用PCR-SSCP方法检测中国人Alport综合征COL4A5基因突变
作者：丁洁 郭顺华 俞礼霞 杨霁云
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：肾炎；遗传性；突变；胶原；多态现象；单链构象
中华儿科杂志990805 摘要 目的 检测中国人Alport综合征(AS)患者编码Ⅳ型胶原α 5链的COL4A5基因突变。方法 提取18例中国X连锁显性遗传型AS患者基因组DNA，据COL4A5基因中与外显子相邻的内含子序列设计引物，分别作DNA聚合酶链式反应(PCR)，扩增了该基因第20～51外显子。以琼脂糖凝胶电泳鉴定产物，作单链构象多态性(SSCP)分析检测PCR产物，对迁移率异常者进行DNA测序。结果 PCR-SSCP分析发现患者8的20、39和46外显子，以及患者90的26外显子的PCR产物单链DNA迁移率异常，亦发现患者8之母存在与其相同的异常迁移带以及正常迁移带。DNA测序证实患者8的COL4A5基因第20外显子1157和1158位缺失CC两个碱基，而第39及46 外显子为同义突变；患者90第26外显子2171位缺失一个C碱基。这两位患者的缺失突变均致移码突变，并使终止密码子提前出现，导致Ⅳ型胶原α 5链显著缩短。结论 首次报道了中国大陆AS患者COL4A5基因的两个小缺失突变，其中一个缺失突变伴有两个同义突变，未发现大片段缺失及重组突变。通过PCR-SSCP分析亦证实一患者之母为COL4A5基因的杂合子。
, http://www.100md.com
Detection of mutations in COL4A5 gene by PCR-SSCP analysis in Chinese Alport syndrome(AS) patients
DING Jie,GUO Shunhua,YU Lixia,et al.
Department of Pediatrics,First Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100034
Abstract Objective To detect mutations in COL4A5 gene encoding type Ⅳ collagen α 5 chain in Chinese AS patients.Methods Genomic DNA from 18 unrelated patients (12 males and 6 females) with X-linked AS were analyzed.So far,32 of 51 exons at the 3′end portion of COL4A5 gene were amplified with the primers synthesized according to the published flanking intronic sequences.The PCR products were further analyzed by agarose gel electrophoresis and single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis.The PCR products showing polymorphism by SSCP analysis were directly sequenced.Results By PCR-SSCP analysis,4 PCR products were identified with different mobility of single strand DNA,exon 20,39 and 46 in patient No.8; exon 26 in patient No.90.The PCR product of No.8 patient′s mother was revealed with a special pattern containing single strand DNA bands identical to those of the No.8 patient and the normal control.DNA sequencing analyses revealed: (1) silent mutations in exon 46 and 39; (2) exon 20 was deleted with CC nucleotides and exon 26 was deleted with one C nucleotide ,both of which induced nonsense mutations resulting in remarkably truncated α 5 chains of type Ⅳ collagen.Conclusion For the first time,mutations in COL4A5 gene were identified in Chinese AS patients in the mainland of China.Two small deletions were detected,one of which was accompanied by two silent mutations.No major gene deletion or rearrangement was detected.The heterozygote status of one patient′s mother was also demonstrated by PCR-SSCP analysis.
, 百拇医药
Key words Nephritis,hereditapy Mutation Collagen Polymorphism,single-stranded conformational
Alport综合征(Alport syndrome,AS)是一种表现为血尿、进行性肾功能损害，常伴感音神经性耳聋及眼部病变的遗传性疾病[1-3]。主要的遗传方式为X连锁显性遗传(XD)。国外的研究已证明XD型AS存在编码Ⅳ型胶原α 5链的基因——COL4A5的突变，因此导致肾小球基底膜等处的胶原结构不能正常形成[4-5] 。尽管有关AS患者的COL4A5基因突变国外已有不少报道[6-8]，但尚无我国大陆AS患者该基因突变的资料。为此，我们对18例中国AS患者，应用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)及DNA测序方法检测COL4A5基因，以确定
表1 PCR方法扩增COL4A5基因第20～51外显子引物序列及反应条件 外显子
, 百拇医药
引物序列(5′～3′)
产物
(bp)
退火
(℃)
氯化镁
(mmol/L)
51
F:GATCTGATTGTCTTATTTCTTATT
192
52
2.5
, 百拇医药 R:GGACAATGAGACACTGCATCCTA
50
F:TTGCGGCACATTTTTCCTTGTC
233
45
2.5
R:GGACCTGAATTAAAGCTATAAGC
49
ATTATGTTCCTTCTCCTTTTCC
176
42
, 百拇医药 4.0
ATGACAAATGCAAGGAAGAGT
48
F:CTTTACTGTTTTCTCTCCAAATC
240
42
2.5
R:GTAAAAGTCACACAGCTAAATC
47
F:CTTGTATACTGATTATTTCGTGG
268
, 百拇医药 45
2.5
R:AGGAAATTAGATATTGATTATC
46
F:ATATTTGAATGCCTCATTCTTTTC
159
45
2.5
R:TCCACCAACAGCATGTTTTACTTG
45
F:CCCTTCAAATTTGTGTGTTTTG
, http://www.100md.com
189
45
2.5
R:AATGATAATAAAGATGATCTGCA
44～
F:CCCCCCTTTGTAACATTAATGA
338
45
2.5
43
R:GGTATAACTATCTTCAGGAATA
42
, http://www.100md.com
F:ATGTCGTCATTTGCTGTGGATTA
190
40
2.5
R:TCATCAGATATCTACTTCCA
41
F:TTATCTTCTAATTATACTTTACTTTC
246
52
2.5
R:AGACCATTCTCCTACCACTC
, 百拇医药
40
F:GTTTTGTTTTGTTTTGTACTCTG
105
45
3.0
R:TGATTTAGCATGTTTTATTAAGG
39
F:TAACCTGCTGTACTCAATTTT
152
45
3.0
R:AAATAGGAAAAATGAAAAACTACA
, http://www.100md.com
38
F:ATTTTTAAATTGAGCTCTTTACTC
136
52
3.0
R:ACAGCAAACTGTTATTTTTCAT
37
F:CTGCAGGGTGAGCCTGGTCTGC
145
58
2.0
R:AAGCTTCTGGGAATCCAGGAAGG
, 百拇医药
36
F:AATATTATATATCACATATTTTC
198
52
3.0
R:ATGTGCCTAAAACTATATGCC
35
F:ACCAATTTGACCTTTCTA
134
52
3.0
R:TATTTGGAAGATTTTCAT
, 百拇医药
34
F:ACTTGCCTCTTCTACTCA
146
45
2.5
R:ATGGCCTATTCACACTTAC
33
F:ATATTGTGTTTTCACACACTTTG
210
45
2.0
R:AATATTCATAAATAAATTCATTCACT
, 百拇医药
32
F:AATAGTTTTCTGGTTGACATC
250
48
3.0
R:TATTCTGTACTGACATAAAGC
31
F:ATTGATATTGTATTAACT
208
45
3.0
R:GAAAACTTTAAACAAATT
, 百拇医药
30
F:ACTGTATTTATTTCTTAA
154
45
2.5
R:CACATTTACTCTAATCTTAC
29
F:GTGTTTTGTCATGTGTATGCTC
200
45
2.5
R:TGAGATGCAGTGACAGCCTC
, 百拇医药
28
F:TTTGGTGGTTAAAAAATGAC
161
42
2.5
R:GAGAAGGAATAAAGAAAAATG
27
F:CTTTCAATAACTGCTGTTTCTCC
156
40
3.0
R:TGCCTGCTACCCATTCCAAC
, 百拇医药
26
F:TTTACCATTGATTTACTCTTGC
150
52
2.5
R:AGTTACTTTGAAATAAATTCCTC
25
F:ATATGTTTCTGTATTAAAC
226
40
3.0
R:TAAAACAAAACACAGTAAAC
, 百拇医药
24
F:TTTTTTTCCTTACTCATTTC
236
40
3.0
R:CAAAAATATCAAACCAACTC
23
F:GTTTGTGTGTGTGTGTGTTAG
125
42
2.5
R:CTTCTTTTTGTTTTATAATATACT
, 百拇医药
22
F:TGTTATTATGATTTCACTAG
142
52
2.5
R:TTAGAAGGTTACCCTGAGGC
21
F:GCTATCCTTTCTTTATCTTAC
133
52
2.5
R:AATGAATATGTTTGGAGATC
, 百拇医药
20
F:GATGAAATCATTTTGATCAC
235
52
3.0
R:CTTAATAGGAGAAAAATATAGC
注：F：上游引物；R下游引物突变性质并分析其可能的特点。
对象和方法
一、研究对象
1995～1998年在我院门诊及住院患者中，经临床表现、肾活组织电镜病理检查及(或)皮肤基底膜Ⅳ型胶原α链免疫荧光学检查、以及家族史调查而确诊的Alport综合征患者18例，其中男性12例，女性6例，平均年龄11岁(2.5～28岁)，其中2～14岁患者12例。家系调查均符合X连锁显性遗传型。正常对照4例，均无肾脏病表现及家族史，作为实验中的方法对照。
, http://www.100md.com
二、研究方法
1.取上述患者及部分患者父母及兄弟姐妹的外周血10 ml，枸橼酸钾抗凝，按盐析法[9]提取基因组DNA，4℃保存。同法提取正常对照的DNA。
2.根据已报道的COL4A5基因序列[10]，选取与外显子相邻的内含子序列设计引物(表1)，迄今所扩增的序列为COL4A5基因的第20～51外显子(自5′端记数)，引物由Genosys Biotechnologies，Inc.及Cybersyn公司合成。
3.PCR反应：在50 μl反应体积中，加入0.4～0.8 μg基因组DNA为模板，引物为1 μmol/L,dNTPs各为400 μmol/L，Taq酶(Promega公司)1～2.5 U。前5个循环为94℃变性1分钟，退火温度分别为68℃、66℃、64℃、62℃、60℃，时间30秒，延伸温度72℃、45秒。随后30个循环为：94℃、1分钟，退火温度见表1，时间30秒，延伸72℃，45秒(PCR热循环仪，Perkin-Elmer公司)。PCR完成后作1.6%～2%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物。
, 百拇医药
4.单链构象多态性(SSCP)分析：以含5%～10%甘油的10%聚丙烯酰胺凝胶制备20 cm×20 cm×0.1 cm胶板。取3 μl PCR产物，与甲酰胺上样液7 μl混合，96℃或100℃变性5～10分钟，迅速置入冰浴后上样，于4℃，120～160 V恒压电泳12～16小时。电泳完成后作硝酸银染色。
5.PCR产物直接测序：对SSCP分析出现单链DNA迁移率异常者，将PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后进行直接测序(北京医科大学肿瘤防治研究所及Cybersyn公司)。
结果
一、琼脂糖凝胶电泳结果
患者及正常对照的各外显子PCR反应产物均为单一区带，其大小与已知序列相一致。各PCR产物长度见表1。
二、SSCP及DNA测序结果
, 百拇医药
1.患者8第20外显子PCR产物的单链DNA迁移率与对照及其他患者有差异，测序证明为COL4A5基因的第1517C及1518C碱基缺失，导致移码突变，并使终止密码子TAG于1542位提前出现，α 5链长度由正常的1 685个氨基酸残基截短为439个氨基酸残基(图1)。
*表示患者8缺失的碱基
图1 患者8COL4A5基因第20外显子PCR
产物直接测序结果
该患者的COL4A5基因第46外显子及第39外显子的PCR产物的单链DNA迁移率与正常对照及其他患者有差异，DNA测序显示其COL4A5基因的46外显子的4477位碱基C置换为T，密码子由GAC转为GAT，均编码天冬氨酸，为同义突变。第39外显子的3715位碱基A置换为G，使第1171位密码子由CAA转为CAG，均编码谷氨酰胺，亦为同义突变。
, 百拇医药
将患者8及其父母的第20、39及46外显子的PCR产物同时作SSCP分析，其父仅有正常迁移带，其母兼有正常及异常迁移带(图2)。
C，正常对照；5、6、8，AS患者；M，患者8之母；F，患者8之父
图2 患者8及其父母COL4A5基因第46外显子PCR扩增产物SSCP分析
2.患者90的COL4A5基因第26外显子PCR产物的单链DNA迁移率与对照及其他患者有差异，DNA测序证明为COL4A5基因第2171位C碱基缺失，导致移码突变，并于2178位提前出现终止密码子TAA，使α 5链长度截短为659个氨基酸残基(图3，4)。
, 百拇医药 M，DNA分子量标准；C，正常对照；1、23、90、94、97，AS患者；Fa，患者8之父
图3 患者90COL4A5基因第26外显子PCR扩增产物SSCP分析
*表示患者90缺失的碱基
图4 患者90COL4A5基因第26外显子PCR扩增产物直接测序结果
讨论 近些年来，国外已对AS的临床、病理和分子生物学进行了大量的研究。欧美及日本等已先后证明了200余例XD型AS患者的COL4A5基因存在突变。但该基因的突变多种多样，可呈片段缺失、插入、点突变等，未发现AS患者COL4A5基因存在“热点”突变。另外，目前尚不明确AS中COL4A5基因突变是否存在人种间或地域的差异，因此亟待检测并分析来自不同种族、地区的AS患者的COL4A5基因，以确定突变性质及其特点，这不但有利于患者及其家系的遗传咨询和产前诊断，也有益于通过致病基因探索基因功能的工作。
, 百拇医药
COL4A5基因定位于Xq22，基因全长250kb，含51个外显子[10]。基因编码的α 5(Ⅳ)链含1 685个氨基酸残基，包括氨基端、中间由甘氨酸-X-Y 的三联结构反复串联而成的胶原区及羧基端非胶原区(NC1区)，其中NC1区对启动Ⅳ型胶原三股螺旋结构的形成有重要的作用[1]，故本研究选择了从该基因3’端开始进行基因突变的检测。在18例AS患者的COL4A5基因的3’端已检测的32个外显子中，发现了2例共4个位点的突变。
患者8为COL4A5基因第20外显子部位的缺失突变，导致终止密码子提前出现，肽链长度仅为正常的三分之一。患者90第26外显子的突变亦使肽链明显截短。此2例AS患者的COL4A5基因突变均使α 5(Ⅳ)链结构的部分胶原区及全部NC1区不能合成，必将导致Ⅳ型胶原分子的三股螺旋结构无法形成，而且截短的α 5链也容易被蛋白水解酶降解，故基底膜结构将发生严重缺陷。
根据患者8及其父母的PCR产物的SSCP分析结果，结合患者家族史，可以推定其母为COL4A5基因的杂合子，也进一步确定了该家系为X连锁显性遗传型AS。因此，用PCR-SSCP方法检出先证者后，便可在其家族成员中检测该外显子，以确定其他的患者及携带者，另外，亦可根据DNA测序的结果设计探针，在携带者怀孕时取羊水进行产前诊断。由此可见，对AS患者进行基因分析为该家系的遗传和生育咨询打下了基础。
, 百拇医药
患者8的COL4A5基因于第46及39外显子出现两个同义突变。因同义突变编码的氨基酸相同，故一般认为没有病理意义。同义突变可能是基因多态性的一种表现，但还需在人群中对更多的正常人进行检测。另外，仅在日本文献中报道过在第20 外显子发现错义突变而同时伴有第46外显子的同义突变的病例，是否提示这种突变形式可能为亚裔AS患者的特点之一，有待对更多患者作进一步的研究。
国外文献报道的COL4A5的基因突变中，约有8%～10%为大片段的基因缺失或重组突变，而我们的检测中未发现此种突变，可能提示为我国AS基因突变的特点，但尚需完成全基因的检测分析。
我们应用PCR-SSCP分析方法对中国18例AS患者的COL4A5基因进行了检测，至目前已检测了该基因3′端的32个外显子，发现2个缺失突变，2个同义突变。COL4A5基因其余外显子的检测工作仍在继续进行中。
本课题由国家自然科学基金资助(编号：39770780)
, http://www.100md.com
参考文献
1 Kashtan CE,Michael AF.Alport syndrome.Kidney Int,1996,50: 1445-1463.
2 Gubler M,Levy,M Broyer M,et al.Alport′s syndrome: a report of 58 cases and a review of the literature.Am J Med ,1981,70:493-505.
3 Wester DC,Atkin CL,Gregory MC.Alport syndrome: clinical update.J Am Acad Audiol,1995,6:73-79.
4 Kashtan CE,Sibley RK,Michael AF,et al.Hereditary nephritis: Alport syndrome and thin glomerular basement membrane disease.In: Tisher CC,Brenner BM,eds.Renal Pathology.Philadephia: J B Lippincott,1994.1239-1267.
, http://www.100md.com
5 Nakanishi K,Yoshikawa N,Iijima K,et al.Immunohistochemical study of α1-5 chains of type IV collagen in hereditary nephritis.Kidney Int,1994,46:1413-1421.
6 Heiskari N,Zhang X,Zhou J,et al.Identification of 17 mutations in ten exons in the COL4A5 collagen gene,but no mutations found in four exons in COL4A6: a study of 250 patients with hematuria and suspected of having Alport syndrome.J Am Soc Nephrol,1996,7:702-709.
7 Renieri A,Bruttini M,Galli L,et al.X-linked Alport syndrome: an SSCP-based mutation survey over all 51 exons of the COL4A5 gene.Am J Hum Genet,1996,58:1192-1204.
, 百拇医药
8 Kawai S,Nomura S,Harano T,et al.The COL4A5 gene in Japanese Alport syndrome patients: spectrum of mutions of all exons.Kidney Int,1996,49: 814-822.
9 Miller SA,Dykes DD,Polesky HF.A simple salting out precedure for entracting DNA from human nucleated cells.Nucleic Acids Res,1988,16:1215.
10 Zhou J,Leinonen A,Tryggvason K.Structure of human type IV collagen COL4A5 gene.J Bio Chem,1994,269:6608-6614.
(收稿：1998-10-30 修回：1999-05-04), 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：肾炎；遗传性；突变；胶原；多态现象；单链构象
中华儿科杂志990805 摘要 目的 检测中国人Alport综合征(AS)患者编码Ⅳ型胶原α 5链的COL4A5基因突变。方法 提取18例中国X连锁显性遗传型AS患者基因组DNA，据COL4A5基因中与外显子相邻的内含子序列设计引物，分别作DNA聚合酶链式反应(PCR)，扩增了该基因第20～51外显子。以琼脂糖凝胶电泳鉴定产物，作单链构象多态性(SSCP)分析检测PCR产物，对迁移率异常者进行DNA测序。结果 PCR-SSCP分析发现患者8的20、39和46外显子，以及患者90的26外显子的PCR产物单链DNA迁移率异常，亦发现患者8之母存在与其相同的异常迁移带以及正常迁移带。DNA测序证实患者8的COL4A5基因第20外显子1157和1158位缺失CC两个碱基，而第39及46 外显子为同义突变；患者90第26外显子2171位缺失一个C碱基。这两位患者的缺失突变均致移码突变，并使终止密码子提前出现，导致Ⅳ型胶原α 5链显著缩短。结论 首次报道了中国大陆AS患者COL4A5基因的两个小缺失突变，其中一个缺失突变伴有两个同义突变，未发现大片段缺失及重组突变。通过PCR-SSCP分析亦证实一患者之母为COL4A5基因的杂合子。
, http://www.100md.com
Detection of mutations in COL4A5 gene by PCR-SSCP analysis in Chinese Alport syndrome(AS) patients
DING Jie,GUO Shunhua,YU Lixia,et al.
Department of Pediatrics,First Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100034
Abstract Objective To detect mutations in COL4A5 gene encoding type Ⅳ collagen α 5 chain in Chinese AS patients.Methods Genomic DNA from 18 unrelated patients (12 males and 6 females) with X-linked AS were analyzed.So far,32 of 51 exons at the 3′end portion of COL4A5 gene were amplified with the primers synthesized according to the published flanking intronic sequences.The PCR products were further analyzed by agarose gel electrophoresis and single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis.The PCR products showing polymorphism by SSCP analysis were directly sequenced.Results By PCR-SSCP analysis,4 PCR products were identified with different mobility of single strand DNA,exon 20,39 and 46 in patient No.8; exon 26 in patient No.90.The PCR product of No.8 patient′s mother was revealed with a special pattern containing single strand DNA bands identical to those of the No.8 patient and the normal control.DNA sequencing analyses revealed: (1) silent mutations in exon 46 and 39; (2) exon 20 was deleted with CC nucleotides and exon 26 was deleted with one C nucleotide ,both of which induced nonsense mutations resulting in remarkably truncated α 5 chains of type Ⅳ collagen.Conclusion For the first time,mutations in COL4A5 gene were identified in Chinese AS patients in the mainland of China.Two small deletions were detected,one of which was accompanied by two silent mutations.No major gene deletion or rearrangement was detected.The heterozygote status of one patient′s mother was also demonstrated by PCR-SSCP analysis.
, 百拇医药
Key words Nephritis,hereditapy Mutation Collagen Polymorphism,single-stranded conformational
Alport综合征(Alport syndrome,AS)是一种表现为血尿、进行性肾功能损害，常伴感音神经性耳聋及眼部病变的遗传性疾病[1-3]。主要的遗传方式为X连锁显性遗传(XD)。国外的研究已证明XD型AS存在编码Ⅳ型胶原α 5链的基因——COL4A5的突变，因此导致肾小球基底膜等处的胶原结构不能正常形成[4-5] 。尽管有关AS患者的COL4A5基因突变国外已有不少报道[6-8]，但尚无我国大陆AS患者该基因突变的资料。为此，我们对18例中国AS患者，应用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)及DNA测序方法检测COL4A5基因，以确定
表1 PCR方法扩增COL4A5基因第20～51外显子引物序列及反应条件 外显子
, 百拇医药
引物序列(5′～3′)
产物
(bp)
退火
(℃)
氯化镁
(mmol/L)
51
F:GATCTGATTGTCTTATTTCTTATT
192
52
2.5
, 百拇医药 R:GGACAATGAGACACTGCATCCTA
50
F:TTGCGGCACATTTTTCCTTGTC
233
45
2.5
R:GGACCTGAATTAAAGCTATAAGC
49
ATTATGTTCCTTCTCCTTTTCC
176
42
, 百拇医药 4.0
ATGACAAATGCAAGGAAGAGT
48
F:CTTTACTGTTTTCTCTCCAAATC
240
42
2.5
R:GTAAAAGTCACACAGCTAAATC
47
F:CTTGTATACTGATTATTTCGTGG
268
, 百拇医药 45
2.5
R:AGGAAATTAGATATTGATTATC
46
F:ATATTTGAATGCCTCATTCTTTTC
159
45
2.5
R:TCCACCAACAGCATGTTTTACTTG
45
F:CCCTTCAAATTTGTGTGTTTTG
, http://www.100md.com
189
45
2.5
R:AATGATAATAAAGATGATCTGCA
44～
F:CCCCCCTTTGTAACATTAATGA
338
45
2.5
43
R:GGTATAACTATCTTCAGGAATA
42
, http://www.100md.com
F:ATGTCGTCATTTGCTGTGGATTA
190
40
2.5
R:TCATCAGATATCTACTTCCA
41
F:TTATCTTCTAATTATACTTTACTTTC
246
52
2.5
R:AGACCATTCTCCTACCACTC
, 百拇医药
40
F:GTTTTGTTTTGTTTTGTACTCTG
105
45
3.0
R:TGATTTAGCATGTTTTATTAAGG
39
F:TAACCTGCTGTACTCAATTTT
152
45
3.0
R:AAATAGGAAAAATGAAAAACTACA
, http://www.100md.com
38
F:ATTTTTAAATTGAGCTCTTTACTC
136
52
3.0
R:ACAGCAAACTGTTATTTTTCAT
37
F:CTGCAGGGTGAGCCTGGTCTGC
145
58
2.0
R:AAGCTTCTGGGAATCCAGGAAGG
, 百拇医药
36
F:AATATTATATATCACATATTTTC
198
52
3.0
R:ATGTGCCTAAAACTATATGCC
35
F:ACCAATTTGACCTTTCTA
134
52
3.0
R:TATTTGGAAGATTTTCAT
, 百拇医药
34
F:ACTTGCCTCTTCTACTCA
146
45
2.5
R:ATGGCCTATTCACACTTAC
33
F:ATATTGTGTTTTCACACACTTTG
210
45
2.0
R:AATATTCATAAATAAATTCATTCACT
, 百拇医药
32
F:AATAGTTTTCTGGTTGACATC
250
48
3.0
R:TATTCTGTACTGACATAAAGC
31
F:ATTGATATTGTATTAACT
208
45
3.0
R:GAAAACTTTAAACAAATT
, 百拇医药
30
F:ACTGTATTTATTTCTTAA
154
45
2.5
R:CACATTTACTCTAATCTTAC
29
F:GTGTTTTGTCATGTGTATGCTC
200
45
2.5
R:TGAGATGCAGTGACAGCCTC
, 百拇医药
28
F:TTTGGTGGTTAAAAAATGAC
161
42
2.5
R:GAGAAGGAATAAAGAAAAATG
27
F:CTTTCAATAACTGCTGTTTCTCC
156
40
3.0
R:TGCCTGCTACCCATTCCAAC
, 百拇医药
26
F:TTTACCATTGATTTACTCTTGC
150
52
2.5
R:AGTTACTTTGAAATAAATTCCTC
25
F:ATATGTTTCTGTATTAAAC
226
40
3.0
R:TAAAACAAAACACAGTAAAC
, 百拇医药
24
F:TTTTTTTCCTTACTCATTTC
236
40
3.0
R:CAAAAATATCAAACCAACTC
23
F:GTTTGTGTGTGTGTGTGTTAG
125
42
2.5
R:CTTCTTTTTGTTTTATAATATACT
, 百拇医药
22
F:TGTTATTATGATTTCACTAG
142
52
2.5
R:TTAGAAGGTTACCCTGAGGC
21
F:GCTATCCTTTCTTTATCTTAC
133
52
2.5
R:AATGAATATGTTTGGAGATC
, 百拇医药
20
F:GATGAAATCATTTTGATCAC
235
52
3.0
R:CTTAATAGGAGAAAAATATAGC
注：F：上游引物；R下游引物突变性质并分析其可能的特点。
对象和方法
一、研究对象
1995～1998年在我院门诊及住院患者中，经临床表现、肾活组织电镜病理检查及(或)皮肤基底膜Ⅳ型胶原α链免疫荧光学检查、以及家族史调查而确诊的Alport综合征患者18例，其中男性12例，女性6例，平均年龄11岁(2.5～28岁)，其中2～14岁患者12例。家系调查均符合X连锁显性遗传型。正常对照4例，均无肾脏病表现及家族史，作为实验中的方法对照。
, http://www.100md.com
二、研究方法
1.取上述患者及部分患者父母及兄弟姐妹的外周血10 ml，枸橼酸钾抗凝，按盐析法[9]提取基因组DNA，4℃保存。同法提取正常对照的DNA。
2.根据已报道的COL4A5基因序列[10]，选取与外显子相邻的内含子序列设计引物(表1)，迄今所扩增的序列为COL4A5基因的第20～51外显子(自5′端记数)，引物由Genosys Biotechnologies，Inc.及Cybersyn公司合成。
3.PCR反应：在50 μl反应体积中，加入0.4～0.8 μg基因组DNA为模板，引物为1 μmol/L,dNTPs各为400 μmol/L，Taq酶(Promega公司)1～2.5 U。前5个循环为94℃变性1分钟，退火温度分别为68℃、66℃、64℃、62℃、60℃，时间30秒，延伸温度72℃、45秒。随后30个循环为：94℃、1分钟，退火温度见表1，时间30秒，延伸72℃，45秒(PCR热循环仪，Perkin-Elmer公司)。PCR完成后作1.6%～2%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物。
, 百拇医药
4.单链构象多态性(SSCP)分析：以含5%～10%甘油的10%聚丙烯酰胺凝胶制备20 cm×20 cm×0.1 cm胶板。取3 μl PCR产物，与甲酰胺上样液7 μl混合，96℃或100℃变性5～10分钟，迅速置入冰浴后上样，于4℃，120～160 V恒压电泳12～16小时。电泳完成后作硝酸银染色。
5.PCR产物直接测序：对SSCP分析出现单链DNA迁移率异常者，将PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后进行直接测序(北京医科大学肿瘤防治研究所及Cybersyn公司)。
结果
一、琼脂糖凝胶电泳结果
患者及正常对照的各外显子PCR反应产物均为单一区带，其大小与已知序列相一致。各PCR产物长度见表1。
二、SSCP及DNA测序结果
, 百拇医药
1.患者8第20外显子PCR产物的单链DNA迁移率与对照及其他患者有差异，测序证明为COL4A5基因的第1517C及1518C碱基缺失，导致移码突变，并使终止密码子TAG于1542位提前出现，α 5链长度由正常的1 685个氨基酸残基截短为439个氨基酸残基(图1)。
*表示患者8缺失的碱基
图1 患者8COL4A5基因第20外显子PCR
产物直接测序结果
该患者的COL4A5基因第46外显子及第39外显子的PCR产物的单链DNA迁移率与正常对照及其他患者有差异，DNA测序显示其COL4A5基因的46外显子的4477位碱基C置换为T，密码子由GAC转为GAT，均编码天冬氨酸，为同义突变。第39外显子的3715位碱基A置换为G，使第1171位密码子由CAA转为CAG，均编码谷氨酰胺，亦为同义突变。
, 百拇医药
将患者8及其父母的第20、39及46外显子的PCR产物同时作SSCP分析，其父仅有正常迁移带，其母兼有正常及异常迁移带(图2)。
C，正常对照；5、6、8，AS患者；M，患者8之母；F，患者8之父
图2 患者8及其父母COL4A5基因第46外显子PCR扩增产物SSCP分析
2.患者90的COL4A5基因第26外显子PCR产物的单链DNA迁移率与对照及其他患者有差异，DNA测序证明为COL4A5基因第2171位C碱基缺失，导致移码突变，并于2178位提前出现终止密码子TAA，使α 5链长度截短为659个氨基酸残基(图3，4)。
, 百拇医药 M，DNA分子量标准；C，正常对照；1、23、90、94、97，AS患者；Fa，患者8之父
图3 患者90COL4A5基因第26外显子PCR扩增产物SSCP分析
*表示患者90缺失的碱基
图4 患者90COL4A5基因第26外显子PCR扩增产物直接测序结果
讨论 近些年来，国外已对AS的临床、病理和分子生物学进行了大量的研究。欧美及日本等已先后证明了200余例XD型AS患者的COL4A5基因存在突变。但该基因的突变多种多样，可呈片段缺失、插入、点突变等，未发现AS患者COL4A5基因存在“热点”突变。另外，目前尚不明确AS中COL4A5基因突变是否存在人种间或地域的差异，因此亟待检测并分析来自不同种族、地区的AS患者的COL4A5基因，以确定突变性质及其特点，这不但有利于患者及其家系的遗传咨询和产前诊断，也有益于通过致病基因探索基因功能的工作。
, 百拇医药
COL4A5基因定位于Xq22，基因全长250kb，含51个外显子[10]。基因编码的α 5(Ⅳ)链含1 685个氨基酸残基，包括氨基端、中间由甘氨酸-X-Y 的三联结构反复串联而成的胶原区及羧基端非胶原区(NC1区)，其中NC1区对启动Ⅳ型胶原三股螺旋结构的形成有重要的作用[1]，故本研究选择了从该基因3’端开始进行基因突变的检测。在18例AS患者的COL4A5基因的3’端已检测的32个外显子中，发现了2例共4个位点的突变。
患者8为COL4A5基因第20外显子部位的缺失突变，导致终止密码子提前出现，肽链长度仅为正常的三分之一。患者90第26外显子的突变亦使肽链明显截短。此2例AS患者的COL4A5基因突变均使α 5(Ⅳ)链结构的部分胶原区及全部NC1区不能合成，必将导致Ⅳ型胶原分子的三股螺旋结构无法形成，而且截短的α 5链也容易被蛋白水解酶降解，故基底膜结构将发生严重缺陷。
根据患者8及其父母的PCR产物的SSCP分析结果，结合患者家族史，可以推定其母为COL4A5基因的杂合子，也进一步确定了该家系为X连锁显性遗传型AS。因此，用PCR-SSCP方法检出先证者后，便可在其家族成员中检测该外显子，以确定其他的患者及携带者，另外，亦可根据DNA测序的结果设计探针，在携带者怀孕时取羊水进行产前诊断。由此可见，对AS患者进行基因分析为该家系的遗传和生育咨询打下了基础。
, 百拇医药
患者8的COL4A5基因于第46及39外显子出现两个同义突变。因同义突变编码的氨基酸相同，故一般认为没有病理意义。同义突变可能是基因多态性的一种表现，但还需在人群中对更多的正常人进行检测。另外，仅在日本文献中报道过在第20 外显子发现错义突变而同时伴有第46外显子的同义突变的病例，是否提示这种突变形式可能为亚裔AS患者的特点之一，有待对更多患者作进一步的研究。
国外文献报道的COL4A5的基因突变中，约有8%～10%为大片段的基因缺失或重组突变，而我们的检测中未发现此种突变，可能提示为我国AS基因突变的特点，但尚需完成全基因的检测分析。
我们应用PCR-SSCP分析方法对中国18例AS患者的COL4A5基因进行了检测，至目前已检测了该基因3′端的32个外显子，发现2个缺失突变，2个同义突变。COL4A5基因其余外显子的检测工作仍在继续进行中。
本课题由国家自然科学基金资助(编号：39770780)
, http://www.100md.com
参考文献
1 Kashtan CE,Michael AF.Alport syndrome.Kidney Int,1996,50: 1445-1463.
2 Gubler M,Levy,M Broyer M,et al.Alport′s syndrome: a report of 58 cases and a review of the literature.Am J Med ,1981,70:493-505.
3 Wester DC,Atkin CL,Gregory MC.Alport syndrome: clinical update.J Am Acad Audiol,1995,6:73-79.
4 Kashtan CE,Sibley RK,Michael AF,et al.Hereditary nephritis: Alport syndrome and thin glomerular basement membrane disease.In: Tisher CC,Brenner BM,eds.Renal Pathology.Philadephia: J B Lippincott,1994.1239-1267.
, http://www.100md.com
5 Nakanishi K,Yoshikawa N,Iijima K,et al.Immunohistochemical study of α1-5 chains of type IV collagen in hereditary nephritis.Kidney Int,1994,46:1413-1421.
6 Heiskari N,Zhang X,Zhou J,et al.Identification of 17 mutations in ten exons in the COL4A5 collagen gene,but no mutations found in four exons in COL4A6: a study of 250 patients with hematuria and suspected of having Alport syndrome.J Am Soc Nephrol,1996,7:702-709.
7 Renieri A,Bruttini M,Galli L,et al.X-linked Alport syndrome: an SSCP-based mutation survey over all 51 exons of the COL4A5 gene.Am J Hum Genet,1996,58:1192-1204.
, 百拇医药
8 Kawai S,Nomura S,Harano T,et al.The COL4A5 gene in Japanese Alport syndrome patients: spectrum of mutions of all exons.Kidney Int,1996,49: 814-822.
9 Miller SA,Dykes DD,Polesky HF.A simple salting out precedure for entracting DNA from human nucleated cells.Nucleic Acids Res,1988,16:1215.
10 Zhou J,Leinonen A,Tryggvason K.Structure of human type IV collagen COL4A5 gene.J Bio Chem,1994,269:6608-6614.
(收稿：1998-10-30 修回：1999-05-04), 百拇医药