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编号:10269512
细胞生长肽对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用
http://www.100md.com 《中华儿科杂志》 1999年第7期
     作者:孙桂莲 韩玉昆

    单位:110001 沈阳,中国医科大学第一临床学院儿科(孙桂莲),第二临床学院儿科(韩玉昆)

    关键词:大鼠;Wistar;脑缺氧;脑缺血;脱噬作用;成纤维细胞生长因子;碱性

    中华儿科杂志990710 【摘要】 目的 研究碱性成纤维细胞生长肽(bFGF)对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的保护作用。方法 应用105只(bFGF组58只,未治疗组42只,对照组5只)新生Wistar大鼠制备HIBD模型,然后观察bFGF对HIBD模型鼠的体重增长、死亡率、脑损伤的影响,并用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测bFGF对缺氧缺血后脑细胞凋亡的影响。结果 bFGF治疗组体重增长为(12±4)g,明显高于未治疗组(6±4)g,差异有非常显著意义(P<0.001);治疗组病死率(5%)低于未治疗组(28%),差异有非常显著意义(P<0.01);治疗组脑病变率(25%)明显低于未治疗组(62%),差异有显著意义(P<0.05)。TUNEL检测结果,治疗组阳性细胞均数(30个/500个细胞)低于未治疗组(159个/500个细胞),差异有非常显著意义(P<0.001)。结论 bFGF对HIBD脑组织有修复和促进细胞生长的作用。
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    A study on protective effect of bFGF on hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats SUN Guilian, HAN Yukun. Department of Pediatrics, First University Hospital, China Medical University, ShenYang 110001

    【Abstract】 Objective To explore the protective effect of basic fibroblast growth factor (bFGF) on hypoxic-ischemic brain damage (HIBD) in neontal rats.Methods The HIBD models were established with 7 day old Wistar rats. Body weights, mortalities and the degree of brain damage in HIBD rats treated with bFGF were compared with that in HIBD rats without the treatment of bFGF (control group). The effect on apoptosis of neurons was observed by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick end labelling (TUNEL) staining. Results The body weight in bFGF treatment group was significantly higher than that in control group (12±4) g and (6±4) g, respectively (P<0.001); The death rate in bFGF treatment group (5%) was much lower than that in control group (62%, P<0.01); the average number of positive cells in bFGF treatment group (30/500 cells) was significantly lower than that in control group (159/500 cells) (P<0.001).Conclusion The results verified the protective efficacy of bFGF on HIBD.
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    【Key words】 Rats, Wistar Cerebral ischemia Cerebral anoxia Apoptosis Fibroblast Growth factor, basic

    新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的发病机制复杂,至今仍无特效治疗,近年来研究表明脑缺血后细胞的死亡有凋亡参与。目前解释神经细胞凋亡的机制有两个较为公认的学说:一是基因学说;二是营养理论学说,营养因子在神经系统的生理和病理中起重要作用。本研究利用新生Wistar大鼠制备HIBD模型,观察碱性成纤维细胞生长肽(bFGF)对HIBD的治疗及缺氧缺血(HI)后脑细胞凋亡的影响。

    材料和方法

    一、材料

    新生7日龄Wistar大鼠,性别不限,体重12~16 g,共105只,由本院动物实验室提供;RSS-51W型便携式数字测氧仪(上海产);自制常压缺氧舱,40 cm×50 cm×60 cm,有2个2 cm×2 cm小孔与外界相通,内有电热毯控制舱温,钠石灰吸收舱内水分和CO2;程序性细胞死亡检测试剂盒(华美生物工程公司产品)内含末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)、生物素标记的dUTP及亲和素——辣根过氧化物酶等;bFGF(广州暨南大学生物工程研究所,批号960602)。
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    二、方法

    1.新生大鼠HIBD模型制备:结扎大鼠左侧颈总动脉,恢复2~4小时后置于由氮气和空气调节、测氧仪监控的常压缺氧舱内[舱温(36±1)℃,氧浓度8%],2小时后取出。

    2.治疗观察:105只大鼠随机分治疗组(bFGF组)58只、未治疗组42只及正常鼠5只做对照组。58只HIBD模型鼠HI后立即给bFGF腹腔注射,4 000 U/kg,每天1次,共7天;42只鼠HI后立即腹腔注射等量生理盐水做对照。以上鼠均于观察第8天处死。观察指标:体重增长情况、死亡率、左右脑重量比较、大体及镜下病变情况及原位缺口末端标记(TUNEL)染色阳性细胞数。

    3.光镜检查:经10%中性福尔马林缓冲液固定后,以视交叉、乳头体中部、大脑后缘与小脑连接处为切点,将脑冠状切成4片,常规石蜡包埋,切片(厚6 μm)分别进行HE染色和 TUNEL染色,按Gavrieli法[1],AEC染色,苏木素复染。实验中以右侧脑做自身对照,不加TdT或生物素标记的dUTP做阴性对照,阳性细胞核和胞浆染成红色。结果判定:选取病变常见部位——脑皮质和纹状体,400倍光镜下,计数5个视野下500个细胞中的阳性细胞数。
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    结 果

    一、bFGF治疗后一般情况比较

    治疗组病死率及脑病变率明显低于未治疗组(表1)。

    表1 两组大鼠病死率及脑病变率比较 组别

    鼠数

    (只)

    死亡

    脑病变检查数

    (只)

    脑病变数(只)

    脑病变率

    (%)
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    鼠数(只)

    率(%)

    轻度

    重度

    合计

    未治疗组

    42

    16

    38

    42

    10

    16

    26

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    bFGF组

    58

    2

    4

    40

    6

    4

    10

    25

    两组比较χ2

    8.60

    9.88
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    P值

    <0.01

    <0.01

    注:左脑病变≤1/2为轻度,>1/2为重度

    bFGF组与未治疗组健侧(右侧)脑重量相近,但治疗组患侧(左侧)脑重于未治疗组(P<0.001);治疗组左右脑重量差异无显著意义,而未治疗组差异有非常显著意义(P<0.001)。表明bFGF治疗减轻了缺氧缺血后脑萎缩。而且治疗组体重增长也明显高于未治疗组(P<0.001)(表2)。

    表2 bFGF治疗组与未治疗组脑重量、体重增长及TUNEL检测结果比较 组别

    鼠数

    脑重量(±s,g)
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    体重增长

    (±s,g)

    TUNEL检测阳性细胞数

    (个/500个细胞)

    左脑

    右脑

    左右脑差别

    自身比较t值

    中位数

    范围

    未治疗组

, http://www.100md.com     42

    0.47±0.10

    0.59±0.05

    0.13±0.12

    6.96*

    6±4

    159

    0~480

    bFGF组

    40

    0.58±0.02

    0.59±0.03
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    0.01±0.02

    1.75

    12±4

    30

    0~408

    两组比较t值

    6.88*

    0

    6.24*

    -

    6.16*

    33.08*
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    注:与未治疗组比较,* P<0.001

    二、TUNEL染色结果及bFGF对脑细胞凋亡的影响

    TUNEL染色发现HI后左脑病灶可见阳性细胞,既有凋亡特征(胞体缩小、核固缩、核碎裂、凋亡小体形成)的阳性细胞,又有坏死特征(胞体较大、核膜及核仁不清或浅染的无凋亡小体)的阳性细胞(图1)。凋亡细胞多位于梗塞的边缘内带及选择性细胞死亡区;坏死的细胞多位于梗塞的中心,右侧脑及小脑、脑干、正常鼠全脑均为阴性。

    可见阳性的凋亡早期细胞(↑);阳性凋亡晚期细胞

    ()和阳性坏死细胞(△)(TUNEL染色,×200)
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    图1 缺氧缺血后左脑组织图片

    bFGF治疗组阳性细胞均数明显低于未治疗组(表2)。

    讨 论

    研究表明,神经元在HI后死亡分两个阶段,早期因能量急性消耗、离子紊乱及兴奋性氨基酸、自由基等的毒性作用,神经元肿胀、溶解;以后可引起继发性死亡(许多因素可致继发性死亡),但不能清楚解释细胞死亡的延迟。目前认为凋亡、小胶质细胞和巨噬细胞的细胞毒性可解释此过程。本研究应用TUNEL法已证实HI后脑细胞死亡为凋亡与坏死共存,轻度病变主要是凋亡,重度病变为凋亡与坏死共存,以凋亡为主,与文献报道相符[2]

    FGF受体在神经元、星形细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和纤维细胞等均有表达,bFGF结合到相应的受体上而发挥不同的作用。研究发现脑缺血后,脑的反应性星形细胞内bFGF免疫反应及它的mRNA水平增加,表明bFGF有助于损伤组织的恢复[3]。bFGF不仅能促进神经元、胶质细胞和内皮细胞的存活和生长,而且在缺血神经元的修复和存活中起作用。bFGF可通过新的神经基因转录和蛋白合成,也可能通过影响胶质细胞(促进分泌其他神经营养因子)和促进血管细胞增生(形成新的血管通道)而起作用[4]。本研究也表明bFGF明显减轻了脑病变及脑细胞凋亡,还降低了死亡率,促进HIBD模型鼠的体重增长,与文献报道相符[5]
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    bFGF含154个氨基酸,分子量为18 000的多肽,不易通过血脑屏障,因新生动物血脑屏障发育不完善,加上缺氧缺血后血脑屏障的完整性被破坏,所以bFGF可透过血脑屏障发挥作用,本试验结果也证实了此观点。

    参考文献

    1 Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992, 119:493-501.

    2 Beilharz EJ, Williams CE, Dragunow M, et al. Mechanisms of delayed cell death following hypoxic-ischemic injury in the immature rat:evidence for apoptosis during selective neuronal loss.Mol Brain Res,1995,29:1-14.
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    3 Takami K, Iwane M, Kiyota Y, et al. Increase of basic fibroblast growth factor immunoreactivity and its mRNA level in rat brain following transient forebrain ischemia. Exp Brain Res,1992,90:1-10.

    4 Zivin JA, Choi DW. Stroke therapy. Sci Am,1991,265:56-63.

    5 Bethel A, Kirsch JR, Koehler RC, et al. Intravenous basic fibroblast growth factor decreases brain injury resulting from focal ischemia in cats. Stroke, 1997,28:609-616.

    (收稿:1998-04-20 修回:1998-11-12), http://www.100md.com