急性白血病MTS1基因缺失及点突变的研究
作者：李戈 符仁义 石伟 李兰 杨和平 杨以桡
单位：610072 成都，四川省人民医院儿科(李戈、石伟、李兰、杨以桡)；华西医科大学附属第二医院儿科(符仁义)；衡阳医学院分子生物学研究中心(杨和平)
关键词：白血病；基因；抑制；肿瘤；点突变；聚合酶链反应；基因缺失
中华儿科杂志990502 【摘要】 目的 探讨多肿瘤抑制基因(MTS1)突变与恶性血液病间的关系。方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析和DNA印迹(southern blot)方法检测35例急性白血病患儿MTS1基因的改变。结果 急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿的MTS1基因缺失(包括点突变) 为26%(8/31)，其中纯合子缺失，B-ALL为16%(4/25)，T-ALL为6例中有2例。点突变则两型各占1例。结论 我国儿童ALL有MTS1基因失活，T-ALL高于B-ALL，点突变仅见于少数病例。提示该基因的失活与小儿急性白血病的发生、发展及预后有密切关系。
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MTS1 gene deletion and point mutation in children with acute leukemia LI Ge*, FU Renyi, SHI Wei, et al. * Department of Pediatrics, Sichuan Provincial People′s Hospital, Chengdu 610072
【Abstract】 Objective To investigate the correlation between the mutiple tumor suppressor (MTS1) gene mutation and acute childhood leukemia (AL).Methods The MTS1 gene alteration in AL 35 cases was detected with polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) and southern blot. Results The MTS1 gene deletions including the point mutation were found in 26%(8/31) of ALL cases. Homozygous deletions were found in 16% (4/25) and (2/6) of B- cell and T-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL and T-ALL)cases, respectively. The point mutations were found in one case of B-ALL and in another case of T-ALL. Conclusion The MTS1 gene inactivation could be found in AL children of China.Its incidence in T- ALL might exceed that in B-ALL, but the point mutation was rare. There was a close correlation between MTS1 gene inactivation and the development of AL and the prognosis as well.
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【Key words】 Leukemia Genes, suppressor, tumor Point mutation Polymerase chain reaction Gene deletion
癌基因的过度表达或抑癌基因的失活可导致癌变。位于染色体9P上的多肿瘤抑制基因(MTS1/p16基因)的发现仅2年余，可是它迅速渗入到肿瘤、血液、分子生物学等研究领域的事实，证明了它的重要性。我们将35例小儿急性白血病(AL)的MTS1的缺失和突变检测结果报告如下。
对象和方法
一、对象
35例白血病患儿均来自四川省人民医院和华西医科大学附属第二医院。年龄1～14岁。全部病例均按法-美-英(FAB)国际协作组标准及免疫表型确诊。急性淋巴细胞白血病(ALL)31例(B-ALL 25例，T-ALL 6例)，急性粒细胞白血病(AML)4例。5例正常人作为阴性对照。
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二、方法
1.样本制备：取骨髓0.5 ml，EDTA抗凝，分离出单个核细胞，再按常规蛋白酶K及酚/氯仿抽提法提取DNA。
2.聚合酶链反应(PCR)方法：外显子Ⅰ被扩增成一个片段，而外显子Ⅱ分成二个片段扩增(2a和2b)，PCR反应混合物(20 μl)由下列成分组成：1×Taq缓冲液，50 μmol/L dNTPs，2 U Taq多聚酶，6%二甲基亚砜，1 μmol/L引物和200 ng模板。反应条件：94℃ 50秒、63℃ 50秒、72℃ 50秒，35次循环。
3.PCR引物设计和合成：PCR引物由衡阳医学院分子生物学研究中心采用391A DNA合成仪合成，引物设计按文献[1]进行。
外显子Ⅰ引物：
上游引物：5′-TCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGC A-3′
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下游引物：5′-GCGCTACCTGAT TCCAATTC-3′
外显子Ⅱ引物：
①上游引物：5′-ACAAGCTTCCTTTCCGTCATG CCG-3′
下游引物：5′-CCAGGCATCGCG CACGTCA-3′
②上游引物：5′-TTCCTGGACACGCTGGTGGT-3′
下游引物：5′-TCTGAGCTTTGGAAGCTCTCAG-3′
4.单链构象多态性(SSCP)分析：取10 μl PCR产物，加1 μl 0.5 mol/L氢氧化钠，5 mmol/L EDTA，42℃，5 分钟，加入1 μl去离子甲酰胺(内含 0.5%溴酚蓝，0.5%二甲苯腈)。将上述混合液上样于8%聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=29∶1)，0.5×TBE电泳缓冲液，电场强度为20 V，电泳6～8小时。取出凝胶按下列步骤作银染色,置凝胶于10%乙醇液固定5分钟，1%硝酸3 分钟氧化，而后用双蒸水淋洗凝胶1 分钟，置于0.012 mol/L硝酸银液中20 分钟，然后弃去硝酸银液，用双蒸水淋洗凝胶 1 分钟，再用0.28 mol/L无水碳酸钠、0.019%甲醋液使胶还原。在溶液开始变棕色时更新溶液直至所需要的显色深度后置凝胶于10%冰醋酸2 分钟，停止还原反应后用双蒸水淋洗凝胶2 分钟( 以上所有操作步骤均在室温下进行)。
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5.Southern blot分析：0.5 kb人p16 cDNA EcoRI片段和人癌基因c-sis外显子6分别用α-32P-dCTP经随机引物法标记，作为Southem blot杂交探针[2]。取10 μg DNA用BamHⅠ消化，于TAE缓冲液[40 mmol/L Tris，20 mmol/L醋酸钠，2 mmol/L EDTA，pH 7.2]，1%琼脂糖，30 V电泳过夜，转移至尼龙膜上，经紫外灯固定。再经预杂交[预杂交条件：50%甲酰胺、5×SSC(内含2.2%氯化钠和4.4%柠檬酸钠，pH 7.0)、5×Denhardt液(内含0.1%聚蔗糖400、0.1%聚乙烯吡咯烷酮和0.1%牛血清白蛋白)、0.5%十二烷基磺酸钠(SDS)，42℃，6小时]和杂交(在预杂交液中加入探针，12小时)，再进行洗膜(洗膜液：0.2×SSC内含1%SDS，55℃，20分钟/次)3次，经自显影后观察结果。
结 果
一、MTS1基因纯合子缺失
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用Southern blot分析了35例AL和5例正常人的淋巴细胞DNA，BamHⅠ消化的DNA用α-32P-dCTP标记MTS1的CDNA 探针进行杂交，出现一条21 kb带型(内含MTS1基因外显子Ⅰ和外显子Ⅱ)和一条5.8 kb带型(内含外显子Ⅱ)并以c-sis基因(探针由衡阳医学院分子生物学中心提供)作为内对照,所有标本均出现一条1.8 kb片段(c-sis基因杂交的阳性结果)。如果未出现21 kb带型，则说明有p16纯合子缺失。结果显示6例T-ALL中有2例为纯合子缺失，25例B-ALL中有4例(16%)为纯合子缺失，4例AML及5例正常人未检出纯合子缺失(图1)。
泳道1～5，8为阳性病例
图1 DNA印迹法分析AL MTS1基因缺失
二、SSCP分析
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35例AL显示，2例有MTS1基因点突变(带型出现异常迁移)，其中T-ALL和B-ALL各占1例(图2)。
SS-DNA为单链DNA，dS-DNA为双链DNA；
箭头所示两例AL患儿的突变单链(SSCP阳性)
图2 两例AL患儿的突变单链(银染PCR-SSCP)
讨 论
细胞进入周期以及在周期各个时相上向前推进，牵涉到一系列复杂的分子水平上的调节机制。周期蛋白依赖激酶CDK4与周期蛋白CyCD结合而被激活，可促使细胞由G1向S期演进。MTS1基因通过表达的P16蛋白与CyCD竞争性地结合CDK4而抑制其活性，P16蛋白还能调节另一抑癌基因产物PRb(视网膜易感基因产物)的活性，两者作用的结果，均阻止了细胞由G1向S期的转化。这种正负调节平衡的失调可导致细胞的非正常增生，引起癌变[2，3]。
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有人将MTS1转染到有该基因缺失的癌细胞系中，癌细胞生长出现阻抑，表明了MTS1抑癌基因的失活与肿瘤间的关系[3]。
迄今所知，MTS1的缺失或突变，见于黑色素瘤，胶质细胞瘤，白血病，肺、肾、乳腺癌等多种恶性疾病中[2]。血液系统恶性肿瘤中的发生率为5.56%～43.64%。其中ALL为14%～40%左右，T-ALL发生率高于B-ALL[4，5]。
本研究通过Sonthern blot和PCR-SSCP法检测了35例AL患儿，31例ALL中MTS1缺失、突变共8例，占26%。其中纯合子缺失6例，发生率为19%，点突变2例。免疫分型表明6例T细胞系ALL中发生缺失2例。25例B细胞系ALL中缺失4例，占16%；点突变则两型各1例。4例AML未检出阳性结果。上述结果表明中国儿童AL中MTS1基因失活以ALL，尤其T-ALL为高。其方式以纯合子缺失为主，点突变仅见于少数病例。与国外报道资料相近。本研究提示，尽管白血病的病因是错综复杂的，但MTS1的缺失和突变是ALL发生的一个重要原因。
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有人报道染色体9p异常的儿童ALL常具高危临床特征，包括年龄较大，白细胞计数高，免疫表型T细胞型，中枢神经系统白血病(CNSL)发生率高等特点，而且有MTS I缺失者5年无病生存率也较低[6，7]。本组6例T-ALL中3例在完全缓解1年内复发，其中2例死于CNSL及感染出血。说明T-ALL的这些临床表现与其MTS1的失活相关。
银染PCR-SSCP法是近年发展起来的新技术，用于检测某一片段基因的点突变，敏感性达90%以上。此法简便，快速并且有效，适于国内推广应用。
参考文献
1 Zhang SY,Klein-Szanto AJP,Sauter ER, et al. Highter frequency of alterations in the p16/CDKN2 gene in squamous cell carcinoma cell lines than in primary tumors of the head and neck.Cancer Res, 1994, 54:5050-5053.
, 百拇医药
2 Kamb A,Gruis NA, Weaver F J,et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,264:436-440.
3 Okamoto A, Demetrick DJ, Spillare EA, et al. Mutations and altered expression of p16 INK4 in human cancer. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 11045-11049.
4 Hebert J, Cayuela JM, Berkeley J, et al.Candidate tumor-suppressor genes MTS1 (p16INK4A) and MTS2 (p15INK4B) display frequent homozygous deletions in primary cells form T-cell but not from B-cell lineage acute lymphoblastic leukemias. Blood, 1994,84:4038-4044.
, 百拇医药
5 Quesnel B, Preudhomme C, Philippe N, et al. p16 gene homozygous deletions in acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1995,85:657-663.
6 Murphy SB, Raimondi SC, Rivera GK, et al. Nonrandom abnormalities of chromosome 9p in childhood ALL: association with high-risk clinical features. Blood, 1989,74:409-415.
7 Tsukasa O,Sheila A，Shurtleff MB, et al. Frequent deletion of p16 and p15 in pediatric ALL. Blood,1995,85:2321～2330.
(收稿：1998-02-11 修回：1998-12-01), http://www.100md.com
单位：610072 成都，四川省人民医院儿科(李戈、石伟、李兰、杨以桡)；华西医科大学附属第二医院儿科(符仁义)；衡阳医学院分子生物学研究中心(杨和平)
关键词：白血病；基因；抑制；肿瘤；点突变；聚合酶链反应；基因缺失
中华儿科杂志990502 【摘要】 目的 探讨多肿瘤抑制基因(MTS1)突变与恶性血液病间的关系。方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析和DNA印迹(southern blot)方法检测35例急性白血病患儿MTS1基因的改变。结果 急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿的MTS1基因缺失(包括点突变) 为26%(8/31)，其中纯合子缺失，B-ALL为16%(4/25)，T-ALL为6例中有2例。点突变则两型各占1例。结论 我国儿童ALL有MTS1基因失活，T-ALL高于B-ALL，点突变仅见于少数病例。提示该基因的失活与小儿急性白血病的发生、发展及预后有密切关系。
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MTS1 gene deletion and point mutation in children with acute leukemia LI Ge*, FU Renyi, SHI Wei, et al. * Department of Pediatrics, Sichuan Provincial People′s Hospital, Chengdu 610072
【Abstract】 Objective To investigate the correlation between the mutiple tumor suppressor (MTS1) gene mutation and acute childhood leukemia (AL).Methods The MTS1 gene alteration in AL 35 cases was detected with polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) and southern blot. Results The MTS1 gene deletions including the point mutation were found in 26%(8/31) of ALL cases. Homozygous deletions were found in 16% (4/25) and (2/6) of B- cell and T-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL and T-ALL)cases, respectively. The point mutations were found in one case of B-ALL and in another case of T-ALL. Conclusion The MTS1 gene inactivation could be found in AL children of China.Its incidence in T- ALL might exceed that in B-ALL, but the point mutation was rare. There was a close correlation between MTS1 gene inactivation and the development of AL and the prognosis as well.
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【Key words】 Leukemia Genes, suppressor, tumor Point mutation Polymerase chain reaction Gene deletion
癌基因的过度表达或抑癌基因的失活可导致癌变。位于染色体9P上的多肿瘤抑制基因(MTS1/p16基因)的发现仅2年余，可是它迅速渗入到肿瘤、血液、分子生物学等研究领域的事实，证明了它的重要性。我们将35例小儿急性白血病(AL)的MTS1的缺失和突变检测结果报告如下。
对象和方法
一、对象
35例白血病患儿均来自四川省人民医院和华西医科大学附属第二医院。年龄1～14岁。全部病例均按法-美-英(FAB)国际协作组标准及免疫表型确诊。急性淋巴细胞白血病(ALL)31例(B-ALL 25例，T-ALL 6例)，急性粒细胞白血病(AML)4例。5例正常人作为阴性对照。
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二、方法
1.样本制备：取骨髓0.5 ml，EDTA抗凝，分离出单个核细胞，再按常规蛋白酶K及酚/氯仿抽提法提取DNA。
2.聚合酶链反应(PCR)方法：外显子Ⅰ被扩增成一个片段，而外显子Ⅱ分成二个片段扩增(2a和2b)，PCR反应混合物(20 μl)由下列成分组成：1×Taq缓冲液，50 μmol/L dNTPs，2 U Taq多聚酶，6%二甲基亚砜，1 μmol/L引物和200 ng模板。反应条件：94℃ 50秒、63℃ 50秒、72℃ 50秒，35次循环。
3.PCR引物设计和合成：PCR引物由衡阳医学院分子生物学研究中心采用391A DNA合成仪合成，引物设计按文献[1]进行。
外显子Ⅰ引物：
上游引物：5′-TCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGC A-3′
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下游引物：5′-GCGCTACCTGAT TCCAATTC-3′
外显子Ⅱ引物：
①上游引物：5′-ACAAGCTTCCTTTCCGTCATG CCG-3′
下游引物：5′-CCAGGCATCGCG CACGTCA-3′
②上游引物：5′-TTCCTGGACACGCTGGTGGT-3′
下游引物：5′-TCTGAGCTTTGGAAGCTCTCAG-3′
4.单链构象多态性(SSCP)分析：取10 μl PCR产物，加1 μl 0.5 mol/L氢氧化钠，5 mmol/L EDTA，42℃，5 分钟，加入1 μl去离子甲酰胺(内含 0.5%溴酚蓝，0.5%二甲苯腈)。将上述混合液上样于8%聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=29∶1)，0.5×TBE电泳缓冲液，电场强度为20 V，电泳6～8小时。取出凝胶按下列步骤作银染色,置凝胶于10%乙醇液固定5分钟，1%硝酸3 分钟氧化，而后用双蒸水淋洗凝胶1 分钟，置于0.012 mol/L硝酸银液中20 分钟，然后弃去硝酸银液，用双蒸水淋洗凝胶 1 分钟，再用0.28 mol/L无水碳酸钠、0.019%甲醋液使胶还原。在溶液开始变棕色时更新溶液直至所需要的显色深度后置凝胶于10%冰醋酸2 分钟，停止还原反应后用双蒸水淋洗凝胶2 分钟( 以上所有操作步骤均在室温下进行)。
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5.Southern blot分析：0.5 kb人p16 cDNA EcoRI片段和人癌基因c-sis外显子6分别用α-32P-dCTP经随机引物法标记，作为Southem blot杂交探针[2]。取10 μg DNA用BamHⅠ消化，于TAE缓冲液[40 mmol/L Tris，20 mmol/L醋酸钠，2 mmol/L EDTA，pH 7.2]，1%琼脂糖，30 V电泳过夜，转移至尼龙膜上，经紫外灯固定。再经预杂交[预杂交条件：50%甲酰胺、5×SSC(内含2.2%氯化钠和4.4%柠檬酸钠，pH 7.0)、5×Denhardt液(内含0.1%聚蔗糖400、0.1%聚乙烯吡咯烷酮和0.1%牛血清白蛋白)、0.5%十二烷基磺酸钠(SDS)，42℃，6小时]和杂交(在预杂交液中加入探针，12小时)，再进行洗膜(洗膜液：0.2×SSC内含1%SDS，55℃，20分钟/次)3次，经自显影后观察结果。
结 果
一、MTS1基因纯合子缺失
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用Southern blot分析了35例AL和5例正常人的淋巴细胞DNA，BamHⅠ消化的DNA用α-32P-dCTP标记MTS1的CDNA 探针进行杂交，出现一条21 kb带型(内含MTS1基因外显子Ⅰ和外显子Ⅱ)和一条5.8 kb带型(内含外显子Ⅱ)并以c-sis基因(探针由衡阳医学院分子生物学中心提供)作为内对照,所有标本均出现一条1.8 kb片段(c-sis基因杂交的阳性结果)。如果未出现21 kb带型，则说明有p16纯合子缺失。结果显示6例T-ALL中有2例为纯合子缺失，25例B-ALL中有4例(16%)为纯合子缺失，4例AML及5例正常人未检出纯合子缺失(图1)。
泳道1～5，8为阳性病例
图1 DNA印迹法分析AL MTS1基因缺失
二、SSCP分析
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35例AL显示，2例有MTS1基因点突变(带型出现异常迁移)，其中T-ALL和B-ALL各占1例(图2)。
SS-DNA为单链DNA，dS-DNA为双链DNA；
箭头所示两例AL患儿的突变单链(SSCP阳性)
图2 两例AL患儿的突变单链(银染PCR-SSCP)
讨 论
细胞进入周期以及在周期各个时相上向前推进，牵涉到一系列复杂的分子水平上的调节机制。周期蛋白依赖激酶CDK4与周期蛋白CyCD结合而被激活，可促使细胞由G1向S期演进。MTS1基因通过表达的P16蛋白与CyCD竞争性地结合CDK4而抑制其活性，P16蛋白还能调节另一抑癌基因产物PRb(视网膜易感基因产物)的活性，两者作用的结果，均阻止了细胞由G1向S期的转化。这种正负调节平衡的失调可导致细胞的非正常增生，引起癌变[2，3]。
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有人将MTS1转染到有该基因缺失的癌细胞系中，癌细胞生长出现阻抑，表明了MTS1抑癌基因的失活与肿瘤间的关系[3]。
迄今所知，MTS1的缺失或突变，见于黑色素瘤，胶质细胞瘤，白血病，肺、肾、乳腺癌等多种恶性疾病中[2]。血液系统恶性肿瘤中的发生率为5.56%～43.64%。其中ALL为14%～40%左右，T-ALL发生率高于B-ALL[4，5]。
本研究通过Sonthern blot和PCR-SSCP法检测了35例AL患儿，31例ALL中MTS1缺失、突变共8例，占26%。其中纯合子缺失6例，发生率为19%，点突变2例。免疫分型表明6例T细胞系ALL中发生缺失2例。25例B细胞系ALL中缺失4例，占16%；点突变则两型各1例。4例AML未检出阳性结果。上述结果表明中国儿童AL中MTS1基因失活以ALL，尤其T-ALL为高。其方式以纯合子缺失为主，点突变仅见于少数病例。与国外报道资料相近。本研究提示，尽管白血病的病因是错综复杂的，但MTS1的缺失和突变是ALL发生的一个重要原因。
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有人报道染色体9p异常的儿童ALL常具高危临床特征，包括年龄较大，白细胞计数高，免疫表型T细胞型，中枢神经系统白血病(CNSL)发生率高等特点，而且有MTS I缺失者5年无病生存率也较低[6，7]。本组6例T-ALL中3例在完全缓解1年内复发，其中2例死于CNSL及感染出血。说明T-ALL的这些临床表现与其MTS1的失活相关。
银染PCR-SSCP法是近年发展起来的新技术，用于检测某一片段基因的点突变，敏感性达90%以上。此法简便，快速并且有效，适于国内推广应用。
参考文献
1 Zhang SY,Klein-Szanto AJP,Sauter ER, et al. Highter frequency of alterations in the p16/CDKN2 gene in squamous cell carcinoma cell lines than in primary tumors of the head and neck.Cancer Res, 1994, 54:5050-5053.
, 百拇医药
2 Kamb A,Gruis NA, Weaver F J,et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,264:436-440.
3 Okamoto A, Demetrick DJ, Spillare EA, et al. Mutations and altered expression of p16 INK4 in human cancer. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 11045-11049.
4 Hebert J, Cayuela JM, Berkeley J, et al.Candidate tumor-suppressor genes MTS1 (p16INK4A) and MTS2 (p15INK4B) display frequent homozygous deletions in primary cells form T-cell but not from B-cell lineage acute lymphoblastic leukemias. Blood, 1994,84:4038-4044.
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5 Quesnel B, Preudhomme C, Philippe N, et al. p16 gene homozygous deletions in acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1995,85:657-663.
6 Murphy SB, Raimondi SC, Rivera GK, et al. Nonrandom abnormalities of chromosome 9p in childhood ALL: association with high-risk clinical features. Blood, 1989,74:409-415.
7 Tsukasa O,Sheila A，Shurtleff MB, et al. Frequent deletion of p16 and p15 in pediatric ALL. Blood,1995,85:2321～2330.
(收稿：1998-02-11 修回：1998-12-01), http://www.100md.com