Tamm-Horsfall蛋白诱导肾小管间质性肾炎发病机理探讨
作者：张成 柳文鉴
单位：510632 广州，暨南大学医学院附属华侨医院儿科(第一作者现在519000 珠海市人民医院儿科)
关键词：肾炎；间质性；糖蛋白类；T淋巴细胞；免疫表型分型
中华儿科杂志980205.htm 【摘要】 目的 探讨Tamm-Horsfall蛋白(THP)致肾小管间质性肾炎(TIN)的发病机理。方法 采用流式细胞仪测定了19只经肾内注射THP建立的大鼠TIN模型的外周血T淋巴细胞免疫表型(CD4，CD8，CD25，Ia抗原)的表达，并应用免疫荧光技术定性观察了5只大鼠肾脏TIN病灶局部浸润的T淋巴细胞亚群。结果 于肾脏注射THP第14天，模型组外周血CD+4，CD+8-CD+25，CD+8-Ia+细胞及CD4/CD8比值较对照组升高(P<0.05)，此时肾脏TIN病灶局部浸润的T淋巴细胞表型大多数显示CD+8。结论 效应杀伤性T细胞介导的细胞毒作用在THP致肾脏免疫损伤过程中可能起重要作用。
, http://www.100md.com
Mechanisms of Tamm-Horsfall protein induced tubulointerstitial nephritis Zhang Cheng, Liu Wenjian, Department of Pediatrics, Affiliated Hospital, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632
【Abstract】 Objective To investigate the role of cellular immunity in the mechanism of tubulointerstitial nephritis (TIN) caused by Tamm-Horsfall protein. Methods The authors applied flow cytometer (FCM) and immunofluorescence to study the expression of lymphocyte phenotype (CD4, CD8, CD25, Ia) from the peripheral blood in TIN rats and the subset of T lymphocytes in the renal interstitium. Results Expressions of CD4, CD8-CD25, CD8-Ia of the TIN group were higher than those of the control group at the 14th day after renal injection (P<0.05), and so was CD4/CD8. The infiltrating T lymphocytes in the renal interstitium mainly expressed CD8. Conclusion Tc-mediated cytotoxicity might be an important cause of TIN.
, 百拇医药
【Key words】 Nephritis, intertitial Glycoproteins T-Lymphocyte Immunophenotyping
近年临床和实验研究证实，在膀胱输尿管返流和尿路梗阻等病理状态下，Tamm-Horsfall蛋白(THP)可通过破损的肾小管进入肾间质，激发自身免疫反应而引起肾小管间质性肾炎(TIN)[1]，而THP诱导TIN的作用机理尚未完全明了。作者通过流式细胞仪测定肾内注射THP建立的大鼠模型外周血T淋巴细胞表型变化，以及采用免疫荧光技术对TIN局部浸润的T淋巴细胞亚群进行分类，对其可能的发病机理进行探讨。
材料和方法
一、尿THP的提取及鉴定
参照Tamm-Horsfall原法[2]，并略加改进。在正常成年男性新鲜中段尿中加入氯化钠，使浓度为0.58 mol/L，置4℃沉淀48小时，透析后获得无色透明的粘性液体，冻干、低温保存。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及1%琼脂糖双向免疫扩散实验对其进行鉴定。
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二、实验方法
1.动物分组：雄性Wistar大鼠，体重180～200 g(第一军医大学动物实验中心提供)，共19只，随机分为两组：TIN组：9只，肾内注射THP；对照组：10只，肾内注射去除THP的尿液。
2.模型制作：参照宋青等[3]原法，首先进行动物预免疫，将250 μg/ml的THP溶液与等量福氏完全佐剂充分混合后，在TIN组动物双侧腋下和足底皮下多点注射，每只1 ml，共1次。对照组给予去除THP尿液与福氏完全佐剂的混合液，注射部位及剂量同上。预免疫一周后，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，经右背部脊柱旁切口暴露右肾，TIN组用0.1 ml THP溶液(125 μg/ml)，在肾上、下极多点注射，局部压迫止血后缝合。对照组采用去除THP的尿液，方法同前。
3.观察指标：(1)肾组织病理学检查：于术后第14天杀鼠(共19只)取患肾，解剖后常规甲醛固定，石蜡包埋、切片、HE染色、光镜观察；(2)外周血T淋巴细胞亚群及活化状态的观察：于术后第7、第14天截尾留取外周血，用免疫荧光双抗体、双标记方法处理后[4]，通过流式细胞仪检查T细胞CD4、CD8、CD25、Ia抗原表达；(3)肾组织炎症灶淋巴细胞亚群定性观察：采用免疫荧光法；(4)血清抗THP抗体测定：采用琼脂糖双向免疫扩散法进行。
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三、实验材料及仪器
小鼠抗大鼠CD4单克隆抗体(简称单抗)，小鼠抗大鼠CD25单抗、小鼠抗大鼠Ia单抗均购自北京邦定生物医学公司。小鼠抗大鼠CD8单抗(标有FITC)、羊抗小鼠IgG1桥联PE均购自Serotec公司。羊抗小鼠IgG1桥联FITC购自武汉生物制品研究所。兔抗人THP IgG由中国原子能科学研究院同位素所提供。流式细胞仪为FACStar plus，美国B.D公司产品。
结果
一、肾组织病理学改变
TIN组全部动物均发生了TIN，光镜下主要表现为注射部位的局灶性间质炎症细胞浸润，以单核、淋巴细胞为绝大多数，炎症灶中心肾小管结构破坏消失，部分肾小管完全被炎症细胞包围，小管细胞可见浊肿及空泡变性，表明模型建立成功。对照组仅1只鼠于肾内注射局部出现轻度炎症细胞浸润，其余均未发现异常。
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二、外周血淋巴细胞免疫表型变化(附表)
术后第7天TIN组与对照组相比，CD+4细胞、CD+8细胞及CD4/CD8比值，差异均无显著意义；而TIN组CD+8-Ia+细胞较对照组有所升高，但差异无显著意义(P>0.05)。术后第14天，TIN组CD+4细胞、CD4/CD8比值、CD+8-CD+25细胞及CD+8-Ia+细胞较对照组均升高(P<0.05)；而CD+8细胞无变化。对照组第7、14天CD4、CD4/CD8比值及CD+8-Ia+细胞的变化，考虑系手术创伤及福氏完全佐剂等因素对大鼠免疫系统的综合影响所致。
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三、肾病灶局部浸润淋巴细胞亚群定性观察
在肾病灶局部浸润淋巴细胞中，CD+8细胞占大多数。
四、血清抗THP抗体滴度测定
应用双向免疫扩散法对各组共19份血清标本测定，均未测出其抗体滴度。
附表 外周血淋巴细胞免疫表型的表达(
±s，%)
免疫表型
术后第7天
术后第14天
TIN组
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对找组
TIN组
对照组
CD4
51.0±8.4
56.0±10.1
50.0±5.5*
31.6±12.7
CD8
32.8±4.4
35.9±7.7
32.4±8.2
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35.2±10.9
CD4/CD8
1.6±0.4
1.7±0.6
1.7±0.6*
1.0±0.5
CD+8、Ia+
12.0±3.3
8.9±3.9
32.2±9.5*
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22.3±7.8
CD+8/CD+25
3.3±3.0
4.6±1.6
10.6±5.2*
3.8±2.3
*与对照组比较P<0.05
讨论
THP是一种大分子糖蛋白，由肾小管髓袢升支粗段细胞及远曲小管上皮细胞合成和分泌，正常人每天尿中含有一定量的THP。许多研究发现，THP与某些肾脏疾病(如返流性肾病、慢性肾小管间质性肾炎、慢性肾盂肾炎、梗阻性肾病等)的发病及进展有关，在这类病理状态下，肾间质可见THP的异常沉积，有些在循环中还可测得抗THP抗体，给动物静脉或肾内注射THP也可引起类似的TIN。目前认为，沉积于肾小管外的THP能触发自身免疫反应而导致TIN，由于大多数模型间质炎症灶以单核、淋巴细胞浸润为主，而血中只测到低中滴度的抗THP抗体，肾间质也未发现免疫复合物及补体等成分的沉积，用抑制细胞免疫的药物——环孢素A可阻断THP诱导TIN的作用。故大多数学者认为，在THP免疫发病机理中，细胞免疫可能起主要作用。我们的实验结果亦支持这种观点。
, 百拇医药
在THP致TIN的发病过程中，TIN组外周血T细胞亚群的变化及不同分化抗原的表达，表明细胞免疫系统的激活和调动。我们知道，CD+4和CD+8T细胞在功能上相互拮抗，调节免疫应答过程的进展，保持免疫系统功能上的平衡。注射THP第14天，TIN组较对照组外周血CD+4细胞增多，CD+4/CD+8比值升高，表明此时免疫系统功能紊乱，出现了T淋巴细胞的免疫应答反应。第7天外周血T淋巴细胞未出现变化，考虑可能由于此时病灶较小，外周血中尚不能显示出来，或存在一个抗原提呈，T细胞活化、增殖的时序过程。
CD25为白细胞介素2(IL-2)受体，相当于人类MHC-Ⅱ类抗原，它主要选择性地在B细胞和抗原提呈细胞(如巨噬细胞、树突状细胞)上表达，但以后证实Ⅱ类抗原也可在其他组织细胞(内皮细胞、精子、激活的T细胞等)表达。关于T细胞表面Ia抗原的表达，目前比较一致的看法是静止期T细胞表面检测不出Ia抗原，T细胞活化后能合成Ia抗原，并在细胞表面表达该Ia抗原。所以T细胞表面Ia抗原的出现，是某些T细胞亚群有选择性被激活的重要标志[5]。在我们的实验中，TIN组外周血CD+8-CD+25细胞及CD+8-Ia+细胞于术后第14天与对照组比较明显升高(P<0.05)，表明CD+8细胞被激活。有人报道，接受THP静脉注射的新西兰白兔的外周血淋巴细胞在THP存在时，可对靶细胞产生细胞毒作用。作者应用免疫荧光技术发现，局部浸润的T淋巴细胞大多数显示CD+8，由此推测，局部浸润的T淋巴细胞可能主要为效应杀伤性T细胞，在THP存在下，可杀伤靶细胞引起肾脏免疫损伤，即效应杀伤性T细胞介导的细胞毒作用。由于条件所限，作者没有观察CD+4细胞表达CD25、Ia抗原的情况，CD+4细胞是否激活，尚待进一步证实。
, 百拇医药
参考文献
1 Andriole VT. The role of Tamm-Horsfall protein in the pathogenesis of reflux nephnropathy and chronic pyelonephritis. Yale J Biol Med, 1985, 58:91-94.
2 Tamm I, Horsfall FL. A mucoprotien drived from human urine which reacts with influenza, mumps, and Newcastle disease viruses. J Exp Med, 1952, 95:71-74.
3 宋青，叶任高.用Tamm-Horsfall蛋白制作肾小管间质性肾炎动物模型及意义.中华肾脏病杂志，1991，7：348-350.
4 Gee AP. Preparation of samples for flow cytometric analysis. J Hematotherapy 1993, 2:413-414.
5 程晋，田增爵.SLE患者AMLR与T细胞Ia抗原的改变及意义.免疫学杂志，1994，10：37-39.
(收稿：1996-09-25 修回：1997-05-22), http://www.100md.com
单位：510632 广州，暨南大学医学院附属华侨医院儿科(第一作者现在519000 珠海市人民医院儿科)
关键词：肾炎；间质性；糖蛋白类；T淋巴细胞；免疫表型分型
中华儿科杂志980205.htm 【摘要】 目的 探讨Tamm-Horsfall蛋白(THP)致肾小管间质性肾炎(TIN)的发病机理。方法 采用流式细胞仪测定了19只经肾内注射THP建立的大鼠TIN模型的外周血T淋巴细胞免疫表型(CD4，CD8，CD25，Ia抗原)的表达，并应用免疫荧光技术定性观察了5只大鼠肾脏TIN病灶局部浸润的T淋巴细胞亚群。结果 于肾脏注射THP第14天，模型组外周血CD+4，CD+8-CD+25，CD+8-Ia+细胞及CD4/CD8比值较对照组升高(P<0.05)，此时肾脏TIN病灶局部浸润的T淋巴细胞表型大多数显示CD+8。结论 效应杀伤性T细胞介导的细胞毒作用在THP致肾脏免疫损伤过程中可能起重要作用。
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Mechanisms of Tamm-Horsfall protein induced tubulointerstitial nephritis Zhang Cheng, Liu Wenjian, Department of Pediatrics, Affiliated Hospital, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632
【Abstract】 Objective To investigate the role of cellular immunity in the mechanism of tubulointerstitial nephritis (TIN) caused by Tamm-Horsfall protein. Methods The authors applied flow cytometer (FCM) and immunofluorescence to study the expression of lymphocyte phenotype (CD4, CD8, CD25, Ia) from the peripheral blood in TIN rats and the subset of T lymphocytes in the renal interstitium. Results Expressions of CD4, CD8-CD25, CD8-Ia of the TIN group were higher than those of the control group at the 14th day after renal injection (P<0.05), and so was CD4/CD8. The infiltrating T lymphocytes in the renal interstitium mainly expressed CD8. Conclusion Tc-mediated cytotoxicity might be an important cause of TIN.
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【Key words】 Nephritis, intertitial Glycoproteins T-Lymphocyte Immunophenotyping
近年临床和实验研究证实，在膀胱输尿管返流和尿路梗阻等病理状态下，Tamm-Horsfall蛋白(THP)可通过破损的肾小管进入肾间质，激发自身免疫反应而引起肾小管间质性肾炎(TIN)[1]，而THP诱导TIN的作用机理尚未完全明了。作者通过流式细胞仪测定肾内注射THP建立的大鼠模型外周血T淋巴细胞表型变化，以及采用免疫荧光技术对TIN局部浸润的T淋巴细胞亚群进行分类，对其可能的发病机理进行探讨。
材料和方法
一、尿THP的提取及鉴定
参照Tamm-Horsfall原法[2]，并略加改进。在正常成年男性新鲜中段尿中加入氯化钠，使浓度为0.58 mol/L，置4℃沉淀48小时，透析后获得无色透明的粘性液体，冻干、低温保存。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及1%琼脂糖双向免疫扩散实验对其进行鉴定。
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二、实验方法
1.动物分组：雄性Wistar大鼠，体重180～200 g(第一军医大学动物实验中心提供)，共19只，随机分为两组：TIN组：9只，肾内注射THP；对照组：10只，肾内注射去除THP的尿液。
2.模型制作：参照宋青等[3]原法，首先进行动物预免疫，将250 μg/ml的THP溶液与等量福氏完全佐剂充分混合后，在TIN组动物双侧腋下和足底皮下多点注射，每只1 ml，共1次。对照组给予去除THP尿液与福氏完全佐剂的混合液，注射部位及剂量同上。预免疫一周后，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，经右背部脊柱旁切口暴露右肾，TIN组用0.1 ml THP溶液(125 μg/ml)，在肾上、下极多点注射，局部压迫止血后缝合。对照组采用去除THP的尿液，方法同前。
3.观察指标：(1)肾组织病理学检查：于术后第14天杀鼠(共19只)取患肾，解剖后常规甲醛固定，石蜡包埋、切片、HE染色、光镜观察；(2)外周血T淋巴细胞亚群及活化状态的观察：于术后第7、第14天截尾留取外周血，用免疫荧光双抗体、双标记方法处理后[4]，通过流式细胞仪检查T细胞CD4、CD8、CD25、Ia抗原表达；(3)肾组织炎症灶淋巴细胞亚群定性观察：采用免疫荧光法；(4)血清抗THP抗体测定：采用琼脂糖双向免疫扩散法进行。
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三、实验材料及仪器
小鼠抗大鼠CD4单克隆抗体(简称单抗)，小鼠抗大鼠CD25单抗、小鼠抗大鼠Ia单抗均购自北京邦定生物医学公司。小鼠抗大鼠CD8单抗(标有FITC)、羊抗小鼠IgG1桥联PE均购自Serotec公司。羊抗小鼠IgG1桥联FITC购自武汉生物制品研究所。兔抗人THP IgG由中国原子能科学研究院同位素所提供。流式细胞仪为FACStar plus，美国B.D公司产品。
结果
一、肾组织病理学改变
TIN组全部动物均发生了TIN，光镜下主要表现为注射部位的局灶性间质炎症细胞浸润，以单核、淋巴细胞为绝大多数，炎症灶中心肾小管结构破坏消失，部分肾小管完全被炎症细胞包围，小管细胞可见浊肿及空泡变性，表明模型建立成功。对照组仅1只鼠于肾内注射局部出现轻度炎症细胞浸润，其余均未发现异常。
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二、外周血淋巴细胞免疫表型变化(附表)
术后第7天TIN组与对照组相比，CD+4细胞、CD+8细胞及CD4/CD8比值，差异均无显著意义；而TIN组CD+8-Ia+细胞较对照组有所升高，但差异无显著意义(P>0.05)。术后第14天，TIN组CD+4细胞、CD4/CD8比值、CD+8-CD+25细胞及CD+8-Ia+细胞较对照组均升高(P<0.05)；而CD+8细胞无变化。对照组第7、14天CD4、CD4/CD8比值及CD+8-Ia+细胞的变化，考虑系手术创伤及福氏完全佐剂等因素对大鼠免疫系统的综合影响所致。
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三、肾病灶局部浸润淋巴细胞亚群定性观察
在肾病灶局部浸润淋巴细胞中，CD+8细胞占大多数。
四、血清抗THP抗体滴度测定
应用双向免疫扩散法对各组共19份血清标本测定，均未测出其抗体滴度。
附表 外周血淋巴细胞免疫表型的表达(
±s，%)免疫表型
术后第7天
术后第14天
TIN组
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对找组
TIN组
对照组
CD4
51.0±8.4
56.0±10.1
50.0±5.5*
31.6±12.7
CD8
32.8±4.4
35.9±7.7
32.4±8.2
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35.2±10.9
CD4/CD8
1.6±0.4
1.7±0.6
1.7±0.6*
1.0±0.5
CD+8、Ia+
12.0±3.3
8.9±3.9
32.2±9.5*
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22.3±7.8
CD+8/CD+25
3.3±3.0
4.6±1.6
10.6±5.2*
3.8±2.3
*与对照组比较P<0.05
讨论
THP是一种大分子糖蛋白，由肾小管髓袢升支粗段细胞及远曲小管上皮细胞合成和分泌，正常人每天尿中含有一定量的THP。许多研究发现，THP与某些肾脏疾病(如返流性肾病、慢性肾小管间质性肾炎、慢性肾盂肾炎、梗阻性肾病等)的发病及进展有关，在这类病理状态下，肾间质可见THP的异常沉积，有些在循环中还可测得抗THP抗体，给动物静脉或肾内注射THP也可引起类似的TIN。目前认为，沉积于肾小管外的THP能触发自身免疫反应而导致TIN，由于大多数模型间质炎症灶以单核、淋巴细胞浸润为主，而血中只测到低中滴度的抗THP抗体，肾间质也未发现免疫复合物及补体等成分的沉积，用抑制细胞免疫的药物——环孢素A可阻断THP诱导TIN的作用。故大多数学者认为，在THP免疫发病机理中，细胞免疫可能起主要作用。我们的实验结果亦支持这种观点。
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在THP致TIN的发病过程中，TIN组外周血T细胞亚群的变化及不同分化抗原的表达，表明细胞免疫系统的激活和调动。我们知道，CD+4和CD+8T细胞在功能上相互拮抗，调节免疫应答过程的进展，保持免疫系统功能上的平衡。注射THP第14天，TIN组较对照组外周血CD+4细胞增多，CD+4/CD+8比值升高，表明此时免疫系统功能紊乱，出现了T淋巴细胞的免疫应答反应。第7天外周血T淋巴细胞未出现变化，考虑可能由于此时病灶较小，外周血中尚不能显示出来，或存在一个抗原提呈，T细胞活化、增殖的时序过程。
CD25为白细胞介素2(IL-2)受体，相当于人类MHC-Ⅱ类抗原，它主要选择性地在B细胞和抗原提呈细胞(如巨噬细胞、树突状细胞)上表达，但以后证实Ⅱ类抗原也可在其他组织细胞(内皮细胞、精子、激活的T细胞等)表达。关于T细胞表面Ia抗原的表达，目前比较一致的看法是静止期T细胞表面检测不出Ia抗原，T细胞活化后能合成Ia抗原，并在细胞表面表达该Ia抗原。所以T细胞表面Ia抗原的出现，是某些T细胞亚群有选择性被激活的重要标志[5]。在我们的实验中，TIN组外周血CD+8-CD+25细胞及CD+8-Ia+细胞于术后第14天与对照组比较明显升高(P<0.05)，表明CD+8细胞被激活。有人报道，接受THP静脉注射的新西兰白兔的外周血淋巴细胞在THP存在时，可对靶细胞产生细胞毒作用。作者应用免疫荧光技术发现，局部浸润的T淋巴细胞大多数显示CD+8，由此推测，局部浸润的T淋巴细胞可能主要为效应杀伤性T细胞，在THP存在下，可杀伤靶细胞引起肾脏免疫损伤，即效应杀伤性T细胞介导的细胞毒作用。由于条件所限，作者没有观察CD+4细胞表达CD25、Ia抗原的情况，CD+4细胞是否激活，尚待进一步证实。
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参考文献
1 Andriole VT. The role of Tamm-Horsfall protein in the pathogenesis of reflux nephnropathy and chronic pyelonephritis. Yale J Biol Med, 1985, 58:91-94.
2 Tamm I, Horsfall FL. A mucoprotien drived from human urine which reacts with influenza, mumps, and Newcastle disease viruses. J Exp Med, 1952, 95:71-74.
3 宋青，叶任高.用Tamm-Horsfall蛋白制作肾小管间质性肾炎动物模型及意义.中华肾脏病杂志，1991，7：348-350.
4 Gee AP. Preparation of samples for flow cytometric analysis. J Hematotherapy 1993, 2:413-414.
5 程晋，田增爵.SLE患者AMLR与T细胞Ia抗原的改变及意义.免疫学杂志，1994，10：37-39.
(收稿：1996-09-25 修回：1997-05-22), http://www.100md.com
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