婴幼儿哮喘与T辅助细胞亚群功能失衡研究
作者：符州 杨锡强 李成荣 王莉佳 张儒谊
单位：400014 重庆医科大学儿童医院(符州、杨锡强、王莉佳、张儒谊)；深圳市儿童医院(李成荣)
关键词：哮喘；T淋巴细胞；辅助诱导；细胞活素类
中华儿科杂志/980413
【摘要】 目的 探讨T辅助细胞(Th)亚群功能失衡在婴幼儿哮喘发病中的作用及其影响因素。方法 酶联免疫吸附试验方法，对20例哮喘患儿和15例健康对照者外周血单个核细胞(PBMC)分别经植物血凝素(PHA)和脂多糖(LPS)刺激后，培养上清液中各细胞因子含量进行测定。结果 经PHA刺激后哮喘组Th产生IFN-γ、IL-2水平明显低于正常对照组(t′=4.15，4.07；P均<0.01)，而IL-4、IL-6、IL-10水平则显著升高(t′=4.73，5.91，3.18，P均<0.01)。经LPS刺激后，哮喘组单核巨噬细胞产生IL-10水平明显高于正常对照组(t′=5.60，P<0.01)而IL-12水平则降低(t′=3.34，P<0.01)。相关分析发现IFN-γ与血清IgE水平呈高度负相关(r=-0.664，P<0.01)，IL-4、IL-10与IgE呈高度正相关(r=0.776，0.740；P<0.01)。结论 哮喘患儿生成Th1类细胞因子不足，Th2类因子增多；单核巨噬细胞产生IL-10增多，IL-12减少，导致Th1/Th2功能失衡。
, 百拇医药
Dysfunction of T helper cell subsets in children with asthma
Fu Zhou*, Yang Xiqiang, Li Chengrong, et al. *Children′s Hospital.
Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400014
【Abstract 】 Objective To study the impacts of dysfunction of Th1/Th2 subsets on the pathogenesis of asthma in children. Methods The cytokine production in the cultured supernatants of peripheral blood mononuclear cells stimulated with PHA (T cell derived, TD) or lipopoly saccharide (monocyte-macrophage-deriveed, MM-D) respectively, from 20 children with asthma and 15 age-matched healthy controls, was determined using “sandwich” ELISA. Results The Th1 cytokine levels of IFN-γ and IL-2 of asthma group were statistically lower than those in controls (P<0.01,0.01, respectively). In contrast, the levels of IL-4, IL-6 and IL-10 of asthma group were obviously higher compared with the controls (P<0.01,0.01,0.01,respectively). Furthermore, the level of MM-D IL-10 of asthma group was increased apparently (P<0.01) while IL-12 was decreased significantly (P<0.01) compared with those in controls. Conclusions Predominantly activated Th2 response may play an important role in the pathogenesis of bronchial asthma in children and the abnormal Th1/Th2 response may result from dysfunction of monocyte/macrophage which may function as a regulator on balance of Th1 and Th2 through production of IL-10 and IL-12.
, 百拇医药
【Key words 】 Asthma T-lymphocytes, helper-inducer Cytokines
近年不少学者研究发现成人哮喘患者存在T辅助细胞(Th)功能异常，并推测与哮喘气道变应性炎症相关[1]。我们测定了哮喘患儿外周血单个核细胞(PBMC)产生Th1和Th2类细胞因子的能力及与血清IgE水平的相关性，并探讨单核巨噬细胞源性细胞因子对Th1/Th2功能的调节作用，报告如下。
资料和方法
一、对象
收集1996年10月～12月在本院内科住院经临床确诊[2]的发作期患儿20例，男女各10例，年龄8个月～3岁，平均2岁3个月。正常对照组15例，男8例，女7例，年龄6个月～2岁8个月，平均2岁。排除个人和家族特应症(如哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎)病史。
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二、方法
1.标本收集及PBMC培养上清液制备：采清晨静脉血3 ml，其中1 ml收集血清，2 ml肝素抗凝，常规分离PBMC，用含10%小牛血清的RPMI1640调细胞至1×106/ml，加植物血凝素(PHA)100 μg/ml或脂多糖(LPS)5 μg/ml，于37℃5%CO2孵箱中培养48小时收上清液。血清及上清液贮存在-20℃用于IgE及细胞因子检测。
表1 PHA刺激的PBMC上清液细胞因子及血清IgE浓度(
±s，ng/L) 组别
例数
IL-2
IFN-γ
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IL-4
IL-6
IL-10
IgE(kU/L)
对照组
15
1618±202
1575±178
54± 5
86±13
42± 7
176±21
哮喘组
, http://www.100md.com
20
722± 86
703±111
123±14
225±20
89±13
782±99
t′值
4.07
4.15
4.73
5.91
3.18
, 百拇医药
5.99
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
2.细胞因子检测：采用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)方法，所有操作步骤均按说明书进行。IL-2、IL-4、IFN-γ试剂盒购于深圳晶美生物工程有限公司。IL-6试剂盒由第四军医大学免疫学教研室提供。IL-10及IL-12试剂盒购于美国Genzyme公司。IgE试剂盒购于上海医科大学华山医院。
, 百拇医药
3.统计学方法：检测结果以±s表示，经方差齐性检验后采用显著性t′检验及直线相关分析法。
结果
一、哮喘患儿PBMC体外产生细胞因子水平
哮喘患儿PBMC经PHA刺激后，上清液中IL-2、IFN-γ浓度明显低于正常对照组，而IL-4、IL-6、IL-10水平则明显高于对照组；哮喘发作期血清IgE浓度也明显较对照组高(表1)。
二、哮喘患儿PBMC上清液中Th细胞源性细胞因子与血清IgE间相关分析
将细胞因子与IgE水平进行相关分析发现，IFN-γ与血清IgE呈高度负相关(γ=-0.664，P<0.01)，IL-4、IL-10与IgE呈高度正相关(γ=0.776,0.740,P均<0.01)。
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三、哮喘患儿PBMC上清液中单核巨噬细胞源性IL-10和IL-12水平
哮喘患儿PBMC经LPS刺激后，上清液中单核巨噬细胞产生的IL-10浓度明显高于正常对照组，而IL-12则明显低于对照组(表2)。
讨论
哮喘发病机理非常复杂，给临床防治带来很大困难。近年来发现T细胞尤其是Th细胞功能紊乱在哮喘发病中起重要作用[1，3]。按产生细胞因子的不同将Th从功能上分为Th1和Th2两亚群[4]，前者主要产生IL-2、IFN-γ；后者主要产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10。正常情况下两者达到一定平衡，一旦失衡则会导致某些疾病。有学者发现成年哮喘患者Th2类细胞因子增多，呈现Th2功能亢进[1]。我们的研究旨在观察婴幼儿哮喘发病是否与Th1/Th2失衡有关。
, 百拇医药
表2 LPS刺激的PBMC上清液IL-10和IL-12水平(±s，ng/L) 组别
例数
IL-10
IL-12
对照组
15
216±34
90±12
哮喘组
20
636±67
, 百拇医药
48± 4
t′值
5.60
3.34
P值
<0.01
<0.01
本研究表明，哮喘患儿发作期Th产生IL-4、IL-6、IL-10增多，而IFN-γ、IL-2生成减少，呈现Th1/Th2功能失衡。IL-4能促进B细胞合成IgE，IL-10除与IL-6一样协同IL-4增强IgE合成外[5，6]，还能促进IL-5分泌，对肥大细胞、嗜酸性粒细胞浸润和释放介质参与哮喘炎症有重要作用。IFN-γ具有拮抗IL-4的作用而抑制IgE合成，哮喘时IFN-γ分泌减少，其抑制作用减弱，使IgE大量产生，参与哮喘速发型变态反应。IL-2在哮喘中的作用不十分清楚，有待进一步研究。相关分析发现，IFN-γ、IL-4和IL-10水平与血清IgE高度相关，证实了上述细胞因子对IgE产生的调节作用。
, 百拇医药
单核巨噬细胞可通过分泌细胞因子IL-10和IL-12调节Th1/Th2功能。IL-10能抑制Th1类细胞因子，诱导Th2类细胞因子产生[7]，而IL-12则相反[8]。本组哮喘患儿PBMC经LPS体外诱导后，IL-10水平高于正常对照组，而IL-12水平则低于正常对照。结合Th1类细胞因子亦低于正常对照，而Th2类细胞因子高于正常对照，提示单核巨噬细胞产生IL-10/IL-12异常与哮喘患儿Th1/Th2功能失衡有密切关系。
参考文献
1 Kline J N, Hunninghake G W. T-lymphocyte dysregulation in asthma. Proc Soc Exp Biol Med, 1994, 207:243-253.
2 全国儿科哮喘协作组.儿童哮喘诊断标准和治疗常规.中华儿科杂志，1993，31：222-224.
, http://www.100md.com
3 Kummer F. Immunopathology and immunotherapy. New York: Spring-verla Wien, 1993. 2-6.
4 Vecchiarelli A, Siracusa A, Monari C, et al. Cytokine regulation of lowaffinity IgE receptor (CD23) on monocytes from asthmatic subjects. Clin Exp Immunol, 1994, 97:248-253.
5 Kawano Y, Noma T. Dual action of IL-4 on mite antigen-induced IgE synthesis in lymphocytes from individuals with bronchial asthma. Clin Exp Immunol, 1995, 102:389-394.
, http://www.100md.com
6 D′Andrea BA, Amezaga MA, Valiante NM, et al. Interleukin 10 (IL-10) inhibits human lymphocyte interferon-γ production by suppressing natural killer cell stimulatory factor/IL-12 synthesis in accessory cells. J Exp Med, 1993, 178:1041-1048.
7 Marshall JD, Secrist H, Dekruyff RH, et al. IL-12 inhibits the production of IL-4 and IL-10 in allergen-specific human CD4 T lymphocytes. J Immunol, 1995, 155:111-117., http://www.100md.com
单位：400014 重庆医科大学儿童医院(符州、杨锡强、王莉佳、张儒谊)；深圳市儿童医院(李成荣)
关键词：哮喘；T淋巴细胞；辅助诱导；细胞活素类
中华儿科杂志/980413
【摘要】 目的 探讨T辅助细胞(Th)亚群功能失衡在婴幼儿哮喘发病中的作用及其影响因素。方法 酶联免疫吸附试验方法，对20例哮喘患儿和15例健康对照者外周血单个核细胞(PBMC)分别经植物血凝素(PHA)和脂多糖(LPS)刺激后，培养上清液中各细胞因子含量进行测定。结果 经PHA刺激后哮喘组Th产生IFN-γ、IL-2水平明显低于正常对照组(t′=4.15，4.07；P均<0.01)，而IL-4、IL-6、IL-10水平则显著升高(t′=4.73，5.91，3.18，P均<0.01)。经LPS刺激后，哮喘组单核巨噬细胞产生IL-10水平明显高于正常对照组(t′=5.60，P<0.01)而IL-12水平则降低(t′=3.34，P<0.01)。相关分析发现IFN-γ与血清IgE水平呈高度负相关(r=-0.664，P<0.01)，IL-4、IL-10与IgE呈高度正相关(r=0.776，0.740；P<0.01)。结论 哮喘患儿生成Th1类细胞因子不足，Th2类因子增多；单核巨噬细胞产生IL-10增多，IL-12减少，导致Th1/Th2功能失衡。
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Dysfunction of T helper cell subsets in children with asthma
Fu Zhou*, Yang Xiqiang, Li Chengrong, et al. *Children′s Hospital.
Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400014
【Abstract 】 Objective To study the impacts of dysfunction of Th1/Th2 subsets on the pathogenesis of asthma in children. Methods The cytokine production in the cultured supernatants of peripheral blood mononuclear cells stimulated with PHA (T cell derived, TD) or lipopoly saccharide (monocyte-macrophage-deriveed, MM-D) respectively, from 20 children with asthma and 15 age-matched healthy controls, was determined using “sandwich” ELISA. Results The Th1 cytokine levels of IFN-γ and IL-2 of asthma group were statistically lower than those in controls (P<0.01,0.01, respectively). In contrast, the levels of IL-4, IL-6 and IL-10 of asthma group were obviously higher compared with the controls (P<0.01,0.01,0.01,respectively). Furthermore, the level of MM-D IL-10 of asthma group was increased apparently (P<0.01) while IL-12 was decreased significantly (P<0.01) compared with those in controls. Conclusions Predominantly activated Th2 response may play an important role in the pathogenesis of bronchial asthma in children and the abnormal Th1/Th2 response may result from dysfunction of monocyte/macrophage which may function as a regulator on balance of Th1 and Th2 through production of IL-10 and IL-12.
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【Key words 】 Asthma T-lymphocytes, helper-inducer Cytokines
近年不少学者研究发现成人哮喘患者存在T辅助细胞(Th)功能异常，并推测与哮喘气道变应性炎症相关[1]。我们测定了哮喘患儿外周血单个核细胞(PBMC)产生Th1和Th2类细胞因子的能力及与血清IgE水平的相关性，并探讨单核巨噬细胞源性细胞因子对Th1/Th2功能的调节作用，报告如下。
资料和方法
一、对象
收集1996年10月～12月在本院内科住院经临床确诊[2]的发作期患儿20例，男女各10例，年龄8个月～3岁，平均2岁3个月。正常对照组15例，男8例，女7例，年龄6个月～2岁8个月，平均2岁。排除个人和家族特应症(如哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎)病史。
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二、方法
1.标本收集及PBMC培养上清液制备：采清晨静脉血3 ml，其中1 ml收集血清，2 ml肝素抗凝，常规分离PBMC，用含10%小牛血清的RPMI1640调细胞至1×106/ml，加植物血凝素(PHA)100 μg/ml或脂多糖(LPS)5 μg/ml，于37℃5%CO2孵箱中培养48小时收上清液。血清及上清液贮存在-20℃用于IgE及细胞因子检测。
表1 PHA刺激的PBMC上清液细胞因子及血清IgE浓度(
±s，ng/L) 组别例数
IL-2
IFN-γ
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IL-4
IL-6
IL-10
IgE(kU/L)
对照组
15
1618±202
1575±178
54± 5
86±13
42± 7
176±21
哮喘组
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20
722± 86
703±111
123±14
225±20
89±13
782±99
t′值
4.07
4.15
4.73
5.91
3.18
, 百拇医药
5.99
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
2.细胞因子检测：采用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)方法，所有操作步骤均按说明书进行。IL-2、IL-4、IFN-γ试剂盒购于深圳晶美生物工程有限公司。IL-6试剂盒由第四军医大学免疫学教研室提供。IL-10及IL-12试剂盒购于美国Genzyme公司。IgE试剂盒购于上海医科大学华山医院。
, 百拇医药
3.统计学方法：检测结果以
±s表示，经方差齐性检验后采用显著性t′检验及直线相关分析法。结果
一、哮喘患儿PBMC体外产生细胞因子水平
哮喘患儿PBMC经PHA刺激后，上清液中IL-2、IFN-γ浓度明显低于正常对照组，而IL-4、IL-6、IL-10水平则明显高于对照组；哮喘发作期血清IgE浓度也明显较对照组高(表1)。
二、哮喘患儿PBMC上清液中Th细胞源性细胞因子与血清IgE间相关分析
将细胞因子与IgE水平进行相关分析发现，IFN-γ与血清IgE呈高度负相关(γ=-0.664，P<0.01)，IL-4、IL-10与IgE呈高度正相关(γ=0.776,0.740,P均<0.01)。
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三、哮喘患儿PBMC上清液中单核巨噬细胞源性IL-10和IL-12水平
哮喘患儿PBMC经LPS刺激后，上清液中单核巨噬细胞产生的IL-10浓度明显高于正常对照组，而IL-12则明显低于对照组(表2)。
讨论
哮喘发病机理非常复杂，给临床防治带来很大困难。近年来发现T细胞尤其是Th细胞功能紊乱在哮喘发病中起重要作用[1，3]。按产生细胞因子的不同将Th从功能上分为Th1和Th2两亚群[4]，前者主要产生IL-2、IFN-γ；后者主要产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10。正常情况下两者达到一定平衡，一旦失衡则会导致某些疾病。有学者发现成年哮喘患者Th2类细胞因子增多，呈现Th2功能亢进[1]。我们的研究旨在观察婴幼儿哮喘发病是否与Th1/Th2失衡有关。
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表2 LPS刺激的PBMC上清液IL-10和IL-12水平(
±s，ng/L) 组别例数
IL-10
IL-12
对照组
15
216±34
90±12
哮喘组
20
636±67
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48± 4
t′值
5.60
3.34
P值
<0.01
<0.01
本研究表明，哮喘患儿发作期Th产生IL-4、IL-6、IL-10增多，而IFN-γ、IL-2生成减少，呈现Th1/Th2功能失衡。IL-4能促进B细胞合成IgE，IL-10除与IL-6一样协同IL-4增强IgE合成外[5，6]，还能促进IL-5分泌，对肥大细胞、嗜酸性粒细胞浸润和释放介质参与哮喘炎症有重要作用。IFN-γ具有拮抗IL-4的作用而抑制IgE合成，哮喘时IFN-γ分泌减少，其抑制作用减弱，使IgE大量产生，参与哮喘速发型变态反应。IL-2在哮喘中的作用不十分清楚，有待进一步研究。相关分析发现，IFN-γ、IL-4和IL-10水平与血清IgE高度相关，证实了上述细胞因子对IgE产生的调节作用。
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单核巨噬细胞可通过分泌细胞因子IL-10和IL-12调节Th1/Th2功能。IL-10能抑制Th1类细胞因子，诱导Th2类细胞因子产生[7]，而IL-12则相反[8]。本组哮喘患儿PBMC经LPS体外诱导后，IL-10水平高于正常对照组，而IL-12水平则低于正常对照。结合Th1类细胞因子亦低于正常对照，而Th2类细胞因子高于正常对照，提示单核巨噬细胞产生IL-10/IL-12异常与哮喘患儿Th1/Th2功能失衡有密切关系。
参考文献
1 Kline J N, Hunninghake G W. T-lymphocyte dysregulation in asthma. Proc Soc Exp Biol Med, 1994, 207:243-253.
2 全国儿科哮喘协作组.儿童哮喘诊断标准和治疗常规.中华儿科杂志，1993，31：222-224.
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3 Kummer F. Immunopathology and immunotherapy. New York: Spring-verla Wien, 1993. 2-6.
4 Vecchiarelli A, Siracusa A, Monari C, et al. Cytokine regulation of lowaffinity IgE receptor (CD23) on monocytes from asthmatic subjects. Clin Exp Immunol, 1994, 97:248-253.
5 Kawano Y, Noma T. Dual action of IL-4 on mite antigen-induced IgE synthesis in lymphocytes from individuals with bronchial asthma. Clin Exp Immunol, 1995, 102:389-394.
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6 D′Andrea BA, Amezaga MA, Valiante NM, et al. Interleukin 10 (IL-10) inhibits human lymphocyte interferon-γ production by suppressing natural killer cell stimulatory factor/IL-12 synthesis in accessory cells. J Exp Med, 1993, 178:1041-1048.
7 Marshall JD, Secrist H, Dekruyff RH, et al. IL-12 inhibits the production of IL-4 and IL-10 in allergen-specific human CD4 T lymphocytes. J Immunol, 1995, 155:111-117., http://www.100md.com