胶原成分在儿童系膜增生性肾小球肾炎中的变化
作者：柴青 丁洁 张英 杨霁云
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：肾小球肾炎；膜增生性；胶原；细胞外基质
中华儿科杂志/980404
【摘要】 目的 观察系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)系膜区胶原成分的变化。方法 应用链菌素亲生物素-过氧化酶连接法观察了30例轻度MsPGN肾穿刺活组织标本和正常的肾小球系膜区Ⅳ型胶原及其α链(α1、α3、α5链)、Ⅵ型胶原及Ⅰ型胶原的变化。结果 (1)正常肾脏组织中，Ⅳ型胶原及其α1(Ⅳ)链分布于系膜区和基底膜，α3(Ⅳ)、α5(Ⅳ)链分布于基底膜，Ⅵ型胶原分布于系膜区、肾小球基底膜和间质，Ⅰ型胶原仅分布于肾间质。(2)在轻度MsPGN时，系膜区内Ⅳ型胶原及其α1链、Ⅵ型胶原含量较正常对照明显增多(P<0.01)；当系膜区系膜细胞超过4个时，Ⅰ型胶原开始在肾小球内出现，且在硬化肾小球内Ⅰ型胶原均呈阳性；α3(Ⅳ)、α5(Ⅳ)链与正常对照比较无明显变化，硬化肾小球α3(Ⅳ)、α5(Ⅳ)染色呈阳性。结论 系膜区胶原成分增多可先于系膜细胞增生，并随系膜细胞增生而增多，间质胶原成分Ⅰ型胶原，不但出现于硬化肾小球内，而且出现于系膜细胞增生较重时。
, 百拇医药
Changes in collagens in mesangial proliferative glomerulonephritis in children
Chai Qing, Ding Jie, Zhang Ying, et al.
Department of Pediatrics, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract 】 Objective To observe changes in collagen components in mesangium in children with mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN). Methods Type Ⅳ collagen as well as α chains (chains α1, α3 and α5), type Ⅵ collagen and type Ⅰ collagen were observed in 30 children with mild MsPGN by using a streptavidin peroxidase conjugate method. Results (1) In normal kidney, type Ⅳ collagen and α1 (Ⅳ) chain were distributed in mesangium and basement membrane (BM), α3(Ⅳ) and α5(Ⅳ) chains in BM, type Ⅵ collagen in mesangium, glomerular basement membrane and interstitium, and type Ⅰ collagen in interstitium only. (2) In MsPGN, the quantity of type Ⅳ collagen and α1(Ⅳ) chain, and type Ⅵ collagen markedly increased compared with controls (P<0.01). Type Ⅰ collagen began to express in glomeruli when average numbers of mesangial cells were more than 4 within one mesangium area and it was positive in sclerotic glomeruli. Alpha 3(Ⅳ) and α5(Ⅳ) chains had no change compared with controls but they were positive in sclerotic glomeruli. Conclusion Collagen components may increase prior to mesangial cell proliferation in mesangium, and they may do along with mesangial cell proliferation. Interstitial collagen component (type I collagen) expressed not only in sclerotic glomeruli but in glomeruli with severe mesangial cell proliferation.
, 百拇医药
【Key words】 【Key words】 Glomerulonephritis, membranoproliferative Collagen Extracellular matrix
系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)是儿科临床常见的肾脏病理变化之一。其临床表现轻重不一，预后转归亦存在不同程度的差异。以往研究提示,MsPGN不但有系膜细胞的增生，并有系膜基质的扩张。而肾小球系膜基质的进行性聚积与肾小球硬化密切相关[1]。细胞外基质包括胶原与非胶原成分，胶原成分特别是Ⅳ型胶原在细胞外基质中含量较多，且具有重要的作用[2]。我们应用链菌素亲生物素-过氧化酶连接法(SP法)，观察了儿童MsPGN患者肾穿刺活组织中系膜区Ⅳ型胶原及其α链(α1、α3、α5链)，Ⅵ型胶原和Ⅰ型胶原的变化，试图探讨其与肾小球病变程度的关系，为肾小球疾病进展及肾小球硬化机理的研究提供一些资料。
对象和方法
, 百拇医药
一、病例选择
按WHO诊断标准诊断为MsPGN的患儿30例。患儿肾穿刺活组织标本切片厚度为2 μm， 经PAS
附表 正常及MsPGN肾小球系膜基质中胶原相对含量及定性分析 分组
系膜细胞
数/系膜区
(个)
肾小球数
(个)
肾小球系膜基质胶原染色面积/肾小球面积(
±s)
, 百拇医药 胶原定性分析
Ⅳ
α1(Ⅳ)
Ⅵ
Ⅰ型胶原
(阳性数)
α3(Ⅳ)链
α5(Ⅵ)链
对照组
<2
15
0.029±0.005
0.028±0.007
, 百拇医药
0.026±0.009
-
-
-
MsPGN
2
58
0.119±0.027*
0.084±0.035*
0.079±0.034*
-
-
, 百拇医药
-
3
86
0.143±0.034*
0.113±0.039*
0.120±0.032*
-
-
-
4
79
0.231±0.038*
, 百拇医药
0.178±0.059*
0.149±0.042*
1
-
-
>4
25
0.269±0.111*
0.296±0.099*
0.276±0.128*
5
, 百拇医药
-
-
MsPGN伴有硬化
14
0.527±0.098*
0.416±0.147*
0.403±0.236*
14
+
+
注：* 与正常对照组比较P<0.01；表中- 表示全部阴性，+ 表示全部阳性和HE染色，大部分肾小球系膜区可见3个以上系膜细胞并伴系膜基质增生，而增生的系膜宽度不超过毛细血管直径，符合轻度MsPGN。其中男18例，女12例，年龄7～14岁，病程5天～4年，包括紫癜性肾炎7例， 狼疮性肾炎4例，IgA肾病6例，其余13例为原发性MsPGN。主要临床表现：(1)血尿：肉眼或镜下血尿；(2)蛋白尿：尿蛋白定量在0.11～4 g/24h；(3)血压：12/8～21/16 kPa(1 kPa=7.5 mmHg)；(4)肾功能：大部分患儿肾功能在正常范围，有4例患儿BUN超过正常范围。
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二、 试剂
实验中所用第一抗体分别为鼠抗人Ⅳ型胶原区单克隆抗体(Zymed Laboratories公司),鼠抗人I型胶原区单克隆抗体(Sigma公司),鼠抗人Ⅵ型胶原区单克隆抗体(Chemicon international公司),鼠抗人α1 (Ⅳ)、α3 (Ⅳ)、α5 (Ⅳ)链NC1片段单克隆抗体(美国明尼苏达大学Alfred Michael教授惠赠)；第二抗体为生物素标记的马抗鼠IgG (Vector Laboratories) ，SA-HRP(Streptavidin Horseradish Peroxidase )(Vector Laboratories)。DAB粉末(北京中山生物技术有限公司)。
三、 方法
采用链菌素亲生物素-过氧化酶连接法(streptavidin peroxidase conjugated method, SP法)。
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1. 分组：正常对照组：取2例肾肿瘤切除时的正常肾组织,共含有15个肾小球，各肾小球系膜区系膜细胞均≤2个。本组30例MsPGN患儿中15例标本含4～10个肾小球,9例标本含10个以上肾小球,6例标本含2～3个肾小球；肾组织中各个肾小球系膜区系膜细胞数目并不完全相同,我们将本组患儿的肾穿刺活组织标本中共含有的262个肾小球,根据各个肾小球中系膜区含有的系膜细胞数及有无硬化而分为以下5组： (1) 系膜区含2个细胞组;(2)系膜区含3个细胞组;(3)系膜区含4个细胞组;(4)系膜区含>4个细胞组;(5)伴有肾小球硬化组。
2. 肾活组织病理标本处理: (1)石蜡切片:常规10%福尔马林固定、脱水、石蜡包埋；(2)冰冻切片:OCT包埋。
3. 实验方法:石蜡切片经脱蜡、水化及灭活内源性过氧化物酶, 以微波炉进行抗原修复, 1%BSA封闭非特异性染色,而后相继加第一抗体、置37℃孵育2小时和生物素标记的第二抗体、置室温40分钟,再加SA-HRP复合物、室温60分钟,最后加DAB-H2O2显色, 并以苏木素复染。 冰冻切片标本则用 95% 酒精、4℃固定10分钟, 灭活内源性过氧化酶后,再经尿素消化(4℃ )1小时,其后步骤同石蜡切片。以PBS取代第一抗体作为本试验的空白对照。
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四、计算机图像处理
应用CMIAS计算机真彩色医学图像分析系统,测量每个肾小球着色的系膜基质的面积及该肾小球总面积(肾小囊之内)，以两者间的比值表示该种胶原成分在该肾小球系膜基质中的相对含量，因此减少了因切片导致肾小球切面面积不一所致误差。
五、统计学处理
采用SPSS统计软件通过计算机进行多组间方差检验和两组间t检验，以及相关性分析。
结果
一、胶原成分在正常肾组织中的分布
正常肾脏组织中, Ⅳ型胶原弥漫分布于系膜区和基底膜(肾小球基底膜、肾小管基底膜，肾小囊)。Ⅳ型胶原α1链分布与Ⅳ型胶原相似，α3(Ⅳ)链分布于肾小球基底膜和部分肾小管基底膜，α5(Ⅳ)链分布于肾小球基底膜、肾小囊和部分肾小管基底膜；Ⅵ型胶原分布于系膜区、肾小球基底膜和间质；I型胶原仅分布于肾间质，不存在于正常系膜基质、肾小球基底膜和肾小管基底膜中。
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二、胶原成分在MsPGN肾组织中的分布
(1)在MsPGN肾组织中Ⅳ型胶原、α1 (Ⅳ)链及Ⅵ型胶原含量高于正常对照(P<0.01)，并随着系膜细胞数的增加, 上述胶原含量亦增加(图1～3)，二者高度正相关(r=0.8，P<0.01)(附表)；(2)α1(Ⅳ)链的增加与Ⅳ型胶原增加相平行，二者呈正相关(r=0.8946，P<0.01)；Ⅵ型胶原的增加与Ⅳ型胶原的增加也相平行,二者呈正相关(r=0.7461，P<0.01)(附表)；(3)Ⅰ型胶原在系膜细胞增生超过4个的系膜区开始出现阳性，并在肾小球硬化的区域中染色呈阳性(附表，图4～6)；伴有肾小球硬化组中Ⅰ型胶原呈现阳性共有14个肾小球，来自于5例患儿，多为继发性MsPGN，IgA肾病1例、紫癜性肾炎2例、狼疮性肾炎1例、原发MsPGN患儿1例， 病程1个月～3年；(4)α3(Ⅳ)、α5(Ⅳ)在MsPGN中的分布同正常，主要在肾小球基底膜，但所有硬化肾小球区域内出现α3(Ⅳ)、α5(Ⅳ)染色阳性(附表)。
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讨论
MsPGN是临床上常见的肾小球病变，其病因、临床经过及其预后不尽相同，以往多数报道均认为MsPGN早期多以细胞增生为主、为早，随病变进展也将出现系膜基质的增多甚至以基质增生为主[3]。MsPGN也是儿童肾脏疾病常见病理类型之一，而且在儿童尤以轻度MsPGN最常见，即增生的系膜宽度不超过毛细血管直径，毛细血管腔呈开放状，无挤压现象[3]。但在均为轻度MsPGN的病变中各个肾小球的变化并非完全一致。我们在实验中观察到，轻度MsPGN各个肾小球系膜区平均系膜细胞数目可以从2至4个以上，有的肾小球甚至出现硬化。观察各个肾小球细胞外基质变化，并试图解释这种发生在各个肾小球间的不平行的病理变化，也许有助于我们理解疾病发生和发展机制。
正如其他研究者所报道[4～7]，在我们的实验中同样发现，正常肾小球系膜区含有的胶原成分主要为Ⅳ型、Ⅴ型及Ⅵ型胶原等，在系膜增生性的病变中这些作为细胞外基质中主要成分的胶原物质则随着系膜区系膜细胞数目的增加而增多，这种系膜细胞数与系膜基质成分变化的正相关关系仅发生在正常情况下原本存在于系膜区的胶原成分中，如本实验所观察的Ⅳ型胶原及其α1链和Ⅵ型胶原。但正常不存在于系膜区的间质胶原成分I型胶原，在系膜细胞增生至4个或4个以上时也出现于肾小球内。说明较重的系膜细胞增生病变，除了有正常系膜区存在的胶原成分的明显增加外，还伴有间质胶原在肾小球内的表达，从而可能影响系膜功能，加重肾脏损害[7]。本研究发现系膜细胞增生区出现间质性胶原表达的患者多为继发性MsPGN，这也许提示继发性肾小球肾炎的系膜细胞即便为轻度增生时，预后也可能较原发MsPGN差。同时本实验还观察到，Ⅳ型胶原α链在MsPGN中的变化是不平行的，即Ⅳ型胶原α1链变化与Ⅳ型胶原一致，而α3(Ⅳ)、α5(Ⅳ)链则与正常对照相比无变化。说明MsPGN时，不仅存在胶原成分数量的变化，同时还存在胶原成分的构成改变，从而影响细胞外基质的正常结构及其生物学功能，加重肾脏损害。
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本研究着重于观察轻度MsPGN肾组织标本中各个肾小球系膜区的平均系膜细胞数及其胶原的变化，发现在轻度MsPGN的肾组织中尚存在系膜细胞平均数仍正常(2个/系膜区)的肾小球，而这类肾小球中系膜区胶原成分(Ⅳ型胶原及其α1链，Ⅵ型胶原)已较正常肾小球显著增多，说明系膜基质扩张可先于系膜细胞的增生，虽然我们尚不能解释这一现象的病生理意义，但也许揭示了疾病发生早期的病理特征。
本研究观察的轻度MsPGN肾组织标本共含262个肾小球，其中14个肾小球出现硬化，硬化区内正常存在于肾小球系膜区的胶原成分(Ⅳ型胶原及其α1链，Ⅵ型胶原)均显著增多，而且间质胶原Ⅰ型胶原也全部出现阳性，呈现了硬化小球的特征[7,8]。另外，硬化小球内还出现了Ⅳ型胶原α3和α5链的表达。目前研究已证实Ⅳ型胶原的6个α链中α1和α2链与α3～α6链不但在正常肾组织中存在明显不同的分布，而且其细胞来源也不同。Ⅳ型胶原α1和α2链主要由系膜细胞产生，而α3～α6链可能主要来源于上皮细胞[9]。本研究显示轻度MsPGN出现硬化的肾小球内Ⅳ型胶原α3、α5链染色阳性，可能提示肾小球疾病发展至硬化时会累及多类肾小球细胞参与，抑或α3(Ⅳ)和α5(Ⅳ)链为原肾小球基底膜残痕，因为α3(Ⅳ)和α5(Ⅳ)链分布于正常肾小球的基底膜。
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图1～3 抗Ⅳ型胶原单克隆抗体在正常人及MsPGN患儿肾组织中的分布(免疫组化染色，光镜，×400) 图1 为正常组织， 图2 为轻度MsPGN， 图3 为轻度MsPGN伴肾小球硬化 图4～6 抗Ⅰ型胶原单克隆抗体在正常人及MsPGN患儿肾组织中的分布(免疫组化染色，光镜，×400) 图4 为正常组织， 图5 为轻度MsPGN， 图6 为轻度MsPGN伴肾小球硬化
参考文献
1 Border WA, Okuda S， Nakamura T. Extracellular matrix and glomerular disease. Semin Nephrol, 1989, 9:307-317.
2 Couchman JR, Beavan LA, Mccarthy KJ. Glomerular matrix: synthesis, turnover and role in mesangial expansion. Kidney Int,1994, 45:328-335.
, 百拇医药
3 邹万忠. 肾脏病理与临床. 湖南: 湖南科学技术出版社，1993. 46-47.
4 Floege J, Johnson RJ, Gordon K, et al. Increased synthesis of extracellular matrix in mesangial proliferative nephritis. Kidney Int, 1991,40:477-488.
5 Buyukbabani N, Droz D. Distribution of the extracellular matrix components in human glomerular lesions. J Pathol,1994,172:199-207.
6 Hirata K, Shikata K， Makino H, et al. Immunohistological localization of the novel epitope related to type Ⅳ collagen in normal and diseased renal tissues. J Pathol,1995,177:407-413.
, http://www.100md.com
7 Funabiki K, Horikoshi S, Tomino Y，et al. Immunohistochemical analysis of extracellular components in glomerular sclerosis of patients with glomerulonephritis. Clin Nephrol,1990,34:239-246.
8 Glick AD, Jacobson HR, Haralson MA. Mesangial deposition of type I collagen in human glomerulosclerosis. Hum Pathol,1992,23:1373-1379.
9 Cai Y, Beziau A, Sich M, et al. Collagen distribution in human membranous glomerulonephritis. Pediatr Nephrol,1996,10:14-21., 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：肾小球肾炎；膜增生性；胶原；细胞外基质
中华儿科杂志/980404
【摘要】 目的 观察系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)系膜区胶原成分的变化。方法 应用链菌素亲生物素-过氧化酶连接法观察了30例轻度MsPGN肾穿刺活组织标本和正常的肾小球系膜区Ⅳ型胶原及其α链(α1、α3、α5链)、Ⅵ型胶原及Ⅰ型胶原的变化。结果 (1)正常肾脏组织中，Ⅳ型胶原及其α1(Ⅳ)链分布于系膜区和基底膜，α3(Ⅳ)、α5(Ⅳ)链分布于基底膜，Ⅵ型胶原分布于系膜区、肾小球基底膜和间质，Ⅰ型胶原仅分布于肾间质。(2)在轻度MsPGN时，系膜区内Ⅳ型胶原及其α1链、Ⅵ型胶原含量较正常对照明显增多(P<0.01)；当系膜区系膜细胞超过4个时，Ⅰ型胶原开始在肾小球内出现，且在硬化肾小球内Ⅰ型胶原均呈阳性；α3(Ⅳ)、α5(Ⅳ)链与正常对照比较无明显变化，硬化肾小球α3(Ⅳ)、α5(Ⅳ)染色呈阳性。结论 系膜区胶原成分增多可先于系膜细胞增生，并随系膜细胞增生而增多，间质胶原成分Ⅰ型胶原，不但出现于硬化肾小球内，而且出现于系膜细胞增生较重时。
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Changes in collagens in mesangial proliferative glomerulonephritis in children
Chai Qing, Ding Jie, Zhang Ying, et al.
Department of Pediatrics, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract 】 Objective To observe changes in collagen components in mesangium in children with mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN). Methods Type Ⅳ collagen as well as α chains (chains α1, α3 and α5), type Ⅵ collagen and type Ⅰ collagen were observed in 30 children with mild MsPGN by using a streptavidin peroxidase conjugate method. Results (1) In normal kidney, type Ⅳ collagen and α1 (Ⅳ) chain were distributed in mesangium and basement membrane (BM), α3(Ⅳ) and α5(Ⅳ) chains in BM, type Ⅵ collagen in mesangium, glomerular basement membrane and interstitium, and type Ⅰ collagen in interstitium only. (2) In MsPGN, the quantity of type Ⅳ collagen and α1(Ⅳ) chain, and type Ⅵ collagen markedly increased compared with controls (P<0.01). Type Ⅰ collagen began to express in glomeruli when average numbers of mesangial cells were more than 4 within one mesangium area and it was positive in sclerotic glomeruli. Alpha 3(Ⅳ) and α5(Ⅳ) chains had no change compared with controls but they were positive in sclerotic glomeruli. Conclusion Collagen components may increase prior to mesangial cell proliferation in mesangium, and they may do along with mesangial cell proliferation. Interstitial collagen component (type I collagen) expressed not only in sclerotic glomeruli but in glomeruli with severe mesangial cell proliferation.
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【Key words】 【Key words】 Glomerulonephritis, membranoproliferative Collagen Extracellular matrix
系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)是儿科临床常见的肾脏病理变化之一。其临床表现轻重不一，预后转归亦存在不同程度的差异。以往研究提示,MsPGN不但有系膜细胞的增生，并有系膜基质的扩张。而肾小球系膜基质的进行性聚积与肾小球硬化密切相关[1]。细胞外基质包括胶原与非胶原成分，胶原成分特别是Ⅳ型胶原在细胞外基质中含量较多，且具有重要的作用[2]。我们应用链菌素亲生物素-过氧化酶连接法(SP法)，观察了儿童MsPGN患者肾穿刺活组织中系膜区Ⅳ型胶原及其α链(α1、α3、α5链)，Ⅵ型胶原和Ⅰ型胶原的变化，试图探讨其与肾小球病变程度的关系，为肾小球疾病进展及肾小球硬化机理的研究提供一些资料。
对象和方法
, 百拇医药
一、病例选择
按WHO诊断标准诊断为MsPGN的患儿30例。患儿肾穿刺活组织标本切片厚度为2 μm， 经PAS
附表 正常及MsPGN肾小球系膜基质中胶原相对含量及定性分析 分组
系膜细胞
数/系膜区
(个)
肾小球数
(个)
肾小球系膜基质胶原染色面积/肾小球面积(
±s), 百拇医药 胶原定性分析
Ⅳ
α1(Ⅳ)
Ⅵ
Ⅰ型胶原
(阳性数)
α3(Ⅳ)链
α5(Ⅵ)链
对照组
<2
15
0.029±0.005
0.028±0.007
, 百拇医药
0.026±0.009
-
-
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MsPGN
2
58
0.119±0.027*
0.084±0.035*
0.079±0.034*
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3
86
0.143±0.034*
0.113±0.039*
0.120±0.032*
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4
79
0.231±0.038*
, 百拇医药
0.178±0.059*
0.149±0.042*
1
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>4
25
0.269±0.111*
0.296±0.099*
0.276±0.128*
5
, 百拇医药
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MsPGN伴有硬化
14
0.527±0.098*
0.416±0.147*
0.403±0.236*
14
+
+
注：* 与正常对照组比较P<0.01；表中- 表示全部阴性，+ 表示全部阳性和HE染色，大部分肾小球系膜区可见3个以上系膜细胞并伴系膜基质增生，而增生的系膜宽度不超过毛细血管直径，符合轻度MsPGN。其中男18例，女12例，年龄7～14岁，病程5天～4年，包括紫癜性肾炎7例， 狼疮性肾炎4例，IgA肾病6例，其余13例为原发性MsPGN。主要临床表现：(1)血尿：肉眼或镜下血尿；(2)蛋白尿：尿蛋白定量在0.11～4 g/24h；(3)血压：12/8～21/16 kPa(1 kPa=7.5 mmHg)；(4)肾功能：大部分患儿肾功能在正常范围，有4例患儿BUN超过正常范围。
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二、 试剂
实验中所用第一抗体分别为鼠抗人Ⅳ型胶原区单克隆抗体(Zymed Laboratories公司),鼠抗人I型胶原区单克隆抗体(Sigma公司),鼠抗人Ⅵ型胶原区单克隆抗体(Chemicon international公司),鼠抗人α1 (Ⅳ)、α3 (Ⅳ)、α5 (Ⅳ)链NC1片段单克隆抗体(美国明尼苏达大学Alfred Michael教授惠赠)；第二抗体为生物素标记的马抗鼠IgG (Vector Laboratories) ，SA-HRP(Streptavidin Horseradish Peroxidase )(Vector Laboratories)。DAB粉末(北京中山生物技术有限公司)。
三、 方法
采用链菌素亲生物素-过氧化酶连接法(streptavidin peroxidase conjugated method, SP法)。
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1. 分组：正常对照组：取2例肾肿瘤切除时的正常肾组织,共含有15个肾小球，各肾小球系膜区系膜细胞均≤2个。本组30例MsPGN患儿中15例标本含4～10个肾小球,9例标本含10个以上肾小球,6例标本含2～3个肾小球；肾组织中各个肾小球系膜区系膜细胞数目并不完全相同,我们将本组患儿的肾穿刺活组织标本中共含有的262个肾小球,根据各个肾小球中系膜区含有的系膜细胞数及有无硬化而分为以下5组： (1) 系膜区含2个细胞组;(2)系膜区含3个细胞组;(3)系膜区含4个细胞组;(4)系膜区含>4个细胞组;(5)伴有肾小球硬化组。
2. 肾活组织病理标本处理: (1)石蜡切片:常规10%福尔马林固定、脱水、石蜡包埋；(2)冰冻切片:OCT包埋。
3. 实验方法:石蜡切片经脱蜡、水化及灭活内源性过氧化物酶, 以微波炉进行抗原修复, 1%BSA封闭非特异性染色,而后相继加第一抗体、置37℃孵育2小时和生物素标记的第二抗体、置室温40分钟,再加SA-HRP复合物、室温60分钟,最后加DAB-H2O2显色, 并以苏木素复染。 冰冻切片标本则用 95% 酒精、4℃固定10分钟, 灭活内源性过氧化酶后,再经尿素消化(4℃ )1小时,其后步骤同石蜡切片。以PBS取代第一抗体作为本试验的空白对照。
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四、计算机图像处理
应用CMIAS计算机真彩色医学图像分析系统,测量每个肾小球着色的系膜基质的面积及该肾小球总面积(肾小囊之内)，以两者间的比值表示该种胶原成分在该肾小球系膜基质中的相对含量，因此减少了因切片导致肾小球切面面积不一所致误差。
五、统计学处理
采用SPSS统计软件通过计算机进行多组间方差检验和两组间t检验，以及相关性分析。
结果
一、胶原成分在正常肾组织中的分布
正常肾脏组织中, Ⅳ型胶原弥漫分布于系膜区和基底膜(肾小球基底膜、肾小管基底膜，肾小囊)。Ⅳ型胶原α1链分布与Ⅳ型胶原相似，α3(Ⅳ)链分布于肾小球基底膜和部分肾小管基底膜，α5(Ⅳ)链分布于肾小球基底膜、肾小囊和部分肾小管基底膜；Ⅵ型胶原分布于系膜区、肾小球基底膜和间质；I型胶原仅分布于肾间质，不存在于正常系膜基质、肾小球基底膜和肾小管基底膜中。
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二、胶原成分在MsPGN肾组织中的分布
(1)在MsPGN肾组织中Ⅳ型胶原、α1 (Ⅳ)链及Ⅵ型胶原含量高于正常对照(P<0.01)，并随着系膜细胞数的增加, 上述胶原含量亦增加(图1～3)，二者高度正相关(r=0.8，P<0.01)(附表)；(2)α1(Ⅳ)链的增加与Ⅳ型胶原增加相平行，二者呈正相关(r=0.8946，P<0.01)；Ⅵ型胶原的增加与Ⅳ型胶原的增加也相平行,二者呈正相关(r=0.7461，P<0.01)(附表)；(3)Ⅰ型胶原在系膜细胞增生超过4个的系膜区开始出现阳性，并在肾小球硬化的区域中染色呈阳性(附表，图4～6)；伴有肾小球硬化组中Ⅰ型胶原呈现阳性共有14个肾小球，来自于5例患儿，多为继发性MsPGN，IgA肾病1例、紫癜性肾炎2例、狼疮性肾炎1例、原发MsPGN患儿1例， 病程1个月～3年；(4)α3(Ⅳ)、α5(Ⅳ)在MsPGN中的分布同正常，主要在肾小球基底膜，但所有硬化肾小球区域内出现α3(Ⅳ)、α5(Ⅳ)染色阳性(附表)。
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讨论
MsPGN是临床上常见的肾小球病变，其病因、临床经过及其预后不尽相同，以往多数报道均认为MsPGN早期多以细胞增生为主、为早，随病变进展也将出现系膜基质的增多甚至以基质增生为主[3]。MsPGN也是儿童肾脏疾病常见病理类型之一，而且在儿童尤以轻度MsPGN最常见，即增生的系膜宽度不超过毛细血管直径，毛细血管腔呈开放状，无挤压现象[3]。但在均为轻度MsPGN的病变中各个肾小球的变化并非完全一致。我们在实验中观察到，轻度MsPGN各个肾小球系膜区平均系膜细胞数目可以从2至4个以上，有的肾小球甚至出现硬化。观察各个肾小球细胞外基质变化，并试图解释这种发生在各个肾小球间的不平行的病理变化，也许有助于我们理解疾病发生和发展机制。
正如其他研究者所报道[4～7]，在我们的实验中同样发现，正常肾小球系膜区含有的胶原成分主要为Ⅳ型、Ⅴ型及Ⅵ型胶原等，在系膜增生性的病变中这些作为细胞外基质中主要成分的胶原物质则随着系膜区系膜细胞数目的增加而增多，这种系膜细胞数与系膜基质成分变化的正相关关系仅发生在正常情况下原本存在于系膜区的胶原成分中，如本实验所观察的Ⅳ型胶原及其α1链和Ⅵ型胶原。但正常不存在于系膜区的间质胶原成分I型胶原，在系膜细胞增生至4个或4个以上时也出现于肾小球内。说明较重的系膜细胞增生病变，除了有正常系膜区存在的胶原成分的明显增加外，还伴有间质胶原在肾小球内的表达，从而可能影响系膜功能，加重肾脏损害[7]。本研究发现系膜细胞增生区出现间质性胶原表达的患者多为继发性MsPGN，这也许提示继发性肾小球肾炎的系膜细胞即便为轻度增生时，预后也可能较原发MsPGN差。同时本实验还观察到，Ⅳ型胶原α链在MsPGN中的变化是不平行的，即Ⅳ型胶原α1链变化与Ⅳ型胶原一致，而α3(Ⅳ)、α5(Ⅳ)链则与正常对照相比无变化。说明MsPGN时，不仅存在胶原成分数量的变化，同时还存在胶原成分的构成改变，从而影响细胞外基质的正常结构及其生物学功能，加重肾脏损害。
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本研究着重于观察轻度MsPGN肾组织标本中各个肾小球系膜区的平均系膜细胞数及其胶原的变化，发现在轻度MsPGN的肾组织中尚存在系膜细胞平均数仍正常(2个/系膜区)的肾小球，而这类肾小球中系膜区胶原成分(Ⅳ型胶原及其α1链，Ⅵ型胶原)已较正常肾小球显著增多，说明系膜基质扩张可先于系膜细胞的增生，虽然我们尚不能解释这一现象的病生理意义，但也许揭示了疾病发生早期的病理特征。
本研究观察的轻度MsPGN肾组织标本共含262个肾小球，其中14个肾小球出现硬化，硬化区内正常存在于肾小球系膜区的胶原成分(Ⅳ型胶原及其α1链，Ⅵ型胶原)均显著增多，而且间质胶原Ⅰ型胶原也全部出现阳性，呈现了硬化小球的特征[7,8]。另外，硬化小球内还出现了Ⅳ型胶原α3和α5链的表达。目前研究已证实Ⅳ型胶原的6个α链中α1和α2链与α3～α6链不但在正常肾组织中存在明显不同的分布，而且其细胞来源也不同。Ⅳ型胶原α1和α2链主要由系膜细胞产生，而α3～α6链可能主要来源于上皮细胞[9]。本研究显示轻度MsPGN出现硬化的肾小球内Ⅳ型胶原α3、α5链染色阳性，可能提示肾小球疾病发展至硬化时会累及多类肾小球细胞参与，抑或α3(Ⅳ)和α5(Ⅳ)链为原肾小球基底膜残痕，因为α3(Ⅳ)和α5(Ⅳ)链分布于正常肾小球的基底膜。
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图1～3 抗Ⅳ型胶原单克隆抗体在正常人及MsPGN患儿肾组织中的分布(免疫组化染色，光镜，×400) 图1 为正常组织， 图2 为轻度MsPGN， 图3 为轻度MsPGN伴肾小球硬化 图4～6 抗Ⅰ型胶原单克隆抗体在正常人及MsPGN患儿肾组织中的分布(免疫组化染色，光镜，×400) 图4 为正常组织， 图5 为轻度MsPGN， 图6 为轻度MsPGN伴肾小球硬化
参考文献
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