(缺氧组)及组Ⅲ(缺氧+L-NAME组)。组Ⅱ及组Ⅲ大鼠均于常压缺氧舱内进行缺氧处理。舱内氧浓度为10%±0.5%，二氧化碳浓度<3%。每天缺氧6小时，连续2周。对组Ⅲ大鼠每天缺氧前于腹腔内注射L-NAME(Sigma)5 mg/kg，组Ⅰ及组Ⅱ大鼠每天于腹腔内注射相同容积的生理盐水。
二、肺动脉压力测定
实验2周后，将动物予10%乌拉坦腹腔麻醉，固定于手术台上。采用右心导管法测量大鼠肺动脉压力[6]。将聚乙烯塑料导管从右颈外静脉插入右心室及肺动脉，导管之另一端通过P50压力传感器与多道生理仪(RM-6000型，日本光电公司)相连，描记肺动脉压力曲线，测定肺动脉平均压(pulmonary artery mean pressure，PAMP)。
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三、血浆NO含量间接测定
颈动脉取血约2 ml，分离血浆0.1 ml，加0.6ml的0.15%硫酸锌，加蒸馏水混匀，加0.1 ml的4%氢氧化钠，冰上孵育1小时，12 000 r/min，离心2 min，取上清液0.6 ml加0.4 ml双蒸水及0.1 ml的0.3%磺胺，于冰上孵育15 min后加入0.1ml的6 mmol/L萘乙烯二胺盐酸盐，室温放置1小时，于紫外分光光度仪(LIV-365，Shimadzu)上以545 nm比色，读出吸光度A值(曾称光密度OD值)，按标准曲线计算NO的间接含量(硝酸盐及亚硝酸盐浓度)。试剂盒由解放军军事医学科学院提供。
四、统计学处理
以组Ⅰ为参照，组Ⅱ与组Ⅲ的PAMP及NO血浆间接含量变化值百分数的差异分别采用t检验及秩和检验进行统计学处理。
结果
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一、L-NAME对缺氧大鼠PAMP的影响
与组Ⅰ相比，组Ⅲ大鼠PAMP上升百分数(58%±12%)明显高于组Ⅱ大鼠PAMP上升百分数(34%±15%)，其差异有非常显著意义(t=3.013，P<0.01)(附表)。
附表 大鼠PAMP及血浆NO间接含量(
±s) 组别
例数
PAMP(kPa)
ΔPAMP(%)
NO(μmol/L)
ΔNO(%)
, http://www.100md.com 组Ⅰ
6
2.05±0.13---
4.75±0.17---
组Ⅱ
6
2.71±0.29
34±15
4.15±0.49
12±12
组Ⅲ
6
, http://www.100md.com 3.10±0.11
58±12*
2.93±0.20
38±4**
Δ：变化值下降百分数(与组Ⅰ参照)；与组Ⅱ相比较，*P<0.01，**0.05>P>0.02
二、L-NAME对缺氧大鼠血浆NO的影响
与组Ⅰ相比，组Ⅲ大鼠血浆NO下降百分数(38%±4%)明显大于组Ⅱ大鼠血浆NO下降百分数(12%±12%)，其差异有显著意义(t=27，0.05>P>0.02)(附表)。讨论
内皮细胞在调节缺氧性肺动脉高压中的作用日益受到重视[7]。在血管内皮细胞合成的多种物质中，NO是近年来人们广泛关注的新型信使分子。研究表明，在内皮细胞内，L-精氨酸经一氧化氮合酶催化生成NO[8]，后者能激活肺动脉的鸟苷酸环化酶，使其环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)水平升高，从而进一步激活cGMP依赖性的蛋白激酶，导致肌浆球蛋白(myosin)轻链的脱磷酸化，使平滑肌舒张[9]。Adnot等[2]的研究还发现大鼠慢性缺氧可使肺血管释放NO减少。因此人们推测在慢性缺氧时，NO的释放受累可能参与慢性缺氧性肺动脉高压的形成机制。但尚缺乏实验研究资料对此加以证实。
, http://www.100md.com
本研究在整体大鼠慢性缺氧性肺动脉高压模型上，将肺动脉血液动力学资料与NO代谢产物含量同步测定分析，比较组Ⅱ及组Ⅲ肺动脉压力及NO代谢产物含量与组Ⅰ结果的变化率。这种设计方法可将空气中NO对肺动脉压力及NO代谢产物含量的影响因素控制齐同。结果表明，大鼠缺氧2周形成慢性缺氧性肺动脉高压时，血浆NO水平平均下降12%.当对缺氧大鼠同时予以体内血管最强的一种新的一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME后，血浆NO水平进一步降低(38%)(0.05>P>0.02)，同时伴随肺动脉压力的再度升高(58%±12%、34%±15%，P<0.01)，推测大鼠慢性缺氧时NO的释放减少可能参与缺氧性肺动脉高压的形成。同时NO体系对其起着重要的调节作用。
NO调节慢性缺氧性肺动脉高压的途径还不十分清楚，可能是由于抑制了血管收缩物质(如内皮素)的释放所致。硝酸甘油和硝普钠目前被认为是通过释放NO而发挥其药理作用的。Saijonmaa等[10]的研究发现，硝酸甘油和硝普钠可以抑制人脐静脉内皮细胞分泌内皮素-1;而且还发现内皮细胞内cGMP升高也可以抑制内皮素-1的分泌，而NO可以激活鸟苷酸环化酶使细胞内cGMP升高，提示NO可抑制内皮素-1的分泌。此外NO调节慢性缺氧性肺动脉高压也可能是通过拮抗了缩血管物质的作用所致。
, 百拇医药
参考文献
1 杜军保，主编.缺氧性肺动脉高压.北京:北京医科大学-中国协和医科大学联合出版社，1994.24-63.
2 Adnot S, Raffestin B, Eddam ibi S, et al. Loss of endothelium-dependent relaxant activity in the pulmonary circulation of rats exposed to chronic hypoxia. J Clin Invest, 1991,87:155-162.
3 Kelm M, Feelisch M, Spahr R, et al. Quantitative and kinetic characterization of nitric oxide and EDRF released from cultured endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 1988, 154:236-244.
, http://www.100md.com
4 Ignarro LJ, Harbison RG, Wood KS, et al. Activation of purified soluble guanylate cyclase by endothelium-derived relaxing factor from intrapulmonary artery and vein:stimulation by acetylcholin, bradykinin and arachidonic acid. J Pharmacol Exp Ther, 1986, 237: 893-900.
5 Ignarro LJ, Russell EB, Keith SW, et al. Endothelium-dependent modulation of cGMP levels and intrinsic smooth muscle tone in isolated bovine intrapulmonary artery and vein. Circ Res, 1987,60:82-92.
, http://www.100md.com
6 孙波, 孙文利. 右心导管测定大鼠肺动脉压的实验方法. 中国医学科学院学报, 1984, 6:465-467.
7 Fineman JR, Chang R, Soifer SJ. EDRF inhibition augments pulmonary hypertension in intact newborn lambs. Am J Physiol, 1992, 262: H 1365-1371.
8 Moncada S, Higgs EA, Hodson HF, et al. The L-arginine: nitric oxide pathway. J Cardiovasc Pharmacol, 1991,17(Suppl 3): 1-9.
9 Ignarro LJ. Biological action and properties of endothelium-derived nitric oxide formed and released from artery and vein. Circ Res, 1989,65:1-21.
10 Saijonmaa O, Ristimaki A, Fyhrquist F. Atrial natriuretic peptide, nitroglycerin, and nitroprusside reduce basal and stimulated endothelin production from cultured endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 1990,173:514-520.
(收稿：1997-01-15 修回：1997-10-31), http://www.100md.com
单位：杜军保 李万镇 赵斌 黎文
关键词：一氧化氮；低氧；高血压；肺性；大鼠
中华儿科杂志980208.htm
本课题由国家自然科学基金(基金编号：39470735)及卫生部全国优秀青年科技人才专项基金资助
【摘要】 目的 探讨一氧化氮对慢性缺氧性肺动脉高压的调节作用。方法 采用Wistar大鼠18只，随机将各配伍组大鼠分别分配到组Ⅰ(对照组)、组Ⅱ(缺氧组)及组Ⅲ[缺氧加一氧化氮合酶抑制剂Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME组)]。研究L-NAME对缺氧性肺动脉高压的影响。结果 与对照组相比，缺氧加L-NAME注射的大鼠肺动脉平均压上升百分数(58%±12%)明显高于单纯缺氧大鼠(34%±15%)(t=3.013，P<0.01);缺氧加L-NAME注射大鼠血浆一氧化氮下降百分数(38%±4%)明显大于单纯缺氧大鼠(12%±12%)(t=27；0.05>P>0.02)。结论 大鼠慢性缺氧时一氧化氮释放减少，而一氧化氮释放减少可能参与缺氧性肺动脉高压的形成。
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The modulatory role of endogenous nitric oxide in the development of chronically hypoxic pulmonary hypertension in rats Du Junbao*, Li Wanzhen, Zhao Bin, et al. *Department of Pediatrics, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective The aim of this study was to examine the modulatory role of endogenous nitric oxide in the development of chronically hypoxic pulmonary hypertension.Methods Eighteen Wistar rats were randomly divided into the following groups: group Ⅰ(control group), group Ⅱ (hypoxia group) and group Ⅲ [hypoxia+ Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) group]. The impacts of L-NAME on hypoxic pulmonary hypertension were studied. Results The percentage of increase in pulmonary artery mean pressure as well as the percentage of decrease in plasma level of nitric oxide was more obvious in hypoxic pulmonary hypertensive rats with L -NAME treatment than those without L-NAME treatment (58±12%, 34±15%; 38±4%, 12±12%, all P<0.05).Conclusion Nitric oxide release decreased during chronic hypoxia, which was probably involved in the mechanism of hypoxic pulmonary hypertension.
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【Key words】 Nitric oxide Anoxia Hypertension, pulmonary Rats
至今为止，慢性缺氧性肺动脉高压的发生及调节机制还不十分清楚[1]。近来发现慢性缺氧时一氧化氮(nitric oxide， NO)释放减少[2]。而NO是一种内皮衍生舒张因子[3]，它能激活肺动脉的鸟苷酸环化酶，使环磷酸鸟苷(cGMP)水平升高，从而使肺动脉扩张[4，5]。但目前缺乏关于内源性NO对慢性缺氧性肺动脉高压调节作用的研究资料。我们采用大鼠慢性缺氧性肺动脉高压模型，通过NO合酶抑制剂Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)，探讨内源性NO对缺氧性肺动脉高压的影响。
材料及方法
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一、实验动物及给药
选择体重210～300 g雄性Wistar大鼠18只。将同年龄、同体重的每3只大鼠配成1个配伍组，共配成6个配伍组，按随机原则将各配伍组大鼠分别分配到组Ⅰ(对照组)、组Ⅱ(缺氧组)及组Ⅲ(缺氧+L-NAME组)。组Ⅱ及组Ⅲ大鼠均于常压缺氧舱内进行缺氧处理。舱内氧浓度为10%±0.5%，二氧化碳浓度<3%。每天缺氧6小时，连续2周。对组Ⅲ大鼠每天缺氧前于腹腔内注射L-NAME(Sigma)5 mg/kg，组Ⅰ及组Ⅱ大鼠每天于腹腔内注射相同容积的生理盐水。
二、肺动脉压力测定
实验2周后，将动物予10%乌拉坦腹腔麻醉，固定于手术台上。采用右心导管法测量大鼠肺动脉压力[6]。将聚乙烯塑料导管从右颈外静脉插入右心室及肺动脉，导管之另一端通过P50压力传感器与多道生理仪(RM-6000型，日本光电公司)相连，描记肺动脉压力曲线，测定肺动脉平均压(pulmonary artery mean pressure，PAMP)。
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三、血浆NO含量间接测定
颈动脉取血约2 ml，分离血浆0.1 ml，加0.6ml的0.15%硫酸锌，加蒸馏水混匀，加0.1 ml的4%氢氧化钠，冰上孵育1小时，12 000 r/min，离心2 min，取上清液0.6 ml加0.4 ml双蒸水及0.1 ml的0.3%磺胺，于冰上孵育15 min后加入0.1ml的6 mmol/L萘乙烯二胺盐酸盐，室温放置1小时，于紫外分光光度仪(LIV-365，Shimadzu)上以545 nm比色，读出吸光度A值(曾称光密度OD值)，按标准曲线计算NO的间接含量(硝酸盐及亚硝酸盐浓度)。试剂盒由解放军军事医学科学院提供。
四、统计学处理
以组Ⅰ为参照，组Ⅱ与组Ⅲ的PAMP及NO血浆间接含量变化值百分数的差异分别采用t检验及秩和检验进行统计学处理。
结果
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一、L-NAME对缺氧大鼠PAMP的影响
与组Ⅰ相比，组Ⅲ大鼠PAMP上升百分数(58%±12%)明显高于组Ⅱ大鼠PAMP上升百分数(34%±15%)，其差异有非常显著意义(t=3.013，P<0.01)(附表)。
附表 大鼠PAMP及血浆NO间接含量(
±s) 组别例数
PAMP(kPa)
ΔPAMP(%)
NO(μmol/L)
ΔNO(%)
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6
2.05±0.13---
4.75±0.17---
组Ⅱ
6
2.71±0.29
34±15
4.15±0.49
12±12
组Ⅲ
6
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58±12*
2.93±0.20
38±4**
Δ：变化值下降百分数(与组Ⅰ参照)；与组Ⅱ相比较，*P<0.01，**0.05>P>0.02
二、L-NAME对缺氧大鼠血浆NO的影响
与组Ⅰ相比，组Ⅲ大鼠血浆NO下降百分数(38%±4%)明显大于组Ⅱ大鼠血浆NO下降百分数(12%±12%)，其差异有显著意义(t=27，0.05>P>0.02)(附表)。讨论
内皮细胞在调节缺氧性肺动脉高压中的作用日益受到重视[7]。在血管内皮细胞合成的多种物质中，NO是近年来人们广泛关注的新型信使分子。研究表明，在内皮细胞内，L-精氨酸经一氧化氮合酶催化生成NO[8]，后者能激活肺动脉的鸟苷酸环化酶，使其环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)水平升高，从而进一步激活cGMP依赖性的蛋白激酶，导致肌浆球蛋白(myosin)轻链的脱磷酸化，使平滑肌舒张[9]。Adnot等[2]的研究还发现大鼠慢性缺氧可使肺血管释放NO减少。因此人们推测在慢性缺氧时，NO的释放受累可能参与慢性缺氧性肺动脉高压的形成机制。但尚缺乏实验研究资料对此加以证实。
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本研究在整体大鼠慢性缺氧性肺动脉高压模型上，将肺动脉血液动力学资料与NO代谢产物含量同步测定分析，比较组Ⅱ及组Ⅲ肺动脉压力及NO代谢产物含量与组Ⅰ结果的变化率。这种设计方法可将空气中NO对肺动脉压力及NO代谢产物含量的影响因素控制齐同。结果表明，大鼠缺氧2周形成慢性缺氧性肺动脉高压时，血浆NO水平平均下降12%.当对缺氧大鼠同时予以体内血管最强的一种新的一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME后，血浆NO水平进一步降低(38%)(0.05>P>0.02)，同时伴随肺动脉压力的再度升高(58%±12%、34%±15%，P<0.01)，推测大鼠慢性缺氧时NO的释放减少可能参与缺氧性肺动脉高压的形成。同时NO体系对其起着重要的调节作用。
NO调节慢性缺氧性肺动脉高压的途径还不十分清楚，可能是由于抑制了血管收缩物质(如内皮素)的释放所致。硝酸甘油和硝普钠目前被认为是通过释放NO而发挥其药理作用的。Saijonmaa等[10]的研究发现，硝酸甘油和硝普钠可以抑制人脐静脉内皮细胞分泌内皮素-1;而且还发现内皮细胞内cGMP升高也可以抑制内皮素-1的分泌，而NO可以激活鸟苷酸环化酶使细胞内cGMP升高，提示NO可抑制内皮素-1的分泌。此外NO调节慢性缺氧性肺动脉高压也可能是通过拮抗了缩血管物质的作用所致。
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参考文献
1 杜军保，主编.缺氧性肺动脉高压.北京:北京医科大学-中国协和医科大学联合出版社，1994.24-63.
2 Adnot S, Raffestin B, Eddam ibi S, et al. Loss of endothelium-dependent relaxant activity in the pulmonary circulation of rats exposed to chronic hypoxia. J Clin Invest, 1991,87:155-162.
3 Kelm M, Feelisch M, Spahr R, et al. Quantitative and kinetic characterization of nitric oxide and EDRF released from cultured endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 1988, 154:236-244.
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4 Ignarro LJ, Harbison RG, Wood KS, et al. Activation of purified soluble guanylate cyclase by endothelium-derived relaxing factor from intrapulmonary artery and vein:stimulation by acetylcholin, bradykinin and arachidonic acid. J Pharmacol Exp Ther, 1986, 237: 893-900.
5 Ignarro LJ, Russell EB, Keith SW, et al. Endothelium-dependent modulation of cGMP levels and intrinsic smooth muscle tone in isolated bovine intrapulmonary artery and vein. Circ Res, 1987,60:82-92.
, http://www.100md.com
6 孙波, 孙文利. 右心导管测定大鼠肺动脉压的实验方法. 中国医学科学院学报, 1984, 6:465-467.
7 Fineman JR, Chang R, Soifer SJ. EDRF inhibition augments pulmonary hypertension in intact newborn lambs. Am J Physiol, 1992, 262: H 1365-1371.
8 Moncada S, Higgs EA, Hodson HF, et al. The L-arginine: nitric oxide pathway. J Cardiovasc Pharmacol, 1991,17(Suppl 3): 1-9.
9 Ignarro LJ. Biological action and properties of endothelium-derived nitric oxide formed and released from artery and vein. Circ Res, 1989,65:1-21.
10 Saijonmaa O, Ristimaki A, Fyhrquist F. Atrial natriuretic peptide, nitroglycerin, and nitroprusside reduce basal and stimulated endothelin production from cultured endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 1990,173:514-520.
(收稿：1997-01-15 修回：1997-10-31), http://www.100md.com