原核生物16S rDNA的PCR-ELISA检测方法的研究
作者：刘吉荣 吴婉芳 秦雨春 张玉 马官福 郭章溉 张梓荆
单位：100020 首都儿科研究所
关键词：核酸探针；DNA；核糖体；聚合酶链反应
中华儿科杂志/980414
【摘要】 目的 建立一种可以用于支原体、细菌等原核生物感染的快速诊断方法。方法 根据原核生物16S rDNA独特的序列特性，通过聚合酶链反应(PCR)扩增16S rDNA,扩增产物与结合在酶联免疫吸附反应(ELISA)板上的特异性探针杂交，经酶显色，计算吸光度比值来检测标本。以肺炎支原体为例，对上述方法进行了特异性、重复性、敏感性等方面的检验。结果 (1)多种原核生物均可扩增出16S rDNA；(2)各种原核生物的16S rDNA片断仅与其特异性探针杂交；(3)经3次重复杂交试验结果均相同；(4)对肺炎支原体感染流行期所取标本进行对照检验，PCR-ELISA方法检出率与传统PCR方法差异无显著意义。结论 利用原核生物16S rDNA序列特性的PCR-ELISA方法具有特异性高、重复性好、灵敏度高等优点，是一种可检测原核生物感染的快速诊断方法。
, 百拇医药
Development of PCR-ELISA based on 16S rDNA for diagnosis of prokaryotic organism infection
Liu Jirong, Wu Wanfang, Qin Yuchun, et al.
Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020
【Abstract 】 Objective To develop a rapid diagnostic method for prokaryotic organism infection. Method Based on unique sequence characteristics of 16S rDNA, the rDNA was first amplified by polymerase chain reaction(PCR), then the amplified product was hybridized to specific probe bound to ELISA plate, hybrid product was detected by horseradish peroxidase labeled probe. Ratio of A620 between test and control was used for positive/negative determination. Taken Mycoplasma pneumoniae (Mp) as an example, PCR-ELISA was examined for its specificity, sensitivity and reproducibility. Result (1) 16S rDNA could be amplified from multiple prokaryotic organisms; (2) the 16S rDNA from various prokaryotic organisms hybridized with only the specific probe; (3) the results of 3 re-hybridization were the same; there was no significant diference between the positivity rates of the PCR-ELISA and conventional PCR performed on specimens collecfed during an Mp epidemic. Conclusion The PCR-ELISA based on unique sequence characteristics of 16S rDNA is a meethod with high sensitivity, high specificity and good reproducibility. The PCR-ELISA is a rapid diagnostic method for prokaryotic organism infection.
, 百拇医药
【Key words 】 【Key words 】 Nucleic acid probes Sequence analysis, DNA DNA, spacer Polymerase chain reaction method
聚合酶链反应(PCR)因其高度的特异性和灵敏度，已经开始广泛用于临床疾病的研究和诊断，但由于每一种病原进行PCR检测时其反应条件不同，使对临床标本多种病原的同时检测受到限制;同时临床标本和实验室操作时的污染也是PCR检测应用中的一大难题。为此我们利用原核生物核糖体16S核糖核酸基因(16S rDNA)序列的一些特性，建立了聚合酶链反应-酶联免疫吸附(PCR-ELISA)检测方法，并在肺炎支原体的检测中进行了初步应用。
材料和方法
一、材料
1.探针及主要试剂:PCR引物和寡核苷酸探针:参照有关文献由北京赛百盛公司合成。
, 百拇医药
16S rDNA PCR引物:上游:5′GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG3′。下游:5′TTA CCG CGG CTG CTG GCA CGT3′。
肺炎支原体特异性探针序列为:5′磷酸CTC CCA TTA CCT GCT AA3′。
PCR所需的酶及其他试剂均购自有关公司;肺炎支原体PCR试剂盒购自华美生物工程公司;电泳用琼脂糖购自北京中山生物技术公司。(3)肺炎支原体标准株由我所细菌室提供;其他菌株均为本室保存。
2.检测标本:一次肺炎支原体感染流行期间门诊收集的21份咽拭子标本。
二、方法
1.尼龙包被的ELISA板的制备及肺炎支原体特异性探针与ELISA板的结合方法:尼龙-6经浓盐酸水解16～18小时,经水洗至中性并经干燥后,溶于间甲酚中,经70%酒精1∶6稀释,加入酶免疫反应板中,使每孔尼龙-6的量为100 μg,然后每孔加入肺炎支原体特异性探针0.1 μg,水溶性碳二亚胺使其终浓度为0.05 mol/L, 总体积为100 μl,于50℃反应5小时。详见文献[1]。
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2. 样本处理和16S rDNA PCR扩增条件:标准株和临床标本的PCR前处理均为先加入蒸馏水，经12 000 r/min离心10分钟，弃上清，再加入20～50 μl蒸馏水， 与95℃煮10分钟后， 离心10分钟， 取2 μl行PCR。PCR条件:引物0.2 μmol/L，dNTP 0.2 mmol/L， MgCl2为1.5 mmol/L，KCl为50 mmol/L， Taq酶为2单位/100 μl。94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，35个循环。
3. 16S rDNA扩增产物与ELISA板结合的特异性探针的杂交及结果判定:PCR产物经95℃变性5分钟后立即置于冰浴中, 然后向包被好的ELISA板中每孔加入2 μl, 杂交缓冲液98 μl, 于42℃杂交30分钟, 然后加入经杂交缓冲液稀释的生物素标记探针,每孔0.1 μg,杂交30分钟后,加入辣根过氧化物酶标记的卵清蛋白显色,测定波长为620 nm时的吸光度(A620值，曾称光密度OD值)，以大肠杆菌为阴性对照，求得A620比值，凡大于2.0者，可视为阳性结果[1～3]。
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4.肺炎支原体探针特异性的检测：向包被有肺炎支原体特异性探针的ELISA板中，分别加入肺炎支原体、大肠杆菌、流感嗜血杆菌和葡萄球菌染色体DNA的PCR扩增产物，重复杂交过程，以了解PCR-ELISA的特异性。
5.肺炎支原体PCR-ELISA敏感性试验：将实验室培养的肺炎支原体标准株，经10倍倍比稀释后,进行PCR，再用PCR扩增产物重复杂交过程，以了解PCR-ELISA的敏感性。
6.肺炎支原体PCR-ELISA竞争性试验:将实验培养的肺炎支原体标准株，经10倍倍比稀释后，分别加入已知数量的大肠杆菌菌液中，使肺炎支原体:大肠杆菌的比例从1∶10至1∶100 000，再进行PCR扩增反应，用扩增产物重复杂交过程，以了解PCR-ELISA是否可以在任何比例均获得阳性结果。
结果
1.PCR引物的通用性:利用16S rDNA中与所有原核生物均共同的序列合成的一对引物，对肺炎支原体，革兰阴性的大肠杆菌、流感嗜血杆菌，革兰阳性的葡萄球菌和厌氧的双歧杆菌等的染色体进行了扩增，均可见到550bp左右的DNA片断，说明该对引物对临床常见的原核生物的16S rDNA均可扩增,结果见附图。
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1.PCR marker；2.流感嗜血杆菌；3.肺炎支原体；4.大肠杆菌；5.肠球菌；6.金黄色葡萄球菌；7.肺炎双球菌；8.双歧杆菌；9.拟杆菌
附图 用通用引物扩增各种原核生物的染色体DNA所得的片断
2.肺炎支原体探针特异性的检测结果:经对肺炎支原体、大肠杆菌、流感嗜血杆菌和葡萄球菌染色体16S rDNA扩增产物进行检测，除肺炎支原体外，其余A620比值均小于2.0,表明该探针对肺炎支原体是特异性的。
3.肺炎支原体PCR-ELISA重复试验结果:用肺炎支原体16S rDNA PCR扩增产物，重复杂交过程3次，每次均为2孔，A620比值均大于2.0,表明该方法重复性较好。
4.肺炎支原体PCR-ELISA敏感性试验结果:于107倍稀释、相当于每毫升10～100个支原体时仍然可见到扩增的产物，用上述扩增产物进行杂交反应，其A620值为0.13～0.17，大肠杆菌A620值为0.045，两者A620比值均大于2.0，表明在无其他原核生物染色体DNA竞争时，PCR-ELISA的灵敏度与传统的PCR一致。
, 百拇医药
5.肺炎支原体PCR-ELISA竞争性试验结果:只有肺炎支原体∶大肠杆菌数量比值大于1∶100时，A620比值才大于2.0(附表)，表明只有当被检验微生物达到一定比例后方能出现阳性结果。
6.PCR-ELISA与传统PCR对21份咽拭子标本的检测结果比较:传统PCR有18份标本检出肺炎支原体阳性，阳性检出率为85.7%;PCR-ELISA有16份阳性，其余5例阴性,阳性检出率为76.2%。二者阳性检出率比较差异无显著意义(χ2=0.154,P>0.05)。
附表 不同含量的肺炎支原体PCR-ELISA的A620比值 肺炎支原体∶
大肠杆菌(数量比)
实验组∶大肠杆菌组
(A620比值)
, 百拇医药
纯肺炎支原体
2.50
1∶10
3.50
1∶100
3.25
1∶1 000
1.25
1∶10 000
1.50
1∶100 000
0.50
讨论
, 百拇医药
原核生物16S rDNA因其独特的序列特性，已经被广泛用于原核生物的检测，如医学检验，环境监测和原核生物的分类等[4,5]。几乎已经测定了每一种原核生物的16S rDNA基因序列，16S rDNA长度为1 600bp左右，每一种原核生物其长度略有差异，如大肠杆菌为1541bp。16S rDNA基因序列可以分为所有原核生物均相同的保守序列、种属特异性的半保守序列和菌种特异性的序列。
我们根据原核生物16S rDNA序列的保守序列合成了一对引物，用来扩增一段500bp左右的16S rDNA片断，其中包含有特异性的高变区V2和V3区，将扩增产物经变性与结合在ELISA板上的特异性探针杂交后，经酶显色，根据被检测原核生物与阴性对照的A620比值，凡比值大于2.0者，可视为阳性。从理论上来说，可以选择其它任何一种原核生物作为检测另一种探针的阴性对照，但目前PCR所用的Taq酶均来自大肠杆菌，因此有可能有大肠杆菌染色体DNA混杂在酶中，因此，我们选择大肠杆菌作为阴性对照。
, http://www.100md.com
由于PCR-ELISA中PCR引物是根据所有原核生物均相同的保守序列所设计的，因此不同原核生物的DNA模板可以与引物竞争结合，DNA模板量相对越高，与引物结合就相对越多，再经PCR扩增过程的几何级放大，会使不同模板之间量的差异更进一步扩大。我们试验结果表明只有当肺炎支原体∶大肠杆菌的数量比例大于1∶100时，才能得到肺炎支原体的阳性结果。
传统的PCR一次仅能检测一种病原，而基于16S rDNA基因序列的PCR-ELISA方法，先将标本中的16S rDNA基因扩增，然后再与ELISA板上的多种特异性探针杂交，根据与阴性对照的A620比值，就可以得知是哪种原核生物的感染。我们对肺炎支原体的检测结果，说明了这种方法的可行性，为进一步利用基于16S rDNA基因序列的PCR-ELISA进行多病原检测奠定了基础。
参考文献
1 刘吉荣，吴婉芳，秦雨春，等.核酸探针与酶免疫反应板定向结合的方法.生物化学与生物物理进展,1997,24:379-382.
, 百拇医药
2 Jomolas D， Rosenbaum A，Weyrich S， et al. Enzyme-linked immunoassay for detection of PCR-amplified DNA of legionella in bronchoalveolar fluid. J Clin Microbiol，1995,33:1247-1252.
3 Guesdon J. Immunoenzymatic techniques applied to the specific detection of nucleic acids. J Immunol Methods. 1992;150:33-49.
4 Jensen NS, Casey TA, Stanton TB. Detection and identification of Treponemola hyodysenteriae by using oligodeoxynucleotide probes comolplemolentary to 16S rRNA. J Clin Microbiol,1990,28:2717-2721.
5 Rossau R, Vanmolechelen E, Ley JD, et al. Specific Neisseria gonorrhoeae DNA-Probes derived from ribosomal RNA. J Gen Microbiol, 1989,135:1735-1745., 百拇医药
单位：100020 首都儿科研究所
关键词：核酸探针；DNA；核糖体；聚合酶链反应
中华儿科杂志/980414
【摘要】 目的 建立一种可以用于支原体、细菌等原核生物感染的快速诊断方法。方法 根据原核生物16S rDNA独特的序列特性，通过聚合酶链反应(PCR)扩增16S rDNA,扩增产物与结合在酶联免疫吸附反应(ELISA)板上的特异性探针杂交，经酶显色，计算吸光度比值来检测标本。以肺炎支原体为例，对上述方法进行了特异性、重复性、敏感性等方面的检验。结果 (1)多种原核生物均可扩增出16S rDNA；(2)各种原核生物的16S rDNA片断仅与其特异性探针杂交；(3)经3次重复杂交试验结果均相同；(4)对肺炎支原体感染流行期所取标本进行对照检验，PCR-ELISA方法检出率与传统PCR方法差异无显著意义。结论 利用原核生物16S rDNA序列特性的PCR-ELISA方法具有特异性高、重复性好、灵敏度高等优点，是一种可检测原核生物感染的快速诊断方法。
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Development of PCR-ELISA based on 16S rDNA for diagnosis of prokaryotic organism infection
Liu Jirong, Wu Wanfang, Qin Yuchun, et al.
Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020
【Abstract 】 Objective To develop a rapid diagnostic method for prokaryotic organism infection. Method Based on unique sequence characteristics of 16S rDNA, the rDNA was first amplified by polymerase chain reaction(PCR), then the amplified product was hybridized to specific probe bound to ELISA plate, hybrid product was detected by horseradish peroxidase labeled probe. Ratio of A620 between test and control was used for positive/negative determination. Taken Mycoplasma pneumoniae (Mp) as an example, PCR-ELISA was examined for its specificity, sensitivity and reproducibility. Result (1) 16S rDNA could be amplified from multiple prokaryotic organisms; (2) the 16S rDNA from various prokaryotic organisms hybridized with only the specific probe; (3) the results of 3 re-hybridization were the same; there was no significant diference between the positivity rates of the PCR-ELISA and conventional PCR performed on specimens collecfed during an Mp epidemic. Conclusion The PCR-ELISA based on unique sequence characteristics of 16S rDNA is a meethod with high sensitivity, high specificity and good reproducibility. The PCR-ELISA is a rapid diagnostic method for prokaryotic organism infection.
, 百拇医药
【Key words 】 【Key words 】 Nucleic acid probes Sequence analysis, DNA DNA, spacer Polymerase chain reaction method
聚合酶链反应(PCR)因其高度的特异性和灵敏度，已经开始广泛用于临床疾病的研究和诊断，但由于每一种病原进行PCR检测时其反应条件不同，使对临床标本多种病原的同时检测受到限制;同时临床标本和实验室操作时的污染也是PCR检测应用中的一大难题。为此我们利用原核生物核糖体16S核糖核酸基因(16S rDNA)序列的一些特性，建立了聚合酶链反应-酶联免疫吸附(PCR-ELISA)检测方法，并在肺炎支原体的检测中进行了初步应用。
材料和方法
一、材料
1.探针及主要试剂:PCR引物和寡核苷酸探针:参照有关文献由北京赛百盛公司合成。
, 百拇医药
16S rDNA PCR引物:上游:5′GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG3′。下游:5′TTA CCG CGG CTG CTG GCA CGT3′。
肺炎支原体特异性探针序列为:5′磷酸CTC CCA TTA CCT GCT AA3′。
PCR所需的酶及其他试剂均购自有关公司;肺炎支原体PCR试剂盒购自华美生物工程公司;电泳用琼脂糖购自北京中山生物技术公司。(3)肺炎支原体标准株由我所细菌室提供;其他菌株均为本室保存。
2.检测标本:一次肺炎支原体感染流行期间门诊收集的21份咽拭子标本。
二、方法
1.尼龙包被的ELISA板的制备及肺炎支原体特异性探针与ELISA板的结合方法:尼龙-6经浓盐酸水解16～18小时,经水洗至中性并经干燥后,溶于间甲酚中,经70%酒精1∶6稀释,加入酶免疫反应板中,使每孔尼龙-6的量为100 μg,然后每孔加入肺炎支原体特异性探针0.1 μg,水溶性碳二亚胺使其终浓度为0.05 mol/L, 总体积为100 μl,于50℃反应5小时。详见文献[1]。
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2. 样本处理和16S rDNA PCR扩增条件:标准株和临床标本的PCR前处理均为先加入蒸馏水，经12 000 r/min离心10分钟，弃上清，再加入20～50 μl蒸馏水， 与95℃煮10分钟后， 离心10分钟， 取2 μl行PCR。PCR条件:引物0.2 μmol/L，dNTP 0.2 mmol/L， MgCl2为1.5 mmol/L，KCl为50 mmol/L， Taq酶为2单位/100 μl。94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，35个循环。
3. 16S rDNA扩增产物与ELISA板结合的特异性探针的杂交及结果判定:PCR产物经95℃变性5分钟后立即置于冰浴中, 然后向包被好的ELISA板中每孔加入2 μl, 杂交缓冲液98 μl, 于42℃杂交30分钟, 然后加入经杂交缓冲液稀释的生物素标记探针,每孔0.1 μg,杂交30分钟后,加入辣根过氧化物酶标记的卵清蛋白显色,测定波长为620 nm时的吸光度(A620值，曾称光密度OD值)，以大肠杆菌为阴性对照，求得A620比值，凡大于2.0者，可视为阳性结果[1～3]。
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4.肺炎支原体探针特异性的检测：向包被有肺炎支原体特异性探针的ELISA板中，分别加入肺炎支原体、大肠杆菌、流感嗜血杆菌和葡萄球菌染色体DNA的PCR扩增产物，重复杂交过程，以了解PCR-ELISA的特异性。
5.肺炎支原体PCR-ELISA敏感性试验：将实验室培养的肺炎支原体标准株，经10倍倍比稀释后,进行PCR，再用PCR扩增产物重复杂交过程，以了解PCR-ELISA的敏感性。
6.肺炎支原体PCR-ELISA竞争性试验:将实验培养的肺炎支原体标准株，经10倍倍比稀释后，分别加入已知数量的大肠杆菌菌液中，使肺炎支原体:大肠杆菌的比例从1∶10至1∶100 000，再进行PCR扩增反应，用扩增产物重复杂交过程，以了解PCR-ELISA是否可以在任何比例均获得阳性结果。
结果
1.PCR引物的通用性:利用16S rDNA中与所有原核生物均共同的序列合成的一对引物，对肺炎支原体，革兰阴性的大肠杆菌、流感嗜血杆菌，革兰阳性的葡萄球菌和厌氧的双歧杆菌等的染色体进行了扩增，均可见到550bp左右的DNA片断，说明该对引物对临床常见的原核生物的16S rDNA均可扩增,结果见附图。
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1.PCR marker；2.流感嗜血杆菌；3.肺炎支原体；4.大肠杆菌；5.肠球菌；6.金黄色葡萄球菌；7.肺炎双球菌；8.双歧杆菌；9.拟杆菌
附图 用通用引物扩增各种原核生物的染色体DNA所得的片断
2.肺炎支原体探针特异性的检测结果:经对肺炎支原体、大肠杆菌、流感嗜血杆菌和葡萄球菌染色体16S rDNA扩增产物进行检测，除肺炎支原体外，其余A620比值均小于2.0,表明该探针对肺炎支原体是特异性的。
3.肺炎支原体PCR-ELISA重复试验结果:用肺炎支原体16S rDNA PCR扩增产物，重复杂交过程3次，每次均为2孔，A620比值均大于2.0,表明该方法重复性较好。
4.肺炎支原体PCR-ELISA敏感性试验结果:于107倍稀释、相当于每毫升10～100个支原体时仍然可见到扩增的产物，用上述扩增产物进行杂交反应，其A620值为0.13～0.17，大肠杆菌A620值为0.045，两者A620比值均大于2.0，表明在无其他原核生物染色体DNA竞争时，PCR-ELISA的灵敏度与传统的PCR一致。
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5.肺炎支原体PCR-ELISA竞争性试验结果:只有肺炎支原体∶大肠杆菌数量比值大于1∶100时，A620比值才大于2.0(附表)，表明只有当被检验微生物达到一定比例后方能出现阳性结果。
6.PCR-ELISA与传统PCR对21份咽拭子标本的检测结果比较:传统PCR有18份标本检出肺炎支原体阳性，阳性检出率为85.7%;PCR-ELISA有16份阳性，其余5例阴性,阳性检出率为76.2%。二者阳性检出率比较差异无显著意义(χ2=0.154,P>0.05)。
附表 不同含量的肺炎支原体PCR-ELISA的A620比值 肺炎支原体∶
大肠杆菌(数量比)
实验组∶大肠杆菌组
(A620比值)
, 百拇医药
纯肺炎支原体
2.50
1∶10
3.50
1∶100
3.25
1∶1 000
1.25
1∶10 000
1.50
1∶100 000
0.50
讨论
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原核生物16S rDNA因其独特的序列特性，已经被广泛用于原核生物的检测，如医学检验，环境监测和原核生物的分类等[4,5]。几乎已经测定了每一种原核生物的16S rDNA基因序列，16S rDNA长度为1 600bp左右，每一种原核生物其长度略有差异，如大肠杆菌为1541bp。16S rDNA基因序列可以分为所有原核生物均相同的保守序列、种属特异性的半保守序列和菌种特异性的序列。
我们根据原核生物16S rDNA序列的保守序列合成了一对引物，用来扩增一段500bp左右的16S rDNA片断，其中包含有特异性的高变区V2和V3区，将扩增产物经变性与结合在ELISA板上的特异性探针杂交后，经酶显色，根据被检测原核生物与阴性对照的A620比值，凡比值大于2.0者，可视为阳性。从理论上来说，可以选择其它任何一种原核生物作为检测另一种探针的阴性对照，但目前PCR所用的Taq酶均来自大肠杆菌，因此有可能有大肠杆菌染色体DNA混杂在酶中，因此，我们选择大肠杆菌作为阴性对照。
, http://www.100md.com
由于PCR-ELISA中PCR引物是根据所有原核生物均相同的保守序列所设计的，因此不同原核生物的DNA模板可以与引物竞争结合，DNA模板量相对越高，与引物结合就相对越多，再经PCR扩增过程的几何级放大，会使不同模板之间量的差异更进一步扩大。我们试验结果表明只有当肺炎支原体∶大肠杆菌的数量比例大于1∶100时，才能得到肺炎支原体的阳性结果。
传统的PCR一次仅能检测一种病原，而基于16S rDNA基因序列的PCR-ELISA方法，先将标本中的16S rDNA基因扩增，然后再与ELISA板上的多种特异性探针杂交，根据与阴性对照的A620比值，就可以得知是哪种原核生物的感染。我们对肺炎支原体的检测结果，说明了这种方法的可行性，为进一步利用基于16S rDNA基因序列的PCR-ELISA进行多病原检测奠定了基础。
参考文献
1 刘吉荣，吴婉芳，秦雨春，等.核酸探针与酶免疫反应板定向结合的方法.生物化学与生物物理进展,1997,24:379-382.
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2 Jomolas D， Rosenbaum A，Weyrich S， et al. Enzyme-linked immunoassay for detection of PCR-amplified DNA of legionella in bronchoalveolar fluid. J Clin Microbiol，1995,33:1247-1252.
3 Guesdon J. Immunoenzymatic techniques applied to the specific detection of nucleic acids. J Immunol Methods. 1992;150:33-49.
4 Jensen NS, Casey TA, Stanton TB. Detection and identification of Treponemola hyodysenteriae by using oligodeoxynucleotide probes comolplemolentary to 16S rRNA. J Clin Microbiol,1990,28:2717-2721.
5 Rossau R, Vanmolechelen E, Ley JD, et al. Specific Neisseria gonorrhoeae DNA-Probes derived from ribosomal RNA. J Gen Microbiol, 1989,135:1735-1745., 百拇医药