结核病与主要组织相容性复合体Ⅱ类基因的关联性研究
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中华儿科杂志 1999年第6期第37卷
作者：周希玲 江载芳 孙逸平
单位：100045 北京，首都医科大学附属北京儿童医院内科(周希玲，江载芳)；中日友好医院临床医学研究所(孙逸平)
关键词：结核；主要组织相容性复合物；基因，MHC Ⅱ类；聚合酶链反应；寡核苷酸探针
中华儿科杂志990610 【摘要】 目的 研究中国北方汉族儿童结核病与主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类基因的关联，以探讨结核发病的免疫遗传机制。方法 采用聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针斑点杂交(PCR-SSOP)方法，测定原发性肺结核20例、结核性胸膜炎28例、粟粒型肺结核19例、结核性脑膜炎36例和91例正常对照组的MHC-DRB1，DQA1，DQB1等位基因。结果 在4种结核患儿中DRB1*1501显著增高，在粟粒型肺结核、结核性脑膜炎、原发性肺结核和结核性胸膜炎中相对风险(RR)分别为7.22,7.58,13.33和3.84, 校正P(Pc)均<0.05；DRB1*1202在粟粒型肺结核、结核性脑膜炎和原发性肺结核组增高，RR分别为2.77、3.46和1.83，而在结核性胸膜炎组降低，RR为0.17，Pc均>0.05。DRB1*1201在原发性肺结核、结核性胸膜炎增高，RR分别为2.42、2.61，在粟粒型肺结核和结核性脑膜炎降低，RR分别为0.49和0.62，Pc均>0.05。DRB1*1502、1602、0901在各型结核患儿中表现为减少，但Pc均>0.05。结论 中国北方汉族儿童结核病与MHC-DR基因有显著关联，其关联集中在DRB1*1501上。在各型结核患儿中基因频率减低的亚型不尽相同，可能对机体有一定保护作用。
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A study on association of tuberculosis with major histocompatibility complex Ⅱ genes ZHOU Xiling, JIANG Zaifang, SUN Yiping. Department of Internal Medicine, Beijing Children′s Hospital, The Capital University of Medical Sciences, Beijing 100045
【Abstract】 Objective To explore the immungenetic basis of and the association of MHC class Ⅱ genes with tuberculosis in Han children in northern regions of China.Methods MHC-DRB1, DQA1, DQB1 were examined by using polymerase chain reaction/sequence specific oligonuleotide probe (PCR/SSOP) methods in 19 patients with miliary tuberculosis (MT), 36 with tuberculous menigitis (TM),20 with primary tuberculosis (PT), 28 with tuberculous pleurisy (TP) and 91 controls.Results The gene frequencies of DRB1*1501 were markedly increased in the children with 4 types of tuberculosis. The values of relative risk (RR) were 7.22, 7.58, 13.33 and 3.84 in MT, TM, PT and TP, respectively (the corrected P value, i.e., Pc<0.05). DRB1*1202 increased in MT, TM and PT(RR=2.77, 3.46 and 1.83, respectively) and decreased in TP (RR=0.17, Pc>0.05). DRB1*1201 increased in PT and TP (RR=2.42 and 2.61) and decreased in MT and TM (RR=0.49 and 0.62, Pc>0.05). DRB1*1502, 1602, 0901 decreased in the 4 groups (Pc>0.05).Conclusion Tuberculosis of children in north China is significantly associated with MHC-DRB1*1501. The subtypes of genes with decreased frequencies in the 4 groups were not completely the same, which might mean certain protective function.
, 百拇医药
【Key words】 Tuberculosis Major histocompatibility complex Genes, MHC class Ⅱ Polymerase chain reaction Oligonucleotide probes
结核病在历史上是最严重的传染病，如今它仍然是威胁人类健康的疾病之一。Koch发现结核分枝杆菌后确定了本病的病原体。但有证据表明遗传因素对结核病的发病有一定影响。结核的病理特征主要表现为机体对结核杆菌的迟发性变态反应，而不是结核杆菌对机体的直接损伤[1]。推测这种易感性的差异与免疫反应的个体差异有关。把结核病的免疫特性与易感性的遗传倾向结合起来考虑，可设想结核杆菌使人类感染后发病受某些免疫反应基因的控制。免疫反应基因是主要组织相容性复合体(MHC)。因此我们考虑结核病的发病可能与MHC的某些等位基因有关联。研究中国儿童各型结核病和MHC Ⅱ类基因的关联是本研究的目的。
材料和方法
, 百拇医药
一、研究对象
结核病患儿均为中国北方各省市(北京、天津、河北、山西、内蒙古、辽宁、吉林等)的汉族儿童。原发性肺结核(PT)20例，粟粒型肺结核(MT)19例，结核性脑膜炎(TM)36例，结核性胸膜炎(TP)28例。正常对照组为同民族本地无关健康成年人共91例，经胸部X线透视无活动性结核灶及钙化灶。
二、标本收集
取静脉血4～5 ml，用5% EDTA 0.5ml抗凝，-20℃冻存以待提取DNA。
三、实验方法
1.用盐析法提取基因组DNA[2]。
2.基因组DNA的扩增：用PCR/SSP法[3]对103例结核患儿和91例正常对照组进行MHC-DRB1、DQA1、DQB1基因分型。
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3.MHC-DRB1、DQA1、DQB1等位基因亚型的测定——序列特异性寡核苷酸探针斑点杂交(PCR-SSOP)[4]：探针采用地高辛寡核苷酸3′末端标记。
四、统计学分析
主要计算相对风险(RR)值和校正P值(Pc)。计算采用上海免疫学研究所HLA与疾病相关分析软件完成。将患儿组和对照组中MHC等位基因的分布进行比较发现关联的等位基因。
结 果
4种结核患儿组DRB1*1501阳性率均高于对照组，RR升高，Pc<0.01或0.05。DQA1*0102亦高于对照组，除MT(可能因例数较少)外，RR升高与对照组差异亦具有显著意义。DQB1*0602 RR亦升高，但Pc>0.05。DRB1*1202 RR在MT, TM, PT升高，而在TP下降，不过Pc均>0.05(表1)。DRB1*1502、1602、0901在各型结核患儿中表现为减少，但Pc均>0.05。
, 百拇医药
表1 MHC-DRB1、DQA1、DQB1等位基因在4种结核患儿和对照组中的阳性率和相对风险 MHC亚型
阳性例数
阳性率(%)
RR
对照
(n=91)
MT
(n=19)
TM
(n=36)
PT
(n=20)
, 百拇医药
TP
(n=28)
对照
MT
TM
PT
TP
MT
TM
PT
TP
DRB1*1201
4
, 百拇医药 0
1
2
3
4.4
0
2.8
10.0
10.7
0.49
0.62
2.42
2.61
DRB1*1202
, 百拇医药
8
4
9
3
0
8.8
21.1
25.0
15.0
0
2.77
3.46
1.83
, http://www.100md.com 0.17
DRB1*1501
21
13
25
16
15
23.1
68.4
69.4
80.0
53.6
7.22*
, http://www.100md.com
7.58*
13.3*
3.84**
DRB1*1502
14
0
1
2
3
15.4
0
2.8
, 百拇医药 10.0
10.7
0.14
0.15
0.61
0.66
DRB1*1602
5
0
1
0
0
5.5
, http://www.100md.com 0
2.8
0
0
0.40
0.49
0.38
0.28
DRB1*0901
27
5
8
1
3
, http://www.100md.com
29.7
26.3
22.2
5.0
10.7
0.85
0.68
0.12
0.28
DQA1*0101
18
5
1
, http://www.100md.com
3
19.8
13.9
5.0
10.7
0.65
0.21
0.49
DQA1*0102
27
12
22
13
, http://www.100md.com
17
29.7
63.3
61.1
65.0
60.7
4.06
3.72*
4.40**
3.66**
DQB1*0303
27
, 百拇医药
1
3
29.7
5.0
10.7
0.12
0.28
DQB1*0602
21
8
18
10
10
, http://www.100md.com
23.1
42.1
50.0
50.0
38.7
2.42
3.33
3.33
1.85
注：* Pc<0.01 ** Pc<0.05
讨 论
一、关于正相关问题
, 百拇医药
DRB1*1501为有显著差异的正关联基因，它在4种各型结核患儿都处于风险首位。除结核性胸膜炎的相关性(RR=3.84)稍低外,以原发性肺结核最高(RR=13.33)，粟粒型肺结核(RR=7.22)和结核性脑膜炎(RR=7.58)近似。粟粒型肺结核和结核性脑膜炎均为血行播散的结果，而肺结核则较多地倾向于由迟发性超敏反应而引发病灶，提示这一关联基因是否与各型结核患儿对结核菌的免疫能力不同有关，值得进一步研究。
DRB1*1202在除外胸膜炎的所有结核患儿中均有不同程度的增高，独有胸膜炎下降。DRB1*1201在原发性肺结核和结核性胸膜炎表现为增高，而在有血行播散的粟粒型肺结核和结核性脑膜炎中表现出下降。虽经χ2检验，组间差异无显著意义，但如果扩大标本量，所得结果可能对揭示不同类型结核的发病机理的差异提供帮助。
DQA1*0102在4种结核患儿中对此等位基因的相对风险甚接近，RR为3.66～4.40，虽然差异都有显著意义，但与DRB1*1501相比RR小得多。DRB1*1501全部与本基因连锁表现为DRB1*1501-DQA1*0102-DQB1*0602单倍型，DQA1*0102还与DRB1*1502、DRB1*1602连锁[5]。如果假定DQA1*0102本身致病，则势必表现为与之连锁的DRB1*1502和1602也会增高。但DRB1*1502和1602基因在患儿组中均表现为下降。因此推论DQA1*0102的增高不是原发的而是继发的，是由于它与DRB1*1501处于部分的连锁不平衡的原因。同理，DQB1*0602在患儿组中稍微的增高也是由DRB1*1501增高附带的次级效应。因此，DQA1、DQB1基因区未发现与结核易感性相关联的等位基因。
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二、关于负关联问题
负关联(基因频率在患儿组中下降)是一种保护性效应。本研究中的负关联基因Pc均无显著意义。DRB1*1502、1602和0901均表现出一定程度的负关联，查其β链第86位均为甘氨酸[6]。
三、对于关联性可能机理的推测
据文献报道：DRB1*1501，DRB1*1202的DR分子β链第86位氨基酸均为缬氨酸；DRB1*1502，1602，0901 DR分子β链第86位均为甘氨酸[6]；结合我们的结果可以推测，DR分子β链86位缬氨酸可能为结核易感性的关键氨基酸，而DR分子β链86位甘氨酸可能为对结核有保护性的关键氨基酸。
MHCⅠ、Ⅱ类分子在启动免疫反应中的作用主要是向T细胞递呈预处理的抗原多肽，而T细胞则对MHC-peptide复合物进行识别，然后在一系列T细胞激活和淋巴因子的相互作用下分别启动了细胞免疫和体液免疫[7，8]。因此，MHC分子和抗原肽的结合和递呈是免疫反应始发的关键一步。MHC分子的关键锚着残基的电荷、极性、亲水程度和分子大小决定被结合的多肽的结构、亲和性等特征。这些特征的综合效应决定了T细胞的识别和反应的性质。若设想机体对抗原多肽的识别不足会造成感染(或肿瘤)，而识别太过或识别错误则造成自身免疫反应，这样则可能解释MHC对感染性疾病的易感或抵抗。从DR分子立体构型看，β链第86位恰在α螺旋左端内侧，为锚着残基之一，是至关重要的。缬氨酸分子较大，又无极性(引力小)，从而造成分子结合槽变小，与结核菌抗原肽的结合能力较弱，则导致对T辅助细胞的刺激不足，致T细胞反应较弱而发病。而甘氨酸分子较小，又有极性，使分子结合槽部位容易与结核菌抗原肽结合而对T细胞激活能力强而免于发病。以上推测尚需大量深入的实验来证实。
, 百拇医药
参考文献
1 de Vries RRP, Ottenhoff THM, van Schooten WCA. Human leucocyte antigens (HLA) and mycobacterial disease. Springer Semin Immunopathol, 1988, 10: 305-318.
2 Miller SA, Dukes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research, 1988,16:1215.
3 Qiu CC, Zhao Y, Tao ZY, et al, Rapid HLA-DRB1 generic typing by PCR-SSP method. Chin Med Sci, 1995, 10:34-37.
, http://www.100md.com
4 Gebeyehu G, Rao PY, chan PS, et al. Novel biotinylated nucleotide-analogs for labeling and colorimetric detection of DNA. Nucleic Acids Res, 1987, 15:4513-4534.
5 Gao X, Sun Y, An J, et al. DNA typing for HLA-DR, and -DP alleles in a Chinese population using the polymerase chain reaction(PCR) and oligonuleotide probes. Tissue Antigens, 1991, 38:24-30.
6 Marsh SGE, Bodmer JG.HLA class Ⅱ region nucleotide sequences, 1995. Tissue Antigens, 1995, 45:258-280.
, 百拇医药
7 Hammer J, Sinigaglia F. Identifying self and foreign peptides bound to MHC class Ⅱ molecules. Immunologist, 1994, 2:82-87.
8 Germain RN. MHC-dependent antigen processing and peptide presentation: providing ligands for T lymphocyte activation. Cell, 1994, 76:287-299.
(收稿：1998-05-25 修回：1999-03-23), 百拇医药
单位：100045 北京，首都医科大学附属北京儿童医院内科(周希玲，江载芳)；中日友好医院临床医学研究所(孙逸平)
关键词：结核；主要组织相容性复合物；基因，MHC Ⅱ类；聚合酶链反应；寡核苷酸探针
中华儿科杂志990610 【摘要】 目的 研究中国北方汉族儿童结核病与主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类基因的关联，以探讨结核发病的免疫遗传机制。方法 采用聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针斑点杂交(PCR-SSOP)方法，测定原发性肺结核20例、结核性胸膜炎28例、粟粒型肺结核19例、结核性脑膜炎36例和91例正常对照组的MHC-DRB1，DQA1，DQB1等位基因。结果 在4种结核患儿中DRB1*1501显著增高，在粟粒型肺结核、结核性脑膜炎、原发性肺结核和结核性胸膜炎中相对风险(RR)分别为7.22,7.58,13.33和3.84, 校正P(Pc)均<0.05；DRB1*1202在粟粒型肺结核、结核性脑膜炎和原发性肺结核组增高，RR分别为2.77、3.46和1.83，而在结核性胸膜炎组降低，RR为0.17，Pc均>0.05。DRB1*1201在原发性肺结核、结核性胸膜炎增高，RR分别为2.42、2.61，在粟粒型肺结核和结核性脑膜炎降低，RR分别为0.49和0.62，Pc均>0.05。DRB1*1502、1602、0901在各型结核患儿中表现为减少，但Pc均>0.05。结论 中国北方汉族儿童结核病与MHC-DR基因有显著关联，其关联集中在DRB1*1501上。在各型结核患儿中基因频率减低的亚型不尽相同，可能对机体有一定保护作用。
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A study on association of tuberculosis with major histocompatibility complex Ⅱ genes ZHOU Xiling, JIANG Zaifang, SUN Yiping. Department of Internal Medicine, Beijing Children′s Hospital, The Capital University of Medical Sciences, Beijing 100045
【Abstract】 Objective To explore the immungenetic basis of and the association of MHC class Ⅱ genes with tuberculosis in Han children in northern regions of China.Methods MHC-DRB1, DQA1, DQB1 were examined by using polymerase chain reaction/sequence specific oligonuleotide probe (PCR/SSOP) methods in 19 patients with miliary tuberculosis (MT), 36 with tuberculous menigitis (TM),20 with primary tuberculosis (PT), 28 with tuberculous pleurisy (TP) and 91 controls.Results The gene frequencies of DRB1*1501 were markedly increased in the children with 4 types of tuberculosis. The values of relative risk (RR) were 7.22, 7.58, 13.33 and 3.84 in MT, TM, PT and TP, respectively (the corrected P value, i.e., Pc<0.05). DRB1*1202 increased in MT, TM and PT(RR=2.77, 3.46 and 1.83, respectively) and decreased in TP (RR=0.17, Pc>0.05). DRB1*1201 increased in PT and TP (RR=2.42 and 2.61) and decreased in MT and TM (RR=0.49 and 0.62, Pc>0.05). DRB1*1502, 1602, 0901 decreased in the 4 groups (Pc>0.05).Conclusion Tuberculosis of children in north China is significantly associated with MHC-DRB1*1501. The subtypes of genes with decreased frequencies in the 4 groups were not completely the same, which might mean certain protective function.
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【Key words】 Tuberculosis Major histocompatibility complex Genes, MHC class Ⅱ Polymerase chain reaction Oligonucleotide probes
结核病在历史上是最严重的传染病，如今它仍然是威胁人类健康的疾病之一。Koch发现结核分枝杆菌后确定了本病的病原体。但有证据表明遗传因素对结核病的发病有一定影响。结核的病理特征主要表现为机体对结核杆菌的迟发性变态反应，而不是结核杆菌对机体的直接损伤[1]。推测这种易感性的差异与免疫反应的个体差异有关。把结核病的免疫特性与易感性的遗传倾向结合起来考虑，可设想结核杆菌使人类感染后发病受某些免疫反应基因的控制。免疫反应基因是主要组织相容性复合体(MHC)。因此我们考虑结核病的发病可能与MHC的某些等位基因有关联。研究中国儿童各型结核病和MHC Ⅱ类基因的关联是本研究的目的。
材料和方法
, 百拇医药
一、研究对象
结核病患儿均为中国北方各省市(北京、天津、河北、山西、内蒙古、辽宁、吉林等)的汉族儿童。原发性肺结核(PT)20例，粟粒型肺结核(MT)19例，结核性脑膜炎(TM)36例，结核性胸膜炎(TP)28例。正常对照组为同民族本地无关健康成年人共91例，经胸部X线透视无活动性结核灶及钙化灶。
二、标本收集
取静脉血4～5 ml，用5% EDTA 0.5ml抗凝，-20℃冻存以待提取DNA。
三、实验方法
1.用盐析法提取基因组DNA[2]。
2.基因组DNA的扩增：用PCR/SSP法[3]对103例结核患儿和91例正常对照组进行MHC-DRB1、DQA1、DQB1基因分型。
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3.MHC-DRB1、DQA1、DQB1等位基因亚型的测定——序列特异性寡核苷酸探针斑点杂交(PCR-SSOP)[4]：探针采用地高辛寡核苷酸3′末端标记。
四、统计学分析
主要计算相对风险(RR)值和校正P值(Pc)。计算采用上海免疫学研究所HLA与疾病相关分析软件完成。将患儿组和对照组中MHC等位基因的分布进行比较发现关联的等位基因。
结 果
4种结核患儿组DRB1*1501阳性率均高于对照组，RR升高，Pc<0.01或0.05。DQA1*0102亦高于对照组，除MT(可能因例数较少)外，RR升高与对照组差异亦具有显著意义。DQB1*0602 RR亦升高，但Pc>0.05。DRB1*1202 RR在MT, TM, PT升高，而在TP下降，不过Pc均>0.05(表1)。DRB1*1502、1602、0901在各型结核患儿中表现为减少，但Pc均>0.05。
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表1 MHC-DRB1、DQA1、DQB1等位基因在4种结核患儿和对照组中的阳性率和相对风险 MHC亚型
阳性例数
阳性率(%)
RR
对照
(n=91)
MT
(n=19)
TM
(n=36)
PT
(n=20)
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TP
(n=28)
对照
MT
TM
PT
TP
MT
TM
PT
TP
DRB1*1201
4
, 百拇医药 0
1
2
3
4.4
0
2.8
10.0
10.7
0.49
0.62
2.42
2.61
DRB1*1202
, 百拇医药
8
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21.1
25.0
15.0
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2.77
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DRB1*1501
21
13
25
16
15
23.1
68.4
69.4
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53.6
7.22*
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7.58*
13.3*
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DRB1*1502
14
0
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0
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DRB1*1602
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0
1
0
0
5.5
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2.8
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DRB1*0901
27
5
8
1
3
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29.7
26.3
22.2
5.0
10.7
0.85
0.68
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DQA1*0101
18
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1
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13.9
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DQA1*0102
27
12
22
13
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17
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61.1
65.0
60.7
4.06
3.72*
4.40**
3.66**
DQB1*0303
27
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1
3
29.7
5.0
10.7
0.12
0.28
DQB1*0602
21
8
18
10
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23.1
42.1
50.0
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38.7
2.42
3.33
3.33
1.85
注：* Pc<0.01 ** Pc<0.05
讨 论
一、关于正相关问题
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DRB1*1501为有显著差异的正关联基因，它在4种各型结核患儿都处于风险首位。除结核性胸膜炎的相关性(RR=3.84)稍低外,以原发性肺结核最高(RR=13.33)，粟粒型肺结核(RR=7.22)和结核性脑膜炎(RR=7.58)近似。粟粒型肺结核和结核性脑膜炎均为血行播散的结果，而肺结核则较多地倾向于由迟发性超敏反应而引发病灶，提示这一关联基因是否与各型结核患儿对结核菌的免疫能力不同有关，值得进一步研究。
DRB1*1202在除外胸膜炎的所有结核患儿中均有不同程度的增高，独有胸膜炎下降。DRB1*1201在原发性肺结核和结核性胸膜炎表现为增高，而在有血行播散的粟粒型肺结核和结核性脑膜炎中表现出下降。虽经χ2检验，组间差异无显著意义，但如果扩大标本量，所得结果可能对揭示不同类型结核的发病机理的差异提供帮助。
DQA1*0102在4种结核患儿中对此等位基因的相对风险甚接近，RR为3.66～4.40，虽然差异都有显著意义，但与DRB1*1501相比RR小得多。DRB1*1501全部与本基因连锁表现为DRB1*1501-DQA1*0102-DQB1*0602单倍型，DQA1*0102还与DRB1*1502、DRB1*1602连锁[5]。如果假定DQA1*0102本身致病，则势必表现为与之连锁的DRB1*1502和1602也会增高。但DRB1*1502和1602基因在患儿组中均表现为下降。因此推论DQA1*0102的增高不是原发的而是继发的，是由于它与DRB1*1501处于部分的连锁不平衡的原因。同理，DQB1*0602在患儿组中稍微的增高也是由DRB1*1501增高附带的次级效应。因此，DQA1、DQB1基因区未发现与结核易感性相关联的等位基因。
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二、关于负关联问题
负关联(基因频率在患儿组中下降)是一种保护性效应。本研究中的负关联基因Pc均无显著意义。DRB1*1502、1602和0901均表现出一定程度的负关联，查其β链第86位均为甘氨酸[6]。
三、对于关联性可能机理的推测
据文献报道：DRB1*1501，DRB1*1202的DR分子β链第86位氨基酸均为缬氨酸；DRB1*1502，1602，0901 DR分子β链第86位均为甘氨酸[6]；结合我们的结果可以推测，DR分子β链86位缬氨酸可能为结核易感性的关键氨基酸，而DR分子β链86位甘氨酸可能为对结核有保护性的关键氨基酸。
MHCⅠ、Ⅱ类分子在启动免疫反应中的作用主要是向T细胞递呈预处理的抗原多肽，而T细胞则对MHC-peptide复合物进行识别，然后在一系列T细胞激活和淋巴因子的相互作用下分别启动了细胞免疫和体液免疫[7，8]。因此，MHC分子和抗原肽的结合和递呈是免疫反应始发的关键一步。MHC分子的关键锚着残基的电荷、极性、亲水程度和分子大小决定被结合的多肽的结构、亲和性等特征。这些特征的综合效应决定了T细胞的识别和反应的性质。若设想机体对抗原多肽的识别不足会造成感染(或肿瘤)，而识别太过或识别错误则造成自身免疫反应，这样则可能解释MHC对感染性疾病的易感或抵抗。从DR分子立体构型看，β链第86位恰在α螺旋左端内侧，为锚着残基之一，是至关重要的。缬氨酸分子较大，又无极性(引力小)，从而造成分子结合槽变小，与结核菌抗原肽的结合能力较弱，则导致对T辅助细胞的刺激不足，致T细胞反应较弱而发病。而甘氨酸分子较小，又有极性，使分子结合槽部位容易与结核菌抗原肽结合而对T细胞激活能力强而免于发病。以上推测尚需大量深入的实验来证实。
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参考文献
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(收稿：1998-05-25 修回：1999-03-23), 百拇医药