巨细胞病毒感染对细胞凋亡及bcl-2和fas基因表达的影响初探
作者：李红 董永绥 方峰 李革
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院儿科教研室
关键词：巨细胞病毒感染；脱噬作用；基因；bcl-2；基因表达
中华儿科杂志981102 【摘要】 目的 探讨巨细胞病毒(CMV)感染与细胞凋亡的关系。方法 利用凋亡细胞原位检测技术，结合PI染色法流式细胞DNA含量分析术，检测了体外CMV AD169毒株感染的宿主细胞(人胚肺成纤维细胞，HEL)及体内CMV性肝炎患儿肝组织内细胞的凋亡发生情况，并应用原位核酸分子杂交和图像分析技术观察了CMV 感染对细胞凋亡调控基因bcl-2和fas表达的影响。结果 体内外CMV感染均能明显诱导细胞凋亡的发生，同时CMV感染使肝细胞及HEL细胞内的bcl-2基因表达降低，而使fas基因表达上调。结论 CMV感染诱导细胞凋亡可能是通过影响bcl-2和fas基因的表达而实现的，这种凋亡规律的异常可能参与了CMV性疾病的发生与发展。
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Effect of cytomegalovirus infection on apoptosis and expressions of bcl-2 and fas mRNA Li Hong, Dong Yongsui, Fang Feng, et al. Department of Pediatrics, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To explore the relationship between cytomegalovirus (CMV) infection and the frequency of apoptosis. Methods The authors detected the human embryonic lung (HEL) fibroblast cells infected with CMV in vitro and hepatic tissues of CMV hepatitis with in situ end-labeling (TUNEL) apoptotic cell detection method and flow cytometric cell cycle analysis, and also investigated the expressions of bcl-2 and fas mRNA by means of in situ hybridization techniques and image analysis system. Results CMV infection enhanced apoptosis significantly in vitro and in vivo (both P<0.01). Meanwhile, higher expression of fas-mRNA and lower expression of bcl-2 mRNA were found in hepatic tissues of CMV hepatitis patients and CMV-infected HEL cells than that in the normal control. Conclusion These studies demonstrate that abnormal expressions of bcl-2 and fas mRNA may be involved in the pathological mechanisms of diseases assosiated with CMV-infection.
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【Key words】 Cytomegalovirus infections Apoptosis Genes, bcl-2 Gene expression
细胞凋亡是单个细胞受其内在基因编程调节，通过主动的生化过程，而自杀死亡的现象[1]。凋亡规律失常已被认为是许多疾病的重要发病机制。近年研究发现，许多病毒性疾病(如病毒性肝炎，艾滋病等)的发生与细胞凋亡有关[2]。巨细胞病毒(CMV)感染极为普遍，它常可致先天性畸形、中枢神经系统损害、小儿肝炎、肺炎、视网膜病等各种疾病[3]。然而，目前有关CMV感染是否也存在着凋亡规律的异常，国内外研究甚少。作者通过检测体内CMV感染所致CMV性肝炎患儿的肝组织及体外CMV AD169感染的人胚肺成纤维细胞(HEL)内凋亡发生情况，以及CMV感染对凋亡调控基因B cell lymphoma-leukemia-2(bcl-2)和fas 表达的影响，探讨CMV感染与细胞凋亡的相互关系。
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材料和方法
一、材料
1.细胞：自制HEL，取自妊娠4个月水囊引产的胚胎，经常规原代细胞培养方法，制成单层细胞，第10～20代用于本实验。
2.病毒：CMV AD169病毒株，由中国预防医学科学院病毒研究所提供。
3.标本来源：1994年8月～1995年8月，同济医院儿科感染病房收治的临床诊断为婴儿黄疸型CMV肝炎患儿的肝组织标本(包括活检及尸检标本)，共7例，其血清抗CMV-IgM、IgG经酶联免疫吸附(ELISA)方法检测(Human公司试剂盒)均为阳性，并排除甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等感染。另选3例成人胆结石术中所取正常肝组织标本为对照，亦排除HAV、HBV、HCV等感染。上述肝组织经10%福尔马林固定，石蜡包埋处理。作5μm厚连续切片备用。
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4.试剂：抗巨细胞病毒即刻早期抗原(CMV-IEA)单抗由美国UAB儿童医院Britt教授提供(1:100)。过氧化物酶抗过氧化物酶法(PAP)免疫染色试剂由同济医科大学附属同济医院临床免疫研究室提供。地高辛标记与检测试剂盒以及细胞凋亡原位检测试剂盒均为Boehringer Mannheim公司产品。含bcl-2 cDNA及fas-cDNA片段的质粒由同济医科大学免疫教研室惠赠。bcl-2 cDNA片段长度为2.0 kb，于EcoR I 单酶切位点插入载体Bluescript质粒中，经氯化钙渗透法转化入JM101菌株； fas-cDNA 片段长度为2.3 kb，于BamHI及XBaI酶切位点插入载体pUC18，经氯化钙渗透法转化TG1菌株，再按常规方法提取质粒DNA，经酶切，回收，纯化后，获得bcl-2及fas cDNA探针。
二、方法
1.细胞培养及病毒感染：将HEL细胞按1×105/ml分种于内含飞片的24孔板，待细胞成片后，按100半数组织培养感染量(TCID50)/0.1ml浓度接种CMV AD169病毒，37℃,5% CO2箱内吸附2小时，弃上清，用含2%小牛血清的培养液洗涤1次，换新鲜培养液，继续在上述条件下培养，隔3天换液一次，同时设正常细胞对照组。待细胞出现典型病变时，取出小飞片，磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗1次，风干，置4%多聚甲醛内，室温下固定30分钟后，4℃保存；同时用0.25%胰酶将培养孔内细胞消化下来，制成单细胞悬液，800 r/min，离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用PBS洗2次，用70% 冷乙醇固定，4℃保存。
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2. 肝组织抗CMV-IEA检测：采用PAP法[4]，检测肝组织内CMV-IEA表达情况。显微镜下，细胞核为棕黄色者，即为CMV-IEA阳性细胞。同时检测CMV感染的人胚肺细胞飞片，设为阳性对照；阴性对照用PBS代替特异性第一抗体。
3.凋亡细胞原位检测： 石蜡切片脱蜡，逐级水化，蛋白酶K(20μg/ml)37℃消化20分钟。PBS(pH值7.4)将组织切片和细胞飞片洗5分钟，3次；滴加 50μl反应液(5μl 10×末端脱氧核苷酸转移酶溶液及45 μl dNTP反应混合液，用前现配)，37℃孵育1小时，PBS洗5分钟，3次，滴加50μl抗体-过氧化物酶联结物，37℃30分钟，PBS洗5分钟，3次；加入50μl DAB底物显色液，室温10分钟，PBS洗5分钟，3次，常规脱水透明，封片镜检。显微镜下，胞核黄色着染者为阳性凋亡细胞。阳性对照：用DNase I(20 μg/ml)在室温下处理组织片和细胞片，以诱导DNA链的断裂。阴性对照：加入的TUNEL反应液中不含末端脱氧核苷酸转移酶。每张切片至少观察500个细胞，计算凋亡发生率。
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4.DNA含量的流式细胞仪测定：取出经70%冷乙醇固定的HEL单细胞悬液，PBS(pH值7.4)洗，离心后去除固定液，加碘化丙锭(PI)染色液(含50 μg/ml PI，0.1%Triton X-100，100 μg/ml RNase A)，混匀，4℃，避光30分钟后，应用流式细胞仪FACStar(美国BD公司)检测，低于G1期DNA含量主峰(亚G1期峰)的细胞为凋亡细胞。
5.原位杂交：bcl-2和fas基因mRNA原位杂交检测参考文献[5，6]加以改进，石蜡切片脱蜡至水，蛋白酶K(100 μg/ml)消化20分钟；4%多聚甲醛固定5分钟后，乙醇逐级脱水，37℃湿盒内预杂交2小时，滴加杂交液(其中的探针预先经98℃变性后，立即置冰中5分钟，再加入到预杂交液中，探针终浓度为2 ng/μl)，42℃湿盒中杂交36小时。再加入Dig-辣根过氧化物酶(1:500)，37℃湿盒内1小时，之后按试剂盒说明进行显色，结果满意后，PBS-DEPC水洗终止，乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片镜检，设不加探针的阴性对照和RNase处理后的阴性对照。杂交结果进行计算机图像分析处理。
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三、统计学处理
数据以均数±标准差(
±s)表示，采用t或χ2检验进行比较分析，P<0.05时，差别有显著意义。
结果
一、肝组织抗CMV-IEA检测结果
7例CMV性肝炎患儿的肝组织内均可见到细胞核呈黄色着染的肝细胞(图1a)，提示为CMV感染的肝组织，这与标本选择时，血清抗CMV检测结果一致；而3例正常对照的肝组织经PAP法检测未见阳性细胞，证实为非CMV感染(图1b)。
二、体内外CMV感染对细胞凋亡发生的影响
1.CMV感染的肝细胞凋亡情况：在肝组织切片中，7例CMV感染者的肝组织内肝细胞凋亡发生率为53.7%(图2a)；而3例非CMV感染者的肝细胞凋亡发生率为7.2%(图2b)，经χ2检验，P<0.01，差异有显著性意义。
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2.CMV感染的HEL细胞凋亡情况：(1)经凋亡细胞原位检测结果显示：正常HEL细胞呈梭形排列，其中可见阳性凋亡细胞单个散在分布，阳性率为3.7%(图3a)；而病毒感染对照组中，受CMV感染的HEL细胞变大变圆,阳性细胞多为发生病变的病毒感染细胞，阳性率为34.4%(图3b)，经χ2检验，P<0.01，差异有显著性意义；(2)经流式细胞仪测定结果显示：正常细胞组在DNA直方图上表现为G0/G1、S、G2、M期(图4)；而病毒感染组则在G1峰左侧有一亚二倍体细胞群的峰型(亚G1峰)，提示发生细胞凋亡(图4)。
左图：正常HEL细胞周期；右图：CMV感染的HEL细胞，在G1峰左侧可见一典型的凋亡峰型(亚G1峰)
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图4 DNA含量的流式细胞仪检测
三、bcl-2和fas基因mRNA原位杂交检测结果
1.bcl-2 mRNA的表达：杂交结果显示，CMV感染组及正常对照组均有阳性杂交反应物，经计算机图像分析仪定量测定，二者bcl-2表达水平的比较见表1。实验发现，组织切片中CMV性肝炎患儿肝组织bcl-2表达水平明显低于正常肝组织，差异有显著意义(P<0.01)，杂交结果见图5a、图5b。细胞飞片中CMV感染组HEL表达bcl-2水平亦明显低于正常细胞对照组(P<0.01)，杂交结果见图5c、图5d。
表1 CMV感染者bcl-2表达水平的改变(±s) 分组
bcl-2表达的平均积分光度
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组织切片中
细胞飞片中
CMV感染组
1.48±0.13*
1.72±0.19*
正常对照组
6.62±0.21
9.52±0.20
* 感染组与正常对照组相比，P<0.01 2.fas mRNA的表达：杂交阳性信号为紫蓝色或棕蓝色颗粒，在肝组织中呈片状或灶状分布，主要在肝细胞胞核区及胞核周边区域。10例肝组织内fas-mRNA均有不同程度的表达。经计算机图像分析，7例CMV感染者肝组织内fas表达的水平明显高于3例非CMV感染者(P<0.01)，差异有极显著意义(表2)，杂交结果见图6a、图6b；细胞飞片中CMV感染组HEL的fas表达水平亦明显高于正常对照组(P<0.01)，差异有显著意义(表2)，杂交结果见图6c、图6d。
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表2 CMV感染者fas表达水平的改变(±s) 分组
fas表达的平均积分光度
组织切片中
细胞飞片中
CMV感染组
6.71±0.35*
8.42±0.15*
正常对照组
1.52±0.26
2.47±0.12
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* 感染组与正常对照组相比，P<0.01讨论
一、 CMV感染与细胞凋亡
自1956年从组织培养中分离成功CMV以来，世界各地已对人类CMV感染进行了广泛而全面的研究。现知CMV不仅能使不同年龄人群普遍感染，亦是引起小儿各种畸形和病残的重要病因之一。胎儿和新生儿感染后，虽然多数无症状，但仍有不少患儿产生严重损害，包括小头畸形、生长发育迟缓、智力障碍和感觉神经性耳聋等。近年来，又发现CMV感染是器官移植失败和艾滋病患者死亡的重要原因之一[7]。因此，对CMV感染的研究，一直是全世界医学专家十分关注的课题。目前，对CMV感染的发病机制尚未阐明。
早在1972年Kerr等[1]就描述了形态上不同于坏死性细胞死亡(necrotic cell death)的另一种细胞死亡形式，他称之为凋亡性细胞死亡(apoptosic cell death)。但直至最近才认识到细胞以凋亡方式主动“自杀”对维持自身稳定具有重要的积极意义[8～10]。人类许多疾病和病理生理现象都与细胞凋亡的紊乱有关，其中凋亡异常增加已被认为是病毒性疾病(如艾滋病、病毒性肝炎)的重要发病机制。然而，有关巨细胞病毒感染与细胞凋亡的关系，国内外报道甚少。
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目前，细胞凋亡的检测方法包括形态学观察，DNA降解片段电泳分析[11]，流式细胞术DNA含量分析[12]，DNA片段原位末端标记[13]等。作者选用凋亡细胞原位检测技术，检测了7例CMV 性肝炎患儿的肝组织，发现其肝细胞凋亡发生率为53.72%，明显高于3例非CMV感染正常肝组织的7.19%，首次证实了体内CMV 感染能诱导肝细胞凋亡的发生。同时我们在体外建立CMV AD169病毒株感染其宿主细胞(HEL)的模型，用同样的方法，结合PI染色法流式细胞DNA含量分析术，发现病毒感染的细胞出现较为典型的亚二倍体峰型，病毒感染对照组凋亡发生率为33.2% ，也明显高于正常细胞对照组的3.1% ，从而进一步证实了CMV感染可诱导细胞凋亡异常增加。
二、CMV感染对凋亡调控基因bcl-2和fas mRNA表达的影响
许多实验证实细胞凋亡过程涉及到一些细胞死亡调节基因的活化，凋亡是在这些基因调控下的主动“细胞自杀”[14]。目前已发现有三类细胞凋亡相关基因，即在细胞凋亡过程中表达的基因、促进细胞凋亡的基因和抑制细胞凋亡的基因。
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fas基因是目前研究较为深入的一个凋亡促进基因，它属于TNF受体家族，富含于胸腺、肝、心、肾、肺及卵巢。它编码的蛋白Fas与其配体(FasL)组成的Fas系统在病毒性肝炎肝细胞凋亡的发生和发展中起着重要作用，病毒感染刺激肝细胞表面大量表达Fas，同时刺激CTL细胞大量表达FasL，Fas和FasL结合，通过细胞毒作用，导致肝细胞凋亡，这一过程正常发生，感染病毒的细胞将被清除，过程若被放大则可能导致暴发性肝炎[15]。
bcl-2是从小鼠B淋巴细胞瘤中分离得到的原癌基因，它被认为是细胞凋亡抑制基因，在多种正常细胞的激活和发育过程中表达，而在成熟或走向凋亡的细胞中不表达或低表达，它能抑制许多因素引起的细胞凋亡[16，17]。
在本实验中，应用原位杂交技术检测了体内CMV感染的肝组织及体外CMV感染的HEL细胞中bcl-2 和fas 基因mRNA的表达，研究结果发现，CMV感染使肝细胞及HEL细胞的bcl-2基因表达降低，而使fas 基因表达上调。从而提示，CMV感染诱导细胞凋亡可能是通过影响bcl-2 和fas 基因的表达而实现的。
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由此作者推测，是否因CMV感染引起Fas系统功能亢进，使得肝细胞凋亡异常增加，引起肝脏受损，导致了CMV性肝炎的发生和发展。但是，CMV感染是如何诱导fas表达增强，有无FasL的增强，以及Fas系统在细胞凋亡中究竟充当什么角色，值得深入研究。
图1 肝组织抗CMV-IEA免疫组化结果 1a：CMV性肝炎患儿肝组织，黄色着染者为CMV感染的阳性细胞； 1b：正常肝组织，HE×400
图2 肝组织凋亡原位检测 2a：CMV性肝炎患儿肝组织，凋亡肝细胞核呈棕黄色，染色不均匀，多集中于核膜下，呈不规则环形，亦有集中于一侧，呈半月形；未凋亡细胞非特异性染色极浅；而坏死组织染色呈片状，细胞轮廓不清，染色呈均一深黄色斑片； 2b：正常肝组织，凋亡细胞较少，HE×120
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图3 HEL细胞凋亡原位检测 3a：正常HEL细胞，呈梭形排列，阳性凋亡细胞单个散在分布； 3b：CMV感染的HEL细胞，细胞变大，变圆，阳性细胞多为发生病变的病毒感染细胞，×120
图5 原位杂交bcl-2基因mRNA表达情况 5a：CMV性肝炎患儿肝组织，×60； 5b：正常肝组织，×60； 5c：CMV感染的HEL细胞，×120； 5d：正常HEL细胞，×120
图6 原位杂交fas基因mRNA表达情况 6a：CMV性肝炎患儿肝组织，×60； 6b：正常肝组织，×60； 6c：CMV感染的HEL细胞，×120； 6d:正常HEL细胞，×120
参考文献
1 Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissues kinetics. Br J Cancer, 1972, 26: 239-257.
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3 徐桂林，朱丹红，陈嘉华，等. 199例产妇及其新生儿巨细胞病毒感染的分析.中华妇产科杂志，1989，24：130-132.
4 张明，董永绥，方峰，等. 婴儿巨细胞病毒性肝炎外周白细胞巨细胞病毒感染.中华儿科杂志，1995, 33：10-12.
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6 Polak JM, McGee JO. In situ hybridization: principles and practice. New York: Oxford, 1990. 59-73.
7 董永绥.继续深入进行巨细胞病毒感染的研究. 中华儿科杂志, 1995, 33：3-4.
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9 Allen PD, Bustin SA, Newland AC. The role of apoptosis (programmed cell death) in haemapoiesis and the immune system. Blood Rev, 1993, 7: 63-67.
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10 Martin SJ, Green DR. Apoptosis and cancer: the failure of control on cell death and cell survival. Cri Rev Oncol Hematol, 1995, 18: 137-143.
11 Cohen JJ. Programmed cell death in the immune system. Adv Immunol, 1991, 50: 55-59.
12 Telford WG, King LE, Fraker PJ. Comparative evaluation of several DNA binging dyes in the detection of apoptosis associated chromatin degration by flow cytometry. Cytometry, 1992, 13: 137-142.
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13 Wijsman JH, Jonker RR, Keijzer R, et al. A new method to detect apoptosis in paraffin section: in situ end-labeling of fragmented DNA. J Histochem Cytochem, 1993, 41: 7-12.
14 Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide. Science, 1995, 267: 1445-1448.
15 Martin SJ, Green DR. Protease activation during apoptosis: death by a thous and cuts? Cell, 1995, 82: 349-353.
16 Korsmeyer SJ. Bcl-2 initates a new category of oncogenes: regulators of cell death. Blood, 1992, 80: 879-886.
17 Hockenbery D, Nunez G, Milliman C, et al. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death. Nature, 1990, 348: 334-341.
(收稿：1998-03-30 修回：1998-07-17), http://www.100md.com
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院儿科教研室
关键词：巨细胞病毒感染；脱噬作用；基因；bcl-2；基因表达
中华儿科杂志981102 【摘要】 目的 探讨巨细胞病毒(CMV)感染与细胞凋亡的关系。方法 利用凋亡细胞原位检测技术，结合PI染色法流式细胞DNA含量分析术，检测了体外CMV AD169毒株感染的宿主细胞(人胚肺成纤维细胞，HEL)及体内CMV性肝炎患儿肝组织内细胞的凋亡发生情况，并应用原位核酸分子杂交和图像分析技术观察了CMV 感染对细胞凋亡调控基因bcl-2和fas表达的影响。结果 体内外CMV感染均能明显诱导细胞凋亡的发生，同时CMV感染使肝细胞及HEL细胞内的bcl-2基因表达降低，而使fas基因表达上调。结论 CMV感染诱导细胞凋亡可能是通过影响bcl-2和fas基因的表达而实现的，这种凋亡规律的异常可能参与了CMV性疾病的发生与发展。
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【Abstract】 Objective To explore the relationship between cytomegalovirus (CMV) infection and the frequency of apoptosis. Methods The authors detected the human embryonic lung (HEL) fibroblast cells infected with CMV in vitro and hepatic tissues of CMV hepatitis with in situ end-labeling (TUNEL) apoptotic cell detection method and flow cytometric cell cycle analysis, and also investigated the expressions of bcl-2 and fas mRNA by means of in situ hybridization techniques and image analysis system. Results CMV infection enhanced apoptosis significantly in vitro and in vivo (both P<0.01). Meanwhile, higher expression of fas-mRNA and lower expression of bcl-2 mRNA were found in hepatic tissues of CMV hepatitis patients and CMV-infected HEL cells than that in the normal control. Conclusion These studies demonstrate that abnormal expressions of bcl-2 and fas mRNA may be involved in the pathological mechanisms of diseases assosiated with CMV-infection.
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【Key words】 Cytomegalovirus infections Apoptosis Genes, bcl-2 Gene expression
细胞凋亡是单个细胞受其内在基因编程调节，通过主动的生化过程，而自杀死亡的现象[1]。凋亡规律失常已被认为是许多疾病的重要发病机制。近年研究发现，许多病毒性疾病(如病毒性肝炎，艾滋病等)的发生与细胞凋亡有关[2]。巨细胞病毒(CMV)感染极为普遍，它常可致先天性畸形、中枢神经系统损害、小儿肝炎、肺炎、视网膜病等各种疾病[3]。然而，目前有关CMV感染是否也存在着凋亡规律的异常，国内外研究甚少。作者通过检测体内CMV感染所致CMV性肝炎患儿的肝组织及体外CMV AD169感染的人胚肺成纤维细胞(HEL)内凋亡发生情况，以及CMV感染对凋亡调控基因B cell lymphoma-leukemia-2(bcl-2)和fas 表达的影响，探讨CMV感染与细胞凋亡的相互关系。
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材料和方法
一、材料
1.细胞：自制HEL，取自妊娠4个月水囊引产的胚胎，经常规原代细胞培养方法，制成单层细胞，第10～20代用于本实验。
2.病毒：CMV AD169病毒株，由中国预防医学科学院病毒研究所提供。
3.标本来源：1994年8月～1995年8月，同济医院儿科感染病房收治的临床诊断为婴儿黄疸型CMV肝炎患儿的肝组织标本(包括活检及尸检标本)，共7例，其血清抗CMV-IgM、IgG经酶联免疫吸附(ELISA)方法检测(Human公司试剂盒)均为阳性，并排除甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等感染。另选3例成人胆结石术中所取正常肝组织标本为对照，亦排除HAV、HBV、HCV等感染。上述肝组织经10%福尔马林固定，石蜡包埋处理。作5μm厚连续切片备用。
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4.试剂：抗巨细胞病毒即刻早期抗原(CMV-IEA)单抗由美国UAB儿童医院Britt教授提供(1:100)。过氧化物酶抗过氧化物酶法(PAP)免疫染色试剂由同济医科大学附属同济医院临床免疫研究室提供。地高辛标记与检测试剂盒以及细胞凋亡原位检测试剂盒均为Boehringer Mannheim公司产品。含bcl-2 cDNA及fas-cDNA片段的质粒由同济医科大学免疫教研室惠赠。bcl-2 cDNA片段长度为2.0 kb，于EcoR I 单酶切位点插入载体Bluescript质粒中，经氯化钙渗透法转化入JM101菌株； fas-cDNA 片段长度为2.3 kb，于BamHI及XBaI酶切位点插入载体pUC18，经氯化钙渗透法转化TG1菌株，再按常规方法提取质粒DNA，经酶切，回收，纯化后，获得bcl-2及fas cDNA探针。
二、方法
1.细胞培养及病毒感染：将HEL细胞按1×105/ml分种于内含飞片的24孔板，待细胞成片后，按100半数组织培养感染量(TCID50)/0.1ml浓度接种CMV AD169病毒，37℃,5% CO2箱内吸附2小时，弃上清，用含2%小牛血清的培养液洗涤1次，换新鲜培养液，继续在上述条件下培养，隔3天换液一次，同时设正常细胞对照组。待细胞出现典型病变时，取出小飞片，磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗1次，风干，置4%多聚甲醛内，室温下固定30分钟后，4℃保存；同时用0.25%胰酶将培养孔内细胞消化下来，制成单细胞悬液，800 r/min，离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用PBS洗2次，用70% 冷乙醇固定，4℃保存。
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2. 肝组织抗CMV-IEA检测：采用PAP法[4]，检测肝组织内CMV-IEA表达情况。显微镜下，细胞核为棕黄色者，即为CMV-IEA阳性细胞。同时检测CMV感染的人胚肺细胞飞片，设为阳性对照；阴性对照用PBS代替特异性第一抗体。
3.凋亡细胞原位检测： 石蜡切片脱蜡，逐级水化，蛋白酶K(20μg/ml)37℃消化20分钟。PBS(pH值7.4)将组织切片和细胞飞片洗5分钟，3次；滴加 50μl反应液(5μl 10×末端脱氧核苷酸转移酶溶液及45 μl dNTP反应混合液，用前现配)，37℃孵育1小时，PBS洗5分钟，3次，滴加50μl抗体-过氧化物酶联结物，37℃30分钟，PBS洗5分钟，3次；加入50μl DAB底物显色液，室温10分钟，PBS洗5分钟，3次，常规脱水透明，封片镜检。显微镜下，胞核黄色着染者为阳性凋亡细胞。阳性对照：用DNase I(20 μg/ml)在室温下处理组织片和细胞片，以诱导DNA链的断裂。阴性对照：加入的TUNEL反应液中不含末端脱氧核苷酸转移酶。每张切片至少观察500个细胞，计算凋亡发生率。
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4.DNA含量的流式细胞仪测定：取出经70%冷乙醇固定的HEL单细胞悬液，PBS(pH值7.4)洗，离心后去除固定液，加碘化丙锭(PI)染色液(含50 μg/ml PI，0.1%Triton X-100，100 μg/ml RNase A)，混匀，4℃，避光30分钟后，应用流式细胞仪FACStar(美国BD公司)检测，低于G1期DNA含量主峰(亚G1期峰)的细胞为凋亡细胞。
5.原位杂交：bcl-2和fas基因mRNA原位杂交检测参考文献[5，6]加以改进，石蜡切片脱蜡至水，蛋白酶K(100 μg/ml)消化20分钟；4%多聚甲醛固定5分钟后，乙醇逐级脱水，37℃湿盒内预杂交2小时，滴加杂交液(其中的探针预先经98℃变性后，立即置冰中5分钟，再加入到预杂交液中，探针终浓度为2 ng/μl)，42℃湿盒中杂交36小时。再加入Dig-辣根过氧化物酶(1:500)，37℃湿盒内1小时，之后按试剂盒说明进行显色，结果满意后，PBS-DEPC水洗终止，乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片镜检，设不加探针的阴性对照和RNase处理后的阴性对照。杂交结果进行计算机图像分析处理。
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三、统计学处理
数据以均数±标准差(
±s)表示，采用t或χ2检验进行比较分析，P<0.05时，差别有显著意义。结果
一、肝组织抗CMV-IEA检测结果
7例CMV性肝炎患儿的肝组织内均可见到细胞核呈黄色着染的肝细胞(图1a)，提示为CMV感染的肝组织，这与标本选择时，血清抗CMV检测结果一致；而3例正常对照的肝组织经PAP法检测未见阳性细胞，证实为非CMV感染(图1b)。
二、体内外CMV感染对细胞凋亡发生的影响
1.CMV感染的肝细胞凋亡情况：在肝组织切片中，7例CMV感染者的肝组织内肝细胞凋亡发生率为53.7%(图2a)；而3例非CMV感染者的肝细胞凋亡发生率为7.2%(图2b)，经χ2检验，P<0.01，差异有显著性意义。
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2.CMV感染的HEL细胞凋亡情况：(1)经凋亡细胞原位检测结果显示：正常HEL细胞呈梭形排列，其中可见阳性凋亡细胞单个散在分布，阳性率为3.7%(图3a)；而病毒感染对照组中，受CMV感染的HEL细胞变大变圆,阳性细胞多为发生病变的病毒感染细胞，阳性率为34.4%(图3b)，经χ2检验，P<0.01，差异有显著性意义；(2)经流式细胞仪测定结果显示：正常细胞组在DNA直方图上表现为G0/G1、S、G2、M期(图4)；而病毒感染组则在G1峰左侧有一亚二倍体细胞群的峰型(亚G1峰)，提示发生细胞凋亡(图4)。
左图：正常HEL细胞周期；右图：CMV感染的HEL细胞，在G1峰左侧可见一典型的凋亡峰型(亚G1峰)
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图4 DNA含量的流式细胞仪检测
三、bcl-2和fas基因mRNA原位杂交检测结果
1.bcl-2 mRNA的表达：杂交结果显示，CMV感染组及正常对照组均有阳性杂交反应物，经计算机图像分析仪定量测定，二者bcl-2表达水平的比较见表1。实验发现，组织切片中CMV性肝炎患儿肝组织bcl-2表达水平明显低于正常肝组织，差异有显著意义(P<0.01)，杂交结果见图5a、图5b。细胞飞片中CMV感染组HEL表达bcl-2水平亦明显低于正常细胞对照组(P<0.01)，杂交结果见图5c、图5d。
表1 CMV感染者bcl-2表达水平的改变(
±s) 分组bcl-2表达的平均积分光度
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组织切片中
细胞飞片中
CMV感染组
1.48±0.13*
1.72±0.19*
正常对照组
6.62±0.21
9.52±0.20
* 感染组与正常对照组相比，P<0.01 2.fas mRNA的表达：杂交阳性信号为紫蓝色或棕蓝色颗粒，在肝组织中呈片状或灶状分布，主要在肝细胞胞核区及胞核周边区域。10例肝组织内fas-mRNA均有不同程度的表达。经计算机图像分析，7例CMV感染者肝组织内fas表达的水平明显高于3例非CMV感染者(P<0.01)，差异有极显著意义(表2)，杂交结果见图6a、图6b；细胞飞片中CMV感染组HEL的fas表达水平亦明显高于正常对照组(P<0.01)，差异有显著意义(表2)，杂交结果见图6c、图6d。
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表2 CMV感染者fas表达水平的改变(
±s) 分组fas表达的平均积分光度
组织切片中
细胞飞片中
CMV感染组
6.71±0.35*
8.42±0.15*
正常对照组
1.52±0.26
2.47±0.12
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* 感染组与正常对照组相比，P<0.01讨论
一、 CMV感染与细胞凋亡
自1956年从组织培养中分离成功CMV以来，世界各地已对人类CMV感染进行了广泛而全面的研究。现知CMV不仅能使不同年龄人群普遍感染，亦是引起小儿各种畸形和病残的重要病因之一。胎儿和新生儿感染后，虽然多数无症状，但仍有不少患儿产生严重损害，包括小头畸形、生长发育迟缓、智力障碍和感觉神经性耳聋等。近年来，又发现CMV感染是器官移植失败和艾滋病患者死亡的重要原因之一[7]。因此，对CMV感染的研究，一直是全世界医学专家十分关注的课题。目前，对CMV感染的发病机制尚未阐明。
早在1972年Kerr等[1]就描述了形态上不同于坏死性细胞死亡(necrotic cell death)的另一种细胞死亡形式，他称之为凋亡性细胞死亡(apoptosic cell death)。但直至最近才认识到细胞以凋亡方式主动“自杀”对维持自身稳定具有重要的积极意义[8～10]。人类许多疾病和病理生理现象都与细胞凋亡的紊乱有关，其中凋亡异常增加已被认为是病毒性疾病(如艾滋病、病毒性肝炎)的重要发病机制。然而，有关巨细胞病毒感染与细胞凋亡的关系，国内外报道甚少。
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目前，细胞凋亡的检测方法包括形态学观察，DNA降解片段电泳分析[11]，流式细胞术DNA含量分析[12]，DNA片段原位末端标记[13]等。作者选用凋亡细胞原位检测技术，检测了7例CMV 性肝炎患儿的肝组织，发现其肝细胞凋亡发生率为53.72%，明显高于3例非CMV感染正常肝组织的7.19%，首次证实了体内CMV 感染能诱导肝细胞凋亡的发生。同时我们在体外建立CMV AD169病毒株感染其宿主细胞(HEL)的模型，用同样的方法，结合PI染色法流式细胞DNA含量分析术，发现病毒感染的细胞出现较为典型的亚二倍体峰型，病毒感染对照组凋亡发生率为33.2% ，也明显高于正常细胞对照组的3.1% ，从而进一步证实了CMV感染可诱导细胞凋亡异常增加。
二、CMV感染对凋亡调控基因bcl-2和fas mRNA表达的影响
许多实验证实细胞凋亡过程涉及到一些细胞死亡调节基因的活化，凋亡是在这些基因调控下的主动“细胞自杀”[14]。目前已发现有三类细胞凋亡相关基因，即在细胞凋亡过程中表达的基因、促进细胞凋亡的基因和抑制细胞凋亡的基因。
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fas基因是目前研究较为深入的一个凋亡促进基因，它属于TNF受体家族，富含于胸腺、肝、心、肾、肺及卵巢。它编码的蛋白Fas与其配体(FasL)组成的Fas系统在病毒性肝炎肝细胞凋亡的发生和发展中起着重要作用，病毒感染刺激肝细胞表面大量表达Fas，同时刺激CTL细胞大量表达FasL，Fas和FasL结合，通过细胞毒作用，导致肝细胞凋亡，这一过程正常发生，感染病毒的细胞将被清除，过程若被放大则可能导致暴发性肝炎[15]。
bcl-2是从小鼠B淋巴细胞瘤中分离得到的原癌基因，它被认为是细胞凋亡抑制基因，在多种正常细胞的激活和发育过程中表达，而在成熟或走向凋亡的细胞中不表达或低表达，它能抑制许多因素引起的细胞凋亡[16，17]。
在本实验中，应用原位杂交技术检测了体内CMV感染的肝组织及体外CMV感染的HEL细胞中bcl-2 和fas 基因mRNA的表达，研究结果发现，CMV感染使肝细胞及HEL细胞的bcl-2基因表达降低，而使fas 基因表达上调。从而提示，CMV感染诱导细胞凋亡可能是通过影响bcl-2 和fas 基因的表达而实现的。
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由此作者推测，是否因CMV感染引起Fas系统功能亢进，使得肝细胞凋亡异常增加，引起肝脏受损，导致了CMV性肝炎的发生和发展。但是，CMV感染是如何诱导fas表达增强，有无FasL的增强，以及Fas系统在细胞凋亡中究竟充当什么角色，值得深入研究。
图1 肝组织抗CMV-IEA免疫组化结果 1a：CMV性肝炎患儿肝组织，黄色着染者为CMV感染的阳性细胞； 1b：正常肝组织，HE×400
图2 肝组织凋亡原位检测 2a：CMV性肝炎患儿肝组织，凋亡肝细胞核呈棕黄色，染色不均匀，多集中于核膜下，呈不规则环形，亦有集中于一侧，呈半月形；未凋亡细胞非特异性染色极浅；而坏死组织染色呈片状，细胞轮廓不清，染色呈均一深黄色斑片； 2b：正常肝组织，凋亡细胞较少，HE×120
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图3 HEL细胞凋亡原位检测 3a：正常HEL细胞，呈梭形排列，阳性凋亡细胞单个散在分布； 3b：CMV感染的HEL细胞，细胞变大，变圆，阳性细胞多为发生病变的病毒感染细胞，×120
图5 原位杂交bcl-2基因mRNA表达情况 5a：CMV性肝炎患儿肝组织，×60； 5b：正常肝组织，×60； 5c：CMV感染的HEL细胞，×120； 5d：正常HEL细胞，×120
图6 原位杂交fas基因mRNA表达情况 6a：CMV性肝炎患儿肝组织，×60； 6b：正常肝组织，×60； 6c：CMV感染的HEL细胞，×120； 6d:正常HEL细胞，×120
参考文献
1 Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissues kinetics. Br J Cancer, 1972, 26: 239-257.
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(收稿：1998-03-30 修回：1998-07-17), http://www.100md.com