应用逆转录-聚合酶链反应鉴别呼吸道合胞病毒亚型
作者：朱汝南 耿学辉 王之梁 钱渊 邓洁 朱宗涵
单位：100020 北京，首都儿科研究所北京市感染与免疫中心实验室
关键词：呼吸道合胞病毒；聚合酶链反应
中华儿科杂志/980910 【摘要】 目的 为了使鉴别呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV) A、B亚型的方法更为简单、特异、有效。方法 根据RSV G蛋白编码基因的核苷酸序列设计一套引物，其中P1为亚型间通用的引物，P2和P3分别为A、B亚型特异性引物。将这些引物用于同一逆转录-聚合酶链 (RT-PCR)反应，A、B亚型株的扩增产物分别为277 bp 和863 bp，根据PCR产物的大小即可鉴别所测毒株的亚型。用这一方法对RSV原型株和9株我国分离株进行亚型鉴定。结果 分离株8株为A亚型，1株为B亚型，分型结果与单克隆抗体检测和基因序列分析完全相符。结论 RT-PCR方法鉴别呼吸道合胞病毒亚型具有快速、简便、敏感、特异等特点，适用于RSV临床标本的亚型分型及流行病学研究。
, 百拇医药
Identification of subgroups of respiratory syncytial virus by reverse transcription-polymerase chain reaction
Zhu Runan, Geng Xuehui, Wang Zhiliang, et al. Beijing Municipal Laboratory of Infection and Immunity, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020
【Abstract】 Objective To identify subgroups of respiratory syncytial virus (RSV) isolates.Methods A reverse transcription-polymerase chain reaction ( RT-PCR) was developed by using primer pool in PCR reaction. Three primers were designed based on nucleotide sequence of G protein genes of RSV prototype strains of subgroups A and B (Long and CH18537), which contained one primer for both subtypes and two for either subgroup A or B. Using these three primers in the same RT-PCR mixture, the strains tested could be easily differentiated as either subgroup A or B in agarose gel by the size of the PCR products ( 277 bp for subgroup A and 863 bp for subgroup B). The technique was used to determine the subgroups of 9 isolates of field strains of RSV. Results Eight of the 9 strains belonged to subgroup A and 1 was subgroup B, which was consistent with that obtained with the monoclonal antibody and gene sequencing of these strains. Conclusion The RT-PCR technique described here is of high specificity and sensitivity and can be used for identification of RSV field strains isolated from clinical specimens.
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【Key words】 R 【Key words】 Respiratory syncytial viruses Polymerase chain reaction
呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virus, RSV)自1956年首次分离成功以来一直被认为是世界范围婴幼儿下呼吸道感染、特别是2～6月龄的婴儿肺炎和毛细支气管炎最主要的病毒病原[1]。由于RSV 感染后机体产生的免疫反应不能有效地阻止RSV再次感染的发生，使RSV具有反复感染的特性。近年来，随着研究的不断深入，发现并证明RSV存在着A、B两个亚型，其亚型的存在可能与RSV的反复感染有关[2]。为更好地了解我国RSV的亚型分布及致病特征，作者利用RSV G蛋白基因在不同的亚型间高度变异这一特点，设计并建立了用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)鉴别RSV亚型的方法，并将该方法运用于我国RSV分离株的亚型鉴别，结果与传统的单克隆抗体分型及G蛋白基因全基因序列分析完全相符。
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材料和方法
一、材料 一、材料
1.RSV毒株：(1)原型株：A亚型原型株A2株和Long株；B亚型原型株CH18537株。其中A2株CH18537株由美国国立卫生院(NIH)Collins PL教授惠赠；Long株由中国预防医学科学院病毒所赠送。(2)分离株：分别从我国不同年份、不同地区、不同流行特征的下呼吸道感染患儿咽拭子标本中分离得到[3]。应用瑞典Karolinska研究所Norrby教授赠送的单克隆抗体和G蛋白全基因序列测定证明了亚型的9株分离株(A亚型：B79，B96，E10，E73，CC174，CC222，GZ134，GZ323，B亚型：CC169)。
2.引物：参考RSVA和B亚型原型株(Long株和CH18537株)的G蛋白编码基因的核苷酸序列[4]，设计3个引物(P1、P2和P3)。P1根据G蛋白基因5′端核苷酸序列设计，由于此处在不同亚型间高度保守，因此为A、B亚型通用引物；P2和P3分别根据G蛋白基因高变区的核苷酸序列设计，P2与A亚型G蛋白基因核苷酸(n.t.)261至277互补，因此期望与P1共同扩增A亚型G蛋白基因277 bp片段；而P3与B亚型G蛋白基因核苷酸846至863互补，因此期望与P1共同扩增B亚型863 bp片段，见附表。引物由上海生物工程公司合成。
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附表 用于RT-PCR扩增的寡核苷酸引物 引
物
位置
(n.t.)
序列
亚型
特征
扩增产
物(bp)
P1
1～ 21
5′GGGGCAAATGCAAACATGTCC3′
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A、B
P2
261～277
5′GGGGTTGTGTTCTTGATC3′
A
277
P3
846～863
5′GCTGTGGGTATTTGTGTG3′
B
863
3.试剂：(1)RNA尿素提取液：200 mmol NaCl，5 mmol依地酸(EDTA)，0.75 mmol MgCl2，0.35% NP40，10 mmol Tris-HCl(pH7.6)，5 mmol Urea，0.5%十二烷基硫酸钠SDS。(2)逆转录酶(M-MLV)，200 U/μl，购自BRL公司；Taq酶，5 U/μl，购自上海生物工程公司；Oligo dT，20 ng/μl，购自Sigma公司；RNasin，10 U/μl，购自华美公司。
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二、方法
1.病毒核酸提取：将2×(105～107) TCID50/0.2 ml RSV接种于已成片的Hep-2细胞试管内，33℃旋转培养，待CPE(++～+++)时收获。去上清，加入500 μl尿素提取液，500 μl等体积酚-氯仿和一高压灭菌玻璃珠，混旋振荡，将混旋液分装于1.5 ml离心管中，于4℃，12 000 r/min离心10分钟，取上层液相，加入等体积酚-氯仿抽提，取上层液相，加入1/10体积3 mmol醋酸钠和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30分钟。4℃，12 000 r/min离心10分钟，用1 ml 75%乙醇洗涤，4℃ 12 000 r/min离心10分钟，去上清，真空干燥，用60 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的H2O溶解核酸。
2.cDNA合成：取9.8 μl上述核酸加入2 μl Oligo-dT，混匀后70℃孵育5分钟。室温渐冷后加入5×M-MLV buffer 4 μl，25 mmol MgCl2 3 μl，25 mmol dNTPs 0.8 μl，RNasin 0.4 μl，M-MLV 1 μl，37℃1小时。
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3.PCR扩增：50 μl反应混和液包括上述cDNA合成反应液2 μl，50 mmol/L KCl，0.1% TritonX-100，10 mmol/L(pH9.0) Tris-HCl，1.5 mmol/L MgCl2，加入200 μmol/L dNTPs，Taq酶2U，引物P1、P2、P3各0.8 μmol/L。PCR反应条件为94℃1分钟，45℃1分钟，72℃1分钟，扩增30个循环。
4.RT-PCR产物的鉴定：取10 μl RT-PCR产物在含0.5 μg/ml溴化乙啶(EB)的1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外灯下观察扩增后的DNA条带。RT-PCR反应设正常Hep-2细胞和RSV A、B亚型原型株对照。结果
一、对原型株检测的结果 一、对原型株检测的结果
在同一PCR反应管中加入3个引物，5′端引物P1无亚型特异性，3′端为具有亚型特异性的引物P2和P3。由于A、B亚型特异性引物的位置不同，因此原型株G蛋白cDNA经PCR扩增后在A亚型原型株(A2株和Long株)反应产物中仅可见一条约277 bp扩增片段，而B亚型原型株(CH18537株)反应产物中可见一条约863 bp片段的扩增产物，在400bp左右位置有一极弱的非特异性扩增产物，但并不影响结果的判定。说明引物P2和P3具有良好的亚型特异性，A、B亚型间无交叉反应。在正常Hep-2细胞作模板的RT-PCR反应管中无扩增产物，说明细胞培养物对RT-PCR扩增无非特异性反应。
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二、对分离株检测的结果
运用RT-PCR对9株已经序列分析鉴定了亚型(8株A亚型和1株B亚型)的RSV我国分离株进行检测，在8株A亚型分离株中均扩增出277 bp左右的DNA片段，1株B亚型分离株的检测结果同CH18537株，A、B亚型分离株间无交叉反应，见附图。
讨论
RSV为婴幼儿下呼吸道感染的最重要的病毒病原，其核酸至少编码10个病毒特异性蛋白，其中两种表面糖蛋白，即F和G蛋白是激发机体产生特异性保护抗体的最主要的病毒抗原[5，6]。但RSV不同
M：标准DNA分子量，PBR322/BSTN1；1、2、6～13：分别为原型株A2和Long株及分离株B79、B96、E10、E73、CC174、CC222、GZ134、GZ323的扩增结果，都有277 bp的扩增产物；3、5：分别为CH18537和CC169的扩增结果，都有863bp的扩增产物；4：Hep-2细胞阴性对照附图 RT-PCR对RSV亚型鉴别结果
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亚型间G蛋白的氨基酸同源性只有53%，抗原相关性仅为5%[6]。RSV不同亚型间的G蛋白抗体之间缺乏交叉保护作用。因此，RSV亚型的存在可能同RSV的反复感染有关。RSV感染在我国不但南北方的流行高峰季节不同，而且还具有散发和暴发流行的特征。这些特性是否与RSV的亚型变异有关，亟待研究。
由于我国已有的RSV单克隆抗体缺乏亚型特异性[7]，因此目前国内对RSV的亚型鉴定只能依赖国外提供的少量单克隆抗体，妨碍了我国RSV亚型分布和致病特征的研究。作者参考国外文献，选择RSV亚型特征最显著的G蛋白编码基因为模板，设计了3个引物，其中5′端引物P1为A、B亚型的通用引物。该段核苷酸序列在目前已知的RSV A、B亚型分离株中变异很少或无变异。而P2和P3则分别为亚型特异性引物，此两段引物的核苷酸序列在不同亚型间高度变异，而在同一亚型的不同毒株间高度保守。且由于P2和P3的核苷酸位置不同，因此不同亚型毒株扩增出的DNA片段大小差异显著，结果一目了然。利用RT-PCR方法对9株不同亚型分离株的检测结果同利用国外单克隆抗体及G蛋白的全基因序列分析结果完全相符，说明该方法具有可靠的亚型特异性。目前，作者正在应用此方法对大量临床分离株进行亚型鉴别。
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此外，作者采用尿素法提取病毒核酸，该方法简单易行，无毒，价格低廉，结果稳定，从而大大简化了RT-PCR的操作过程，使该方法具有简捷快速、敏感特异、结果稳定客观的特性，从而为我国RSV的临床诊断、流行病学监测及RSV感染的免疫预防提供了新的方法。
参考文献
1 Collins PL, McIntosh K, Chanock RM. Respiratory syncytial virus. In: Fields BN. 3rd ed. Philadelphia: Lippincott, 1996.1313-1351.
2 Sullender WM, Mufson MA, Anderson LJ,et al. Genetic diversity of the attachment protein of subgroup B respiratory syncytial viruses. J Virol,1991,65：5425-5434.
, http://www.100md.com
3 耿学辉，朱汝南，孙晓鸥，等.我国部分地区呼吸道合胞病毒分离株的亚型鉴定.中华儿科杂志,1997，35：405-740.
4 Johnson PR, Spriggs MK, Olmsted RA, et al. The G glycoprotein of human respiratory syncytial virus of subgroup A and B：extensive sequence divergence between antigenically related proteins.Proc Natl Acad Sci USA,1987,84：5625-5629.
5 Walsh EE, Schlesinger JJ, Brandriss MW, et al. Protection from respiratory syncytial virus infection in cotton rats by passive transfer of monoclonal antibodies. Infect Immun,1984,43：756-758.
6 Taylor G, Stott EJ, Bew M, et al. Monoclonal antibodies protect against respiratory syncytial virus in mice. Immunology, 1984,52：137-142.
7 杜金林，王之梁，刘成贵，等.我国呼吸道合胞病毒抗原亚型初步探讨.微生物学报，1991,31：488-491.
(收稿：1997-09-23 修回：1998-03-16), http://www.100md.com
单位：100020 北京，首都儿科研究所北京市感染与免疫中心实验室
关键词：呼吸道合胞病毒；聚合酶链反应
中华儿科杂志/980910 【摘要】 目的 为了使鉴别呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV) A、B亚型的方法更为简单、特异、有效。方法 根据RSV G蛋白编码基因的核苷酸序列设计一套引物，其中P1为亚型间通用的引物，P2和P3分别为A、B亚型特异性引物。将这些引物用于同一逆转录-聚合酶链 (RT-PCR)反应，A、B亚型株的扩增产物分别为277 bp 和863 bp，根据PCR产物的大小即可鉴别所测毒株的亚型。用这一方法对RSV原型株和9株我国分离株进行亚型鉴定。结果 分离株8株为A亚型，1株为B亚型，分型结果与单克隆抗体检测和基因序列分析完全相符。结论 RT-PCR方法鉴别呼吸道合胞病毒亚型具有快速、简便、敏感、特异等特点，适用于RSV临床标本的亚型分型及流行病学研究。
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Identification of subgroups of respiratory syncytial virus by reverse transcription-polymerase chain reaction
Zhu Runan, Geng Xuehui, Wang Zhiliang, et al. Beijing Municipal Laboratory of Infection and Immunity, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020
【Abstract】 Objective To identify subgroups of respiratory syncytial virus (RSV) isolates.Methods A reverse transcription-polymerase chain reaction ( RT-PCR) was developed by using primer pool in PCR reaction. Three primers were designed based on nucleotide sequence of G protein genes of RSV prototype strains of subgroups A and B (Long and CH18537), which contained one primer for both subtypes and two for either subgroup A or B. Using these three primers in the same RT-PCR mixture, the strains tested could be easily differentiated as either subgroup A or B in agarose gel by the size of the PCR products ( 277 bp for subgroup A and 863 bp for subgroup B). The technique was used to determine the subgroups of 9 isolates of field strains of RSV. Results Eight of the 9 strains belonged to subgroup A and 1 was subgroup B, which was consistent with that obtained with the monoclonal antibody and gene sequencing of these strains. Conclusion The RT-PCR technique described here is of high specificity and sensitivity and can be used for identification of RSV field strains isolated from clinical specimens.
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【Key words】 R 【Key words】 Respiratory syncytial viruses Polymerase chain reaction
呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virus, RSV)自1956年首次分离成功以来一直被认为是世界范围婴幼儿下呼吸道感染、特别是2～6月龄的婴儿肺炎和毛细支气管炎最主要的病毒病原[1]。由于RSV 感染后机体产生的免疫反应不能有效地阻止RSV再次感染的发生，使RSV具有反复感染的特性。近年来，随着研究的不断深入，发现并证明RSV存在着A、B两个亚型，其亚型的存在可能与RSV的反复感染有关[2]。为更好地了解我国RSV的亚型分布及致病特征，作者利用RSV G蛋白基因在不同的亚型间高度变异这一特点，设计并建立了用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)鉴别RSV亚型的方法，并将该方法运用于我国RSV分离株的亚型鉴别，结果与传统的单克隆抗体分型及G蛋白基因全基因序列分析完全相符。
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材料和方法
一、材料 一、材料
1.RSV毒株：(1)原型株：A亚型原型株A2株和Long株；B亚型原型株CH18537株。其中A2株CH18537株由美国国立卫生院(NIH)Collins PL教授惠赠；Long株由中国预防医学科学院病毒所赠送。(2)分离株：分别从我国不同年份、不同地区、不同流行特征的下呼吸道感染患儿咽拭子标本中分离得到[3]。应用瑞典Karolinska研究所Norrby教授赠送的单克隆抗体和G蛋白全基因序列测定证明了亚型的9株分离株(A亚型：B79，B96，E10，E73，CC174，CC222，GZ134，GZ323，B亚型：CC169)。
2.引物：参考RSVA和B亚型原型株(Long株和CH18537株)的G蛋白编码基因的核苷酸序列[4]，设计3个引物(P1、P2和P3)。P1根据G蛋白基因5′端核苷酸序列设计，由于此处在不同亚型间高度保守，因此为A、B亚型通用引物；P2和P3分别根据G蛋白基因高变区的核苷酸序列设计，P2与A亚型G蛋白基因核苷酸(n.t.)261至277互补，因此期望与P1共同扩增A亚型G蛋白基因277 bp片段；而P3与B亚型G蛋白基因核苷酸846至863互补，因此期望与P1共同扩增B亚型863 bp片段，见附表。引物由上海生物工程公司合成。
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附表 用于RT-PCR扩增的寡核苷酸引物 引
物
位置
(n.t.)
序列
亚型
特征
扩增产
物(bp)
P1
1～ 21
5′GGGGCAAATGCAAACATGTCC3′
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A、B
P2
261～277
5′GGGGTTGTGTTCTTGATC3′
A
277
P3
846～863
5′GCTGTGGGTATTTGTGTG3′
B
863
3.试剂：(1)RNA尿素提取液：200 mmol NaCl，5 mmol依地酸(EDTA)，0.75 mmol MgCl2，0.35% NP40，10 mmol Tris-HCl(pH7.6)，5 mmol Urea，0.5%十二烷基硫酸钠SDS。(2)逆转录酶(M-MLV)，200 U/μl，购自BRL公司；Taq酶，5 U/μl，购自上海生物工程公司；Oligo dT，20 ng/μl，购自Sigma公司；RNasin，10 U/μl，购自华美公司。
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二、方法
1.病毒核酸提取：将2×(105～107) TCID50/0.2 ml RSV接种于已成片的Hep-2细胞试管内，33℃旋转培养，待CPE(++～+++)时收获。去上清，加入500 μl尿素提取液，500 μl等体积酚-氯仿和一高压灭菌玻璃珠，混旋振荡，将混旋液分装于1.5 ml离心管中，于4℃，12 000 r/min离心10分钟，取上层液相，加入等体积酚-氯仿抽提，取上层液相，加入1/10体积3 mmol醋酸钠和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30分钟。4℃，12 000 r/min离心10分钟，用1 ml 75%乙醇洗涤，4℃ 12 000 r/min离心10分钟，去上清，真空干燥，用60 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的H2O溶解核酸。
2.cDNA合成：取9.8 μl上述核酸加入2 μl Oligo-dT，混匀后70℃孵育5分钟。室温渐冷后加入5×M-MLV buffer 4 μl，25 mmol MgCl2 3 μl，25 mmol dNTPs 0.8 μl，RNasin 0.4 μl，M-MLV 1 μl，37℃1小时。
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3.PCR扩增：50 μl反应混和液包括上述cDNA合成反应液2 μl，50 mmol/L KCl，0.1% TritonX-100，10 mmol/L(pH9.0) Tris-HCl，1.5 mmol/L MgCl2，加入200 μmol/L dNTPs，Taq酶2U，引物P1、P2、P3各0.8 μmol/L。PCR反应条件为94℃1分钟，45℃1分钟，72℃1分钟，扩增30个循环。
4.RT-PCR产物的鉴定：取10 μl RT-PCR产物在含0.5 μg/ml溴化乙啶(EB)的1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外灯下观察扩增后的DNA条带。RT-PCR反应设正常Hep-2细胞和RSV A、B亚型原型株对照。结果
一、对原型株检测的结果 一、对原型株检测的结果
在同一PCR反应管中加入3个引物，5′端引物P1无亚型特异性，3′端为具有亚型特异性的引物P2和P3。由于A、B亚型特异性引物的位置不同，因此原型株G蛋白cDNA经PCR扩增后在A亚型原型株(A2株和Long株)反应产物中仅可见一条约277 bp扩增片段，而B亚型原型株(CH18537株)反应产物中可见一条约863 bp片段的扩增产物，在400bp左右位置有一极弱的非特异性扩增产物，但并不影响结果的判定。说明引物P2和P3具有良好的亚型特异性，A、B亚型间无交叉反应。在正常Hep-2细胞作模板的RT-PCR反应管中无扩增产物，说明细胞培养物对RT-PCR扩增无非特异性反应。
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二、对分离株检测的结果
运用RT-PCR对9株已经序列分析鉴定了亚型(8株A亚型和1株B亚型)的RSV我国分离株进行检测，在8株A亚型分离株中均扩增出277 bp左右的DNA片段，1株B亚型分离株的检测结果同CH18537株，A、B亚型分离株间无交叉反应，见附图。
讨论
RSV为婴幼儿下呼吸道感染的最重要的病毒病原，其核酸至少编码10个病毒特异性蛋白，其中两种表面糖蛋白，即F和G蛋白是激发机体产生特异性保护抗体的最主要的病毒抗原[5，6]。但RSV不同
M：标准DNA分子量，PBR322/BSTN1；1、2、6～13：分别为原型株A2和Long株及分离株B79、B96、E10、E73、CC174、CC222、GZ134、GZ323的扩增结果，都有277 bp的扩增产物；3、5：分别为CH18537和CC169的扩增结果，都有863bp的扩增产物；4：Hep-2细胞阴性对照附图 RT-PCR对RSV亚型鉴别结果
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亚型间G蛋白的氨基酸同源性只有53%，抗原相关性仅为5%[6]。RSV不同亚型间的G蛋白抗体之间缺乏交叉保护作用。因此，RSV亚型的存在可能同RSV的反复感染有关。RSV感染在我国不但南北方的流行高峰季节不同，而且还具有散发和暴发流行的特征。这些特性是否与RSV的亚型变异有关，亟待研究。
由于我国已有的RSV单克隆抗体缺乏亚型特异性[7]，因此目前国内对RSV的亚型鉴定只能依赖国外提供的少量单克隆抗体，妨碍了我国RSV亚型分布和致病特征的研究。作者参考国外文献，选择RSV亚型特征最显著的G蛋白编码基因为模板，设计了3个引物，其中5′端引物P1为A、B亚型的通用引物。该段核苷酸序列在目前已知的RSV A、B亚型分离株中变异很少或无变异。而P2和P3则分别为亚型特异性引物，此两段引物的核苷酸序列在不同亚型间高度变异，而在同一亚型的不同毒株间高度保守。且由于P2和P3的核苷酸位置不同，因此不同亚型毒株扩增出的DNA片段大小差异显著，结果一目了然。利用RT-PCR方法对9株不同亚型分离株的检测结果同利用国外单克隆抗体及G蛋白的全基因序列分析结果完全相符，说明该方法具有可靠的亚型特异性。目前，作者正在应用此方法对大量临床分离株进行亚型鉴别。
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此外，作者采用尿素法提取病毒核酸，该方法简单易行，无毒，价格低廉，结果稳定，从而大大简化了RT-PCR的操作过程，使该方法具有简捷快速、敏感特异、结果稳定客观的特性，从而为我国RSV的临床诊断、流行病学监测及RSV感染的免疫预防提供了新的方法。
参考文献
1 Collins PL, McIntosh K, Chanock RM. Respiratory syncytial virus. In: Fields BN. 3rd ed. Philadelphia: Lippincott, 1996.1313-1351.
2 Sullender WM, Mufson MA, Anderson LJ,et al. Genetic diversity of the attachment protein of subgroup B respiratory syncytial viruses. J Virol,1991,65：5425-5434.
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3 耿学辉，朱汝南，孙晓鸥，等.我国部分地区呼吸道合胞病毒分离株的亚型鉴定.中华儿科杂志,1997，35：405-740.
4 Johnson PR, Spriggs MK, Olmsted RA, et al. The G glycoprotein of human respiratory syncytial virus of subgroup A and B：extensive sequence divergence between antigenically related proteins.Proc Natl Acad Sci USA,1987,84：5625-5629.
5 Walsh EE, Schlesinger JJ, Brandriss MW, et al. Protection from respiratory syncytial virus infection in cotton rats by passive transfer of monoclonal antibodies. Infect Immun,1984,43：756-758.
6 Taylor G, Stott EJ, Bew M, et al. Monoclonal antibodies protect against respiratory syncytial virus in mice. Immunology, 1984,52：137-142.
7 杜金林，王之梁，刘成贵，等.我国呼吸道合胞病毒抗原亚型初步探讨.微生物学报，1991,31：488-491.
(收稿：1997-09-23 修回：1998-03-16), http://www.100md.com