溶酶体贮积症病例诊断及产前诊断
作者：施惠平
单位：100005 北京，中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学部
关键词：
中华儿科杂志990132 (一)概述：溶酶体是一种细胞器，即细胞内的超微结构，为单层包被的囊泡，外面是一层脂蛋白膜。它是细胞的处理与回收系统。内部液体呈酸性，含有60多种酸性水解酶，可降解各种生物大分子，如核酸、蛋白质、脂质、粘多糖及糖原等。组成细胞的各种生物大分子都处于动态平衡中，不断被分解又不断被再合成。通过内吞作用摄入的生物大分子也需要分解成不同的组分后，才能被利用。这些大分子的分解都是在溶酶体中进行的。
溶酶体中的每一种酶皆有各自的编码基因。每一种酶的缺陷直接导致某一特定的生物大分子不能正常降解而在溶酶体中贮积。其共同结果都是溶酶体随之发生肿胀，细胞也变得臃肿失常，细胞功能受到严重影响，最终导致疾病，称为溶酶体贮积症(Lysosomal storage disease,LSD)。酶缺陷的直接原因是编码基因的突变，绝大多数为常染色体隐性遗传，是一组较常见的遗传性代谢疾病。据统计，每1万个新生儿中将近 5例为此病患儿。目前尚无有效的治疗方法。在遗传性代谢疾病产前诊断中此病所占的比例最大。因此，对高危孕妇进行产前诊断是防止患儿出生的唯一有效措施。
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(二)溶酶体酶的共同特性：1. 皆为酸性水解酶，是含甘露糖的糖蛋白。酶作用最适pH为3.5～5.5。溶酶体依靠质子泵的作用维持酸性环境(pH 5.0～5.5)。
2. 是一种端切酶。溶酶体内的大分子降解时，酶从大分子的末端起，一个个切除糖基、硫酸基、脂及酸残基等。
3. 以多种形式存在于溶酶体中。多数溶酶体酶存在于可溶性基质中，实验步骤中不需使用去污剂；少数是溶酶体膜的组成部分(如葡萄糖脑苷脂酶、酸性磷酸酶)，因此测酶活性时需用去污剂。
(三)溶酶体贮积症的特点：1. 绝大部分为常染色体隐性遗传病。即父母双方皆为表型正常的杂合子，所生子女出现疾病的风险为四分之一。目前已发现有30多种疾病。
2. 多种组织或器官受累。主要临床表现为智力低下、骨骼及神经系统发育障碍。严重影响患者的生命力。
, 百拇医药
3. 临床病情呈进行性加重。如粘多糖贮积症、GM1及GM2神经节苷脂贮积症、异染性脑白质营养不良等疾病，表现为神经系统损害进行性加重。
4. 贮积物为单层溶酶体膜所包裹。
5. 贮积物成分多样化。
6. 酶活性测定是最后确诊本病的可靠依据。
7. 有的病可用酶补充治疗。如戈谢病(Gaucher disease)；多数疾病无有效的治疗方法，但可通过酶活性测定做出诊断及产前诊断。
由于溶酶体贮积症病情严重，多数疾病无有效治疗方法，预后不良。患儿的出生给社会和家庭带来沉重的经济和精神负担。这种疾病虽无有效治疗方法，但多数可在产前清楚判明胎儿是否患病，有的还可在孕早期作出产前诊断，在优生上具有“预防”的意义。因可在临床上根据明确的产前诊断结果阻止胎儿出生，它不仅是唯一可行的优生措施，而且能减轻家庭及社会的负担，提高人口素质。
, 百拇医药
溶酶体贮积症所包括的疾病种类、分类及相应缺陷的水解酶列于表1。
表1 溶酶体贮积症及相应的水解酶缺陷 分类
疾病名称
缺陷的水解酶
神经鞘脂贮积症
异染性脑白质营养不良
芳基硫酸酯酶A(ASA)
球形细胞脑白质营养不良
半乳糖脑苷脂酶
GM1神经节苷脂贮积症
β-半乳糖苷酶
, 百拇医药
黑性痴呆(Tay-Sachs病)
β-氨基己糖苷酶A
Sanhoff病
β-氨基己糖苷酶A+B
Gaucher病
β-葡萄糖苷酶
Niemann-Pick病
鞘磷脂酶
Fabry病
α-半乳糖苷酶
Farber病
神经酰胺酶
, 百拇医药
糖原贮积症
糖原贮积症Ⅱ型
α-葡糖苷酶
糖蛋白贮积症
岩藻糖苷贮积症
α-岩藻糖苷酶
苷露糖苷贮积症
α-苷露糖苷酶
唾液酸贮积症
唾液酸酶
天冬氨酰氨基葡糖尿症
天冬氨酰氨基葡糖苷酶
, 百拇医药
粘多糖贮积症
MPSⅠ
α-L-艾杜糖苷酸酶
MPSⅡ
艾杜糖醛酸硫酸酯酶
MPSⅢA
类肝素-N-硫酸酯酶
MPSⅢB
α-N-乙酰氨基葡糖苷酶
MPSⅢC
乙酰-CoA：α-氨基葡糖乙酰转移酶
MPSⅢD
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N-乙酰氨基葡糖-6-硫酸酯酶
MPSⅣA
半乳糖-6-硫酸酯酶
PMSⅣB
β-半乳糖苷酶
MPSⅥ
芳基硫酸酯酶B(ASB)
MPSⅦ
β-葡糖苷酸酶
粘脂质贮积症
MLⅡ及Ⅲ
磷酸转移酶缺陷导致血清中多种溶
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酶体酶升高
胆固醇酯贮积症
Wolman病
酸性酯酶
(四)溶酶体酶活性的测定方法：溶酶体贮积症的诊断是通过酶活性测定或测代谢产物进行的。过去测酶活性的方法与步骤比较复杂，底物用量较大。1980年后荷兰 Erasmus大学遗传代谢病试验室应用微量酶活性测定法获得成功。它使用了新的人工合成底物，提高了实验的灵敏度及准确性, 简化了实验步骤。1990年中国医学科学院基础医学研究所医学遗传研究室引进了该试验室的微量酶活性测定法, 先后建立了10种酶的测定方法。现在，该室在进行以上10种酶活性测定时，将原来在试管中进行的实验，改在Eppendroff管中进行，并将各种酶活性测定方法规范化。其结果是简化了实验步骤、提高了准确性，能准确计算出加入的底物与酶源的量。如黑性痴呆病是由于氨基已糖苷酶A(Hex A)缺乏所致,过去使用荧光底物4-甲基-β-D-N-乙酰葡胺(4MUG)先测出Hex 总活性后再测出Hex B活性, 并据此计算出Hex A活性。现在则使用4-甲基-β-D-N-乙酰葡胺-6-硫酸(4MUGS)作底物, 可直接测出Hex A活性。又如MPS Ⅳ A是由于半乳糖-6-硫酸脂酶缺陷所致，过去使用同位素标记底物，现用新荧光底物，省略了同位素标记步骤。 除芳基硫酸酯酶A及B两种酶用成色底物外，其他均用荧光底物。每种酶活性测定方法用统一的步骤,即
, 百拇医药
20 μl细胞匀浆加入40 μl底物, 充分混匀, 置37℃水浴温浴1小时后,加入400 μl 0.5 mol/L 碳酸钠与碳酸氢钠缓冲液(pH 10.7)终止反应, 用荧光分光光度计测定酶活性, 激发波长为
365 μm,发射波长为445 μm。以上方法的改进，都为在孕早期取绒毛做产前诊断打下基础。
协和医科大学医学遗传室1991～1997年在90例先证者的诊断基础上对28例高危孕妇进行了产前诊断(表2)，其中14例是于孕早期取绒毛进行的。检出患病胎儿5例，其中粘多糖贮积症2例，异染性脑白质营养不良、GM1、GM2神经节苷脂贮积症各1例。新方法测定的结果均经羊水细胞及出生后胎儿检查验证证实。以上实践结果说明孕早期产前诊断的可靠性。表2 溶酶体贮积症的病例诊断及
产前诊断例数(1991～1997) 病名
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病例
诊断
产前
诊断
粘多糖贮积症
45
9
戈谢病(高雪病)
18
2
异染性脑白质营养不良
10
5
, 百拇医药
尼曼-匹克病
3
4
粘脂质贮积症
6
3
GM1神经节苷脂贮积症
2
3
GM2神经节苷脂贮积症
4
2
球形细胞脑白质营养不良
, 百拇医药
2
合计
90
28
(五)诊断注意事项：产前诊断的先决条件是对先证者弄清是哪一种酶缺陷。做到这一点需要临床与实验室紧密配合，先从临床表现分析最有可能是哪种酶缺陷病，才能有目的地测那种酶。虽然目前这组疾病的研究已达分子水平，但方法和步骤都比较复杂，需要时间比较长。因此基因诊断尚不能取代酶活性测定做产前诊断的位置。
值得注意的是部分病例相关的酶活性在正常范围，其致病原因是与酶活性有关的激活蛋白的缺陷，如异染性脑白质营养不良等。这种情况不能用测酶活性的方法做产前诊断。
产前诊断可在孕中期17～20周做羊膜腔穿剌取羊水，用经培养的羊水细胞做酶活性测定或35S掺入实验；近年来可于孕早期7～12周取绒毛做酶活性测定，但不能完全取代羊水细胞法。因为某些酶在绒毛中不表达或受绒毛标本中其他因素干扰。
(收稿：1998-04-30), 百拇医药
单位：100005 北京，中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学部
关键词：
中华儿科杂志990132 (一)概述：溶酶体是一种细胞器，即细胞内的超微结构，为单层包被的囊泡，外面是一层脂蛋白膜。它是细胞的处理与回收系统。内部液体呈酸性，含有60多种酸性水解酶，可降解各种生物大分子，如核酸、蛋白质、脂质、粘多糖及糖原等。组成细胞的各种生物大分子都处于动态平衡中，不断被分解又不断被再合成。通过内吞作用摄入的生物大分子也需要分解成不同的组分后，才能被利用。这些大分子的分解都是在溶酶体中进行的。
溶酶体中的每一种酶皆有各自的编码基因。每一种酶的缺陷直接导致某一特定的生物大分子不能正常降解而在溶酶体中贮积。其共同结果都是溶酶体随之发生肿胀，细胞也变得臃肿失常，细胞功能受到严重影响，最终导致疾病，称为溶酶体贮积症(Lysosomal storage disease,LSD)。酶缺陷的直接原因是编码基因的突变，绝大多数为常染色体隐性遗传，是一组较常见的遗传性代谢疾病。据统计，每1万个新生儿中将近 5例为此病患儿。目前尚无有效的治疗方法。在遗传性代谢疾病产前诊断中此病所占的比例最大。因此，对高危孕妇进行产前诊断是防止患儿出生的唯一有效措施。
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(二)溶酶体酶的共同特性：1. 皆为酸性水解酶，是含甘露糖的糖蛋白。酶作用最适pH为3.5～5.5。溶酶体依靠质子泵的作用维持酸性环境(pH 5.0～5.5)。
2. 是一种端切酶。溶酶体内的大分子降解时，酶从大分子的末端起，一个个切除糖基、硫酸基、脂及酸残基等。
3. 以多种形式存在于溶酶体中。多数溶酶体酶存在于可溶性基质中，实验步骤中不需使用去污剂；少数是溶酶体膜的组成部分(如葡萄糖脑苷脂酶、酸性磷酸酶)，因此测酶活性时需用去污剂。
(三)溶酶体贮积症的特点：1. 绝大部分为常染色体隐性遗传病。即父母双方皆为表型正常的杂合子，所生子女出现疾病的风险为四分之一。目前已发现有30多种疾病。
2. 多种组织或器官受累。主要临床表现为智力低下、骨骼及神经系统发育障碍。严重影响患者的生命力。
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3. 临床病情呈进行性加重。如粘多糖贮积症、GM1及GM2神经节苷脂贮积症、异染性脑白质营养不良等疾病，表现为神经系统损害进行性加重。
4. 贮积物为单层溶酶体膜所包裹。
5. 贮积物成分多样化。
6. 酶活性测定是最后确诊本病的可靠依据。
7. 有的病可用酶补充治疗。如戈谢病(Gaucher disease)；多数疾病无有效的治疗方法，但可通过酶活性测定做出诊断及产前诊断。
由于溶酶体贮积症病情严重，多数疾病无有效治疗方法，预后不良。患儿的出生给社会和家庭带来沉重的经济和精神负担。这种疾病虽无有效治疗方法，但多数可在产前清楚判明胎儿是否患病，有的还可在孕早期作出产前诊断，在优生上具有“预防”的意义。因可在临床上根据明确的产前诊断结果阻止胎儿出生，它不仅是唯一可行的优生措施，而且能减轻家庭及社会的负担，提高人口素质。
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溶酶体贮积症所包括的疾病种类、分类及相应缺陷的水解酶列于表1。
表1 溶酶体贮积症及相应的水解酶缺陷 分类
疾病名称
缺陷的水解酶
神经鞘脂贮积症
异染性脑白质营养不良
芳基硫酸酯酶A(ASA)
球形细胞脑白质营养不良
半乳糖脑苷脂酶
GM1神经节苷脂贮积症
β-半乳糖苷酶
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黑性痴呆(Tay-Sachs病)
β-氨基己糖苷酶A
Sanhoff病
β-氨基己糖苷酶A+B
Gaucher病
β-葡萄糖苷酶
Niemann-Pick病
鞘磷脂酶
Fabry病
α-半乳糖苷酶
Farber病
神经酰胺酶
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糖原贮积症
糖原贮积症Ⅱ型
α-葡糖苷酶
糖蛋白贮积症
岩藻糖苷贮积症
α-岩藻糖苷酶
苷露糖苷贮积症
α-苷露糖苷酶
唾液酸贮积症
唾液酸酶
天冬氨酰氨基葡糖尿症
天冬氨酰氨基葡糖苷酶
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粘多糖贮积症
MPSⅠ
α-L-艾杜糖苷酸酶
MPSⅡ
艾杜糖醛酸硫酸酯酶
MPSⅢA
类肝素-N-硫酸酯酶
MPSⅢB
α-N-乙酰氨基葡糖苷酶
MPSⅢC
乙酰-CoA：α-氨基葡糖乙酰转移酶
MPSⅢD
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N-乙酰氨基葡糖-6-硫酸酯酶
MPSⅣA
半乳糖-6-硫酸酯酶
PMSⅣB
β-半乳糖苷酶
MPSⅥ
芳基硫酸酯酶B(ASB)
MPSⅦ
β-葡糖苷酸酶
粘脂质贮积症
MLⅡ及Ⅲ
磷酸转移酶缺陷导致血清中多种溶
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酶体酶升高
胆固醇酯贮积症
Wolman病
酸性酯酶
(四)溶酶体酶活性的测定方法：溶酶体贮积症的诊断是通过酶活性测定或测代谢产物进行的。过去测酶活性的方法与步骤比较复杂，底物用量较大。1980年后荷兰 Erasmus大学遗传代谢病试验室应用微量酶活性测定法获得成功。它使用了新的人工合成底物，提高了实验的灵敏度及准确性, 简化了实验步骤。1990年中国医学科学院基础医学研究所医学遗传研究室引进了该试验室的微量酶活性测定法, 先后建立了10种酶的测定方法。现在，该室在进行以上10种酶活性测定时，将原来在试管中进行的实验，改在Eppendroff管中进行，并将各种酶活性测定方法规范化。其结果是简化了实验步骤、提高了准确性，能准确计算出加入的底物与酶源的量。如黑性痴呆病是由于氨基已糖苷酶A(Hex A)缺乏所致,过去使用荧光底物4-甲基-β-D-N-乙酰葡胺(4MUG)先测出Hex 总活性后再测出Hex B活性, 并据此计算出Hex A活性。现在则使用4-甲基-β-D-N-乙酰葡胺-6-硫酸(4MUGS)作底物, 可直接测出Hex A活性。又如MPS Ⅳ A是由于半乳糖-6-硫酸脂酶缺陷所致，过去使用同位素标记底物，现用新荧光底物，省略了同位素标记步骤。 除芳基硫酸酯酶A及B两种酶用成色底物外，其他均用荧光底物。每种酶活性测定方法用统一的步骤,即
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20 μl细胞匀浆加入40 μl底物, 充分混匀, 置37℃水浴温浴1小时后,加入400 μl 0.5 mol/L 碳酸钠与碳酸氢钠缓冲液(pH 10.7)终止反应, 用荧光分光光度计测定酶活性, 激发波长为
365 μm,发射波长为445 μm。以上方法的改进，都为在孕早期取绒毛做产前诊断打下基础。
协和医科大学医学遗传室1991～1997年在90例先证者的诊断基础上对28例高危孕妇进行了产前诊断(表2)，其中14例是于孕早期取绒毛进行的。检出患病胎儿5例，其中粘多糖贮积症2例，异染性脑白质营养不良、GM1、GM2神经节苷脂贮积症各1例。新方法测定的结果均经羊水细胞及出生后胎儿检查验证证实。以上实践结果说明孕早期产前诊断的可靠性。表2 溶酶体贮积症的病例诊断及
产前诊断例数(1991～1997) 病名
, http://www.100md.com
病例
诊断
产前
诊断
粘多糖贮积症
45
9
戈谢病(高雪病)
18
2
异染性脑白质营养不良
10
5
, 百拇医药
尼曼-匹克病
3
4
粘脂质贮积症
6
3
GM1神经节苷脂贮积症
2
3
GM2神经节苷脂贮积症
4
2
球形细胞脑白质营养不良
, 百拇医药
2
合计
90
28
(五)诊断注意事项：产前诊断的先决条件是对先证者弄清是哪一种酶缺陷。做到这一点需要临床与实验室紧密配合，先从临床表现分析最有可能是哪种酶缺陷病，才能有目的地测那种酶。虽然目前这组疾病的研究已达分子水平，但方法和步骤都比较复杂，需要时间比较长。因此基因诊断尚不能取代酶活性测定做产前诊断的位置。
值得注意的是部分病例相关的酶活性在正常范围，其致病原因是与酶活性有关的激活蛋白的缺陷，如异染性脑白质营养不良等。这种情况不能用测酶活性的方法做产前诊断。
产前诊断可在孕中期17～20周做羊膜腔穿剌取羊水，用经培养的羊水细胞做酶活性测定或35S掺入实验；近年来可于孕早期7～12周取绒毛做酶活性测定，但不能完全取代羊水细胞法。因为某些酶在绒毛中不表达或受绒毛标本中其他因素干扰。
(收稿：1998-04-30), 百拇医药