空肠弯曲菌诱发实验性周围神经病的免疫学机理的研究
作者：朱春霓 蔡方成 张晓萍
单位：400014 重庆医科大学附属儿童医院
关键词：弯曲杆菌；空肠；大鼠；周围神经系统疾病
中华儿科杂志990906 【摘要】 目的 研究空肠弯曲菌(Cj)诱发实验性周围神经病的可能性和免疫学机理。方法 取经两株空肠弯曲菌反复亚临床感染的、经多种丝裂原刺激的大鼠外周血单个核细胞(PBMC)上清液和新鲜血清,以未感染鼠PBMC上清液及血清作对照，分别对185只其他大鼠进行神经外膜下或静脉注射。7或14天后取坐骨神经行组织学检查。结果 病变的神经原纤维呈典型的轴索变性和(或)髓鞘脱失改变, 伴巨噬细胞和淋巴细胞浸润；经神经外膜下注射者，42.5%神经原纤维病变,其中80.8%为轴索变性，对照组仅3.1%原纤维损害(P<0.01)；经静脉注射者, 19.9%神经原纤维病变,轴索变性和髓鞘脱失分别占25.4%和74.6%, 对照组无任何病变(0/480)；两种菌型均显示相似的致病力。静脉注射PBMC上清液并不同时引起肝、肾和脑病变。经Cj感染的大鼠的PBMC上清液IgG含量明显增加。结论 以Cj反复亚临床感染大鼠的上清液和血清进行神经外膜下或静脉注射，均诱发周围神经病，并对周围神经组织有免疫学特异性。细胞和体液免疫皆参与其致病过程。
, 百拇医药
Experimental peripheral neuropathy induced by Campylobacter jejuni infection
ZHU Chunni, CAI Fangcheng, ZHANG Xiaoping.
Children′s Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400014
【Abstract】 Objective To induce experimental peripheral neuropathy by immunoreaction after Campylobacter jejuni (Cj) infection and explore their immune pathogenesis. Methods PBMCs were taken from 21 Wistar rats that had been repeatedly injected with suspension of two Cj strains intraperitoneally. The supernatants or fresh sera of the infected rats or control group were respectively injected perineurally and intravenously to totally 185 other rats (experimental group), and sacrificed on the 7th day after perineural injection and the 14th day after intravenous injection. Histological examination of the sciatic nerves was performed microscopically and electron-microscopically. Results Typical axonal degeneration and demyelination were seen in most fibers with remarkable macrophage and lymphocyte infiltration in some severe damaged fascicles. Pathological changes were identified in 42.5% teasing fibers after perineural injection. Among them, 80.8% fibers had axonal degeneration, but in control group, only 3.1% of fibers were found damaged (P<0.01). Pathological changes were found in 19.9% fibers after intravenous injection of PBMC supernatant, including 25.4% axonal degenerating and 74.6% demyelinating fibers. No abnormality was found in control group. Their livers, kidneys and brains of 10 rats were still normal although there were typical experimental neuropathies after intravenous injection of PBMC supernatant. Conclusion Experimental neuropathy was successfully induced by immunoreaction after Cj infection. Both cellular and humoral immunological pathogenesis were involved. Immune specificity to peripheral nerves was well shown in the pathogenic process. Axonal degeneration was much more often seen in the group injected with the PBMC supernatant perineurally than intravenously, indicating that local increase of pressure inside fascicles after perineurial injection probably plays a role in the pathogenesis of axonal degeneration.
, 百拇医药
【Key words】 Campylobacter jejuni Rats Peripheral nervous system diseases
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni, Cj)是人类腹泻病的重要病原。近年的流行病学研究表明它还与我国部分格林-巴利综合征(Guillian-Barré syndrome, GBS)有关，但始终缺少两者关系的直接证据，更难对其致病机理作出确切说明。我们以Cj感染后大鼠外周血单个核细胞(peripheral blood mono nuclear cell,PBMC)培养上清液和血清进行静脉及坐骨神经外膜下(简称外膜下)注射, 以探讨免疫学方法诱发Cj感染后实验性周围神经病的可能性及致病机理。
材料和方法
一、材料
1. Cj混悬液配制：选用Cj-131(PEN43)和Cj-X两菌株,前者由上海市卫生防疫站提供。后者从本院1996年夏季一急性腹泻患儿粪便中分离，经形态学和生物学方法确认[1]，马尿酸水解试验阳性。将复苏后的Cj接种于Camp-BAP培养基，置微氧气缸42℃培养24小时，无菌生理盐水洗下菌苔, 4 000 r/min离心30分钟，生理盐水洗涤沉淀物2次，弃上清液，用无菌生理盐水配制成109/ml的细菌混悬液。
, http://www.100md.com
2. Cj反复感染大鼠PBMC的制备:选健康成年Wistar鼠26只作为PBMC供鼠, 体重232～310 g(重庆医科大学动物实验中心提供)。将其随机分为Cj-131组(10只)、Cj-X组(11只)和对照组(5只)。分别对三组动物腹腔内注入Cj-131、Cj-X细菌悬液和无菌生理盐水1 ml，每周1次，连续5周。然后经颈静脉取血3 ml，肝素抗凝。常规方法分离单个核细胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液将细胞浓度调至5×106/ml, 分为3管, 分别加入植物血凝素(PHA,广州医药工业研究所)、细菌脂多糖(LPS,Sigma)和美洲商陆(PWM,Sigma)。终浓度分别为100、5和3 μg/ml。37℃、5%CO2孵箱培养24小时后收集经PHA和LPS诱导的PBMC培养液；10天后收集PWM的培养液。无菌离心收集上清液，保存于-70℃，同时将各上清液接种于Camp-BAP培养基，微氧培养，证实无污染的可能性。
分别以Cj-131和Cj-X反复感染后的大鼠血清与两菌株悬液作细菌凝集试验，未见交叉凝集现象。
, http://www.100md.com
二、实验性周围神经病的诱发
1. 感染后大鼠PBMC培养上清液诱发周围神经病：(1) 经外膜下注射诱发：另选120只体重252～365 g的健康Wistar成年鼠为实验鼠。戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉后暴露鼠坐骨神经，在解剖显微镜下，经神经外膜下分别注入经Cj反复感染大鼠的PBMC上清液40 μl，并根据提供PBMC大鼠受感染菌种，进一步将此120只实验鼠分为：①Cj-131组46只，分别注入经PHA(20只)、LPS (20只)或PWM (6只)孵育的PBMC上清液；② Cj-X组50 只，分别注入上述3种丝裂原孵育的PBMC上清液，各有22、22 和6只 ；③对照组24只，注入无Cj感染鼠的PBMC上清液，各有10、10、和4只。(2)经静脉注射诱发：再选49只体重257～344克鼠，同样分成Cj-131(18只)、Cj-X(19只)和对照(12只)3组，分别经静脉注入经上述3种丝裂原培养的PBMC上清液10-2 ml/g体重。Cj-131组各有8、8和2只鼠，分别注入经PHA、LPS和PWM孵育的上清液；Cj-X组各有8、8和3只鼠；对照组各有5、5和2只。
, http://www.100md.com
2. 感染后大鼠血清诱发周围神经病：按上述方法分别以不同剂量Cj-131、Cj-X感染后和对照组的大鼠新鲜血清做实验大鼠外膜下注射：(1) Cj-131组及对照组: Cj-131感染鼠新鲜血清30 μl加健康鼠新鲜血清10 μl注入8只大鼠的一侧坐骨神经外膜下。另一侧注入40 μl正常血清作为对照。(2)Cj-X组及对照组：另选8只鼠，方法与(1)相同。
三、 组织学检查
将外膜下注射后7天、静脉注射后14天的大鼠以及Cj反复性感染的大鼠分别以多聚甲醛及戊二醛灌流固定。取坐骨神经、腰骶段脊神经节、脊神经根做半薄( 0.5 μm)和超薄(0.2 μm)切片，进行光镜及电镜观察。坐骨神经做原纤维分离。另取上述实验和对照鼠的肝、肾及大脑做常规石蜡包埋切片，镜下观察有无病理改变。
四、 PWM诱导的PBMC上清液IgG测定
, 百拇医药 采用ELISA法测定。羊抗鼠IgG购自北京天象人生物医学公司。
五、 统计学处理
均数比较用单因素方差分析和q检验。百分率作卡方检验。
结果
一、Cj感染大鼠的PBMC上清液对周围神经致病作用
1.经外膜下注射诱发的改变：原纤维分离结果示，3种丝裂原诱导的大鼠PBMC上清液外膜下注射后均导致轴索变性和 (或 )轻度髓鞘脱失,以轴索变性最突出 (表1)。两组Cj感染的轴索变性纤维总发生率(658/1 920，34.2%)和脱髓鞘纤维的总发生率(158/1 920,8.2%)与对照组(15/480,3.1%)比较差异均有非常显著意义(χ2=389、184.6 ，P均<0.01);Cj-131与Cj-X的病变纤维发生率组间差异无显著意义(χ2=0.36, P>0.05), 表明两菌株感染后有相似免疫学致病力。3种丝裂原中,又以PHA和PWM诱导的PBMC上清液病变原纤维发生率最高,两者间差异无显著意义(χ2=0.28, P>0.05)，但与LPS组比较,差异均有显著意义(χ2=49.3和52.9, P<0.01)。坐骨神经半薄切片表现与原纤维分离结果一致。光镜下原纤维数不同程度减少,或区域性严重丢失,散在或成群轴索变性,伴有继发性髓鞘塌陷,可见巨噬细胞和淋巴细胞浸润。有的切片见髓鞘异常菲薄, 符合脱髓鞘病理改变(图1，2)。
, 百拇医药
表1 不同丝裂原诱导的Cj感染大鼠的PBMC上清液外膜下注射致病变神经原纤维比较 丝裂原
种类
被检纤维数(条)
轴索变性纤维数(率%)
脱髓鞘纤维数(率%)
Cj-131
Cj-X
对照
Cj-131
Cj-X
对照
Cj-131
, http://www.100md.com
Cj-X
对照
PHA
400
440
200
170(42.5)*
244(55.5)*
0
0
60(13.6)
0
, http://www.100md.com LPS
400
440
200
148(37.0)*
127(28.9)*
10(5.0)
38( 9.5)
0
0
PWM
120
, http://www.100md.com 120
80
67(55.8)*
60(50.0)*
5(6.3)
20(16.7)
40(33.3)
0
合计
920
920
480
, 百拇医药
385(41.8)*
431(46.8)*
15(3.1)
58(6.3)
100(10.9)
0
注：各实验组病变纤维发生率与其相应对照组比较，* χ2=41.8～179.2，P<0.01；括号内数据为病变神经原纤维占被检原纤维的百分数
图1 经PHA刺激的CJ反复感染后大鼠PBMC上清液外膜下注射后的大鼠坐骨神经原纤维 示典型轴 索变性,髓鞘继发性串珠样皱缩崩解(锇酸染色 光镜 ×100)
, 百拇医药
图2 与图1同标本的神经原纤维半薄切片 可见大片原纤维丢失, 伴大量巨噬细胞浸润(↑)、残 留轴索变性原纤维(
) (甲苯胺蓝染色 光镜 ×400)
2.经静脉注射诱发的改变：实验鼠坐骨神经髓鞘脱失率为14.9%(220/1 480)，轴索变性率为5.1%(75/1 480)(表2)。两菌株间原纤维异常发生率差异无显著意义(χ2=3.19, P>0.05)。3种丝裂原中,PWM的致病力最强,但LPS诱导的PBMC上清液仅引起轴索变性。半薄切片镜下所见与外膜下注射者相似,并与原纤维分离镜下观察结果一致(图3，4 )。对照组无任何病变。脊神经节、脊神经根半薄切片镜下见显著轴索变性和(或)髓鞘脱失,尤以神经根更突出,且脊髓神经节,脊神经根病变发生率明显高于坐骨神经,提示本组实验性神经病以近端多见。
, 百拇医药
图3 经PWM刺激的CJ感染后大鼠PBMC上清液静脉注射后的大鼠坐骨神经原纤维 示节段性脱髓鞘 改变(锇酸染色 光镜 ×40)
图4 与图3同标本的神经原纤维半薄切片 可见大片原纤维丢失, 许多原纤维髓鞘异常菲薄(▲), 同时伴有轴索变性 () 和轴索丛状再生 (cluster)现象 (↑) (甲苯胺蓝染色 光镜 ×400)
表2 不同丝裂原诱导的Cj感染大鼠的PBMC上清液静脉注射致病变神经原纤维比较 丝裂原
种类
被检纤维数(条)
轴索变性纤维数(率%)
, 百拇医药
脱髓鞘纤维数(率%)
Cj-131
Cj-X
对照
Cj-131
Cj-X
对照
Cj-131
Cj-X
对照
PHA
320
320
, 百拇医药
200
86(26.9)*
89(27.8)*
0
80(25.0)
80(25.0)
0
LPS
320
320
200
20( 6.3)*
, http://www.100md.com
10( 3.1)*
0
0
80(25.0)
0
PWM
200
200
80
90(45.0)*
90(45.0)*
0
, 百拇医药
50(25.0)
66(33.3)
0
合计
840
840
480
196(23.3)*
189(22.5)*
0
130(15.5)*
226(26.9)*
, 百拇医药
0
注：各实验组病变纤维发生率与其相应对照组比较，* χ2=6.37～64.0，P<0.05；括号内数据为病变神经原纤维占被检原纤维的百分数
3.电镜观察结果：电镜下坐骨神经轴索空泡变性,髓鞘分层伴巨噬细胞、淋巴细胞浸润;神经节中神经元广泛变性,线粒体明显肿胀(图5，6)。
图5 神经原纤维电镜图 可见病变神经原纤维轴索变性 (↑) (铅、铀染色 电镜 ×10 000)
图6 神经原纤维电镜图 可见病变神经髓鞘分层(), 轴索 线粒体肿胀(↑) (铅、铀染色 电镜 ×10 000)
, 百拇医药
二、反复性Cj感染的大鼠血清对周围神经致病作用
1.经感染后大鼠血清外膜下注射后，致1/3以上的原纤维病变。原纤维分离结果示，Cj-131和Cj-X组的原纤维病变发生率各为35.0%(56/160)和39.4%(63/160),与对照组9.4%(30/320)比较差异均有非常显著意义(χ2=47.63，P均<0.01), Cj-131和Cj-X组间差异无显著意义(χ2=0.66，P>0.05)。
2.病变原纤维中以轴索变性发生率为高。Cj-131组的轴索变性与髓鞘脱失者分别占64%(36/56)和36%(20/56)；Cj-X组分别为68%(43/63)和32%(20/63)，而对照组的少数病变原纤维全部为轴索变性。半薄切片表现与原纤维分离结果一致。
三、Cj反复感染后PBMC供鼠的周围神经检查结果
, http://www.100md.com
经历两株Cj反复性感染的21只PBMC供鼠,除 4只的脊神经节和神经根内原纤维有程度不等的轴索变性外,全部坐骨神经和神经根、神经节镜下检查无异常。
四、PBMC供鼠和实验鼠的其他内脏检查
Cj反复感染的PBMC供鼠及经PBMC上清液静脉注射的58只实验鼠肝、肾、大脑组织学观察无任何异常。
五、PWM刺激下PBMC上清液IgG测定
经Cj-131和Cj-X反复感染后大鼠的PBMC上清液中IgG含量均明显升高，分别为(6.9±2.1) mg/L和(6.2±2.0) mg/L,与对照组[(3.0±1.2) mg/L]比较差异有非常显著意义(F=6.24,q=4.72和4.09，P<0.01)。
讨论
, http://www.100md.com
国内外已有较多Cj感染后并发GBS，尤其轴索型GBS，即急性运动轴索神经病(acute motor axonal neuropathy, AMAN)的报道[2，3]。但几乎都是流行病学和临床血清学资料。本组分别以Cj反复性感染大鼠PBMC增殖后上清液或感染后血清进行神经外膜下及静脉注射，虽然实验大鼠未出现肢体麻痹等类似GBS的临床表现，但组织学研究显示有典型的周围神经病变存在，证实Cj感染引发的免疫学反应对周围神经的特异性致病作用。静脉注射后近端较远端更多受累,与多数GBS患者临床表现相似。然而，经历连续5周Cj反复感染的PBMC供鼠，除极少数神经节、神经根内原纤维轴索变性外，镜下检查周围神经无异常；同时，PBMC培养后上清液微氧培养无Cj菌生长，均说明本组实验神经病不是由Cj感染本身直接造成。静脉注入PBMC培养上清液后，引起周围神经组织明显损伤，而肝、肾和大脑镜检却无异常，表明Cj反复感染大鼠的PBMC具有显著的免疫学组织特异性。日本学者Yuki等[4]已证实 Cj的脂多糖成分与周围神经的神经节苷脂GM1四糖末端分子结构相似并有交叉抗原性，本组Cj感染致敏的PBMC对坐骨神经所显示的特异性免疫损伤，进一步支持了Yuki等的上述发现。
, 百拇医药
3种丝裂原中，PHA刺激的上清液显示更严重组织学损害，提示细胞免疫的重要作用。我们同时对本地区14例AMAN患儿急性期PBMC进行类似孵育，其上清液不仅引起相似的实验性神经病，而且发现其中白细胞介素-2 (IL-2)、白细胞介素-6 (IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量显著增高，并与患儿血清含量变化一致[5]。LPS是诱导巨噬细胞产生TNF-α的有效刺激剂，无论静脉或神经外膜下注射，在其刺激下PBMC上清液均主要引起原纤维轴索变性，是否显示TNF-α在轴索变性中的特殊作用，尚待进一步证实。
本组PBMC培养液中IgG含量显著增高。由于PBMC取自Cj反复感染的大鼠，增高的IgG大多应为抗Cj抗体。基于Yuki等的前述发现，有理由相信体液免疫机制在本组实验性神经病中同样起着重要作用。我们曾用加入补体后的GBS患者血清作大鼠坐骨神经外膜下注射，较未加补体的血清引起更严重病变，提示有补体参与体液免疫损伤的可能性。
究竟什么原因导致GBS的不同病理类型？尚存不同意见。Powell等[6]从实验性过敏性神经病的研究认为，急性免疫反应可引起周围神经水肿，后者致神经束内压力骤增和原纤维缺血，以致在髓鞘脱失前已先发生了轴索变性。然而本组原纤维轴索变性的半薄切片中,仅9%(4/44)见到神经束内水肿。由此似难用免疫损伤后神经束内炎性水肿压迫来解释。然而，本实验中外膜下注射PBMC上清液后42.5%的原纤维发生病变，其中80.7%呈典型轴索变性。但以相同上清液作静脉注射时，却多数发生节段性髓鞘脱失。因此，是否因外膜下注射上清液本身会使神经束内局部压力增高，导致了更多的原纤维发生轴索变性。此外，Cj有多种血清型，日本学者从GBS患者粪便中分离出的Cj大多属PEN19[4,6,7]。国内石家庄地区从GBS患者分离到PEN4、5和19型[8]。本组Cj感染后大鼠血清对两株致病菌未显示交叉凝集反应，但在引起实验性周围神经病的致病力上却无显著性差异，说明存在多种血清型Cj引起相似周围神经病的可能性。究竟哪些Cj菌型与周围神经病关系密切，尚待各地作广泛调查。
, 百拇医药
本研究由国家自然科学基金资助(项目编号：397700783)
参考文献
1 冯仁丰,主编. 实用医学检验学. 上海： 上海科学技术出版社, 1996,716-717.
2 Rees JH, Soudain S, Gregon NA. Campylobacter jejuni infection and Guillain-Barré syndrome. N Eng J Med, 1993,333:1374-1379.
3 Ho TW, Mishu B, Li CY, et al. Guillain-Barré syndrome in nothern China relationship to campylobacter jejuni infection and anti-glycolipid antibodies.Brain, 1995,118:597-605.
, 百拇医药
4 Yuki N, yoshino H, Sato S, et al. Acute axonal polyneuropathy associated with anti GM1 antibodies following campylobacter enteritis. Neurology, 1990,40:1900-1902.
5 吴梅，蔡方成. 不同类型格林-巴利综合征单个核细胞特异性免疫活性的临床与实验研究. 中华儿科杂志, 1998, 36:453-456.
6 Powell HC, Myers RR, Mizisin AP, et al.Reesponse of the axon and barrier endothelium in experimental autoimmune neuritis induced by autoreactive T cell lines. Acta Neuropathol,1991,82:364-387.
7 Fujimoto S, Yuki N, ltoh T, et al. Specific serotype of campylobacter jejuni associated with Guillain-Barrè syndrome. J Infect Dis, 1992,165:183-188.
8 李春岩, 刘瑞春, 王桂荣, 等. 空肠弯曲菌与急性运动性轴索型格林-巴利综合征. 中华神经科杂志, 1996,29:230-232.
(收稿：1998-08-10 修回：1999-06-10), 百拇医药
单位：400014 重庆医科大学附属儿童医院
关键词：弯曲杆菌；空肠；大鼠；周围神经系统疾病
中华儿科杂志990906 【摘要】 目的 研究空肠弯曲菌(Cj)诱发实验性周围神经病的可能性和免疫学机理。方法 取经两株空肠弯曲菌反复亚临床感染的、经多种丝裂原刺激的大鼠外周血单个核细胞(PBMC)上清液和新鲜血清,以未感染鼠PBMC上清液及血清作对照，分别对185只其他大鼠进行神经外膜下或静脉注射。7或14天后取坐骨神经行组织学检查。结果 病变的神经原纤维呈典型的轴索变性和(或)髓鞘脱失改变, 伴巨噬细胞和淋巴细胞浸润；经神经外膜下注射者，42.5%神经原纤维病变,其中80.8%为轴索变性，对照组仅3.1%原纤维损害(P<0.01)；经静脉注射者, 19.9%神经原纤维病变,轴索变性和髓鞘脱失分别占25.4%和74.6%, 对照组无任何病变(0/480)；两种菌型均显示相似的致病力。静脉注射PBMC上清液并不同时引起肝、肾和脑病变。经Cj感染的大鼠的PBMC上清液IgG含量明显增加。结论 以Cj反复亚临床感染大鼠的上清液和血清进行神经外膜下或静脉注射，均诱发周围神经病，并对周围神经组织有免疫学特异性。细胞和体液免疫皆参与其致病过程。
, 百拇医药
Experimental peripheral neuropathy induced by Campylobacter jejuni infection
ZHU Chunni, CAI Fangcheng, ZHANG Xiaoping.
Children′s Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400014
【Abstract】 Objective To induce experimental peripheral neuropathy by immunoreaction after Campylobacter jejuni (Cj) infection and explore their immune pathogenesis. Methods PBMCs were taken from 21 Wistar rats that had been repeatedly injected with suspension of two Cj strains intraperitoneally. The supernatants or fresh sera of the infected rats or control group were respectively injected perineurally and intravenously to totally 185 other rats (experimental group), and sacrificed on the 7th day after perineural injection and the 14th day after intravenous injection. Histological examination of the sciatic nerves was performed microscopically and electron-microscopically. Results Typical axonal degeneration and demyelination were seen in most fibers with remarkable macrophage and lymphocyte infiltration in some severe damaged fascicles. Pathological changes were identified in 42.5% teasing fibers after perineural injection. Among them, 80.8% fibers had axonal degeneration, but in control group, only 3.1% of fibers were found damaged (P<0.01). Pathological changes were found in 19.9% fibers after intravenous injection of PBMC supernatant, including 25.4% axonal degenerating and 74.6% demyelinating fibers. No abnormality was found in control group. Their livers, kidneys and brains of 10 rats were still normal although there were typical experimental neuropathies after intravenous injection of PBMC supernatant. Conclusion Experimental neuropathy was successfully induced by immunoreaction after Cj infection. Both cellular and humoral immunological pathogenesis were involved. Immune specificity to peripheral nerves was well shown in the pathogenic process. Axonal degeneration was much more often seen in the group injected with the PBMC supernatant perineurally than intravenously, indicating that local increase of pressure inside fascicles after perineurial injection probably plays a role in the pathogenesis of axonal degeneration.
, 百拇医药
【Key words】 Campylobacter jejuni Rats Peripheral nervous system diseases
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni, Cj)是人类腹泻病的重要病原。近年的流行病学研究表明它还与我国部分格林-巴利综合征(Guillian-Barré syndrome, GBS)有关，但始终缺少两者关系的直接证据，更难对其致病机理作出确切说明。我们以Cj感染后大鼠外周血单个核细胞(peripheral blood mono nuclear cell,PBMC)培养上清液和血清进行静脉及坐骨神经外膜下(简称外膜下)注射, 以探讨免疫学方法诱发Cj感染后实验性周围神经病的可能性及致病机理。
材料和方法
一、材料
1. Cj混悬液配制：选用Cj-131(PEN43)和Cj-X两菌株,前者由上海市卫生防疫站提供。后者从本院1996年夏季一急性腹泻患儿粪便中分离，经形态学和生物学方法确认[1]，马尿酸水解试验阳性。将复苏后的Cj接种于Camp-BAP培养基，置微氧气缸42℃培养24小时，无菌生理盐水洗下菌苔, 4 000 r/min离心30分钟，生理盐水洗涤沉淀物2次，弃上清液，用无菌生理盐水配制成109/ml的细菌混悬液。
, http://www.100md.com
2. Cj反复感染大鼠PBMC的制备:选健康成年Wistar鼠26只作为PBMC供鼠, 体重232～310 g(重庆医科大学动物实验中心提供)。将其随机分为Cj-131组(10只)、Cj-X组(11只)和对照组(5只)。分别对三组动物腹腔内注入Cj-131、Cj-X细菌悬液和无菌生理盐水1 ml，每周1次，连续5周。然后经颈静脉取血3 ml，肝素抗凝。常规方法分离单个核细胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液将细胞浓度调至5×106/ml, 分为3管, 分别加入植物血凝素(PHA,广州医药工业研究所)、细菌脂多糖(LPS,Sigma)和美洲商陆(PWM,Sigma)。终浓度分别为100、5和3 μg/ml。37℃、5%CO2孵箱培养24小时后收集经PHA和LPS诱导的PBMC培养液；10天后收集PWM的培养液。无菌离心收集上清液，保存于-70℃，同时将各上清液接种于Camp-BAP培养基，微氧培养，证实无污染的可能性。
分别以Cj-131和Cj-X反复感染后的大鼠血清与两菌株悬液作细菌凝集试验，未见交叉凝集现象。
, http://www.100md.com
二、实验性周围神经病的诱发
1. 感染后大鼠PBMC培养上清液诱发周围神经病：(1) 经外膜下注射诱发：另选120只体重252～365 g的健康Wistar成年鼠为实验鼠。戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉后暴露鼠坐骨神经，在解剖显微镜下，经神经外膜下分别注入经Cj反复感染大鼠的PBMC上清液40 μl，并根据提供PBMC大鼠受感染菌种，进一步将此120只实验鼠分为：①Cj-131组46只，分别注入经PHA(20只)、LPS (20只)或PWM (6只)孵育的PBMC上清液；② Cj-X组50 只，分别注入上述3种丝裂原孵育的PBMC上清液，各有22、22 和6只 ；③对照组24只，注入无Cj感染鼠的PBMC上清液，各有10、10、和4只。(2)经静脉注射诱发：再选49只体重257～344克鼠，同样分成Cj-131(18只)、Cj-X(19只)和对照(12只)3组，分别经静脉注入经上述3种丝裂原培养的PBMC上清液10-2 ml/g体重。Cj-131组各有8、8和2只鼠，分别注入经PHA、LPS和PWM孵育的上清液；Cj-X组各有8、8和3只鼠；对照组各有5、5和2只。
, http://www.100md.com
2. 感染后大鼠血清诱发周围神经病：按上述方法分别以不同剂量Cj-131、Cj-X感染后和对照组的大鼠新鲜血清做实验大鼠外膜下注射：(1) Cj-131组及对照组: Cj-131感染鼠新鲜血清30 μl加健康鼠新鲜血清10 μl注入8只大鼠的一侧坐骨神经外膜下。另一侧注入40 μl正常血清作为对照。(2)Cj-X组及对照组：另选8只鼠，方法与(1)相同。
三、 组织学检查
将外膜下注射后7天、静脉注射后14天的大鼠以及Cj反复性感染的大鼠分别以多聚甲醛及戊二醛灌流固定。取坐骨神经、腰骶段脊神经节、脊神经根做半薄( 0.5 μm)和超薄(0.2 μm)切片，进行光镜及电镜观察。坐骨神经做原纤维分离。另取上述实验和对照鼠的肝、肾及大脑做常规石蜡包埋切片，镜下观察有无病理改变。
四、 PWM诱导的PBMC上清液IgG测定
, 百拇医药 采用ELISA法测定。羊抗鼠IgG购自北京天象人生物医学公司。
五、 统计学处理
均数比较用单因素方差分析和q检验。百分率作卡方检验。
结果
一、Cj感染大鼠的PBMC上清液对周围神经致病作用
1.经外膜下注射诱发的改变：原纤维分离结果示，3种丝裂原诱导的大鼠PBMC上清液外膜下注射后均导致轴索变性和 (或 )轻度髓鞘脱失,以轴索变性最突出 (表1)。两组Cj感染的轴索变性纤维总发生率(658/1 920，34.2%)和脱髓鞘纤维的总发生率(158/1 920,8.2%)与对照组(15/480,3.1%)比较差异均有非常显著意义(χ2=389、184.6 ，P均<0.01);Cj-131与Cj-X的病变纤维发生率组间差异无显著意义(χ2=0.36, P>0.05), 表明两菌株感染后有相似免疫学致病力。3种丝裂原中,又以PHA和PWM诱导的PBMC上清液病变原纤维发生率最高,两者间差异无显著意义(χ2=0.28, P>0.05)，但与LPS组比较,差异均有显著意义(χ2=49.3和52.9, P<0.01)。坐骨神经半薄切片表现与原纤维分离结果一致。光镜下原纤维数不同程度减少,或区域性严重丢失,散在或成群轴索变性,伴有继发性髓鞘塌陷,可见巨噬细胞和淋巴细胞浸润。有的切片见髓鞘异常菲薄, 符合脱髓鞘病理改变(图1，2)。
, 百拇医药
表1 不同丝裂原诱导的Cj感染大鼠的PBMC上清液外膜下注射致病变神经原纤维比较 丝裂原
种类
被检纤维数(条)
轴索变性纤维数(率%)
脱髓鞘纤维数(率%)
Cj-131
Cj-X
对照
Cj-131
Cj-X
对照
Cj-131
, http://www.100md.com
Cj-X
对照
PHA
400
440
200
170(42.5)*
244(55.5)*
0
0
60(13.6)
0
, http://www.100md.com LPS
400
440
200
148(37.0)*
127(28.9)*
10(5.0)
38( 9.5)
0
0
PWM
120
, http://www.100md.com 120
80
67(55.8)*
60(50.0)*
5(6.3)
20(16.7)
40(33.3)
0
合计
920
920
480
, 百拇医药
385(41.8)*
431(46.8)*
15(3.1)
58(6.3)
100(10.9)
0
注：各实验组病变纤维发生率与其相应对照组比较，* χ2=41.8～179.2，P<0.01；括号内数据为病变神经原纤维占被检原纤维的百分数
图1 经PHA刺激的CJ反复感染后大鼠PBMC上清液外膜下注射后的大鼠坐骨神经原纤维 示典型轴 索变性,髓鞘继发性串珠样皱缩崩解(锇酸染色 光镜 ×100)
, 百拇医药
图2 与图1同标本的神经原纤维半薄切片 可见大片原纤维丢失, 伴大量巨噬细胞浸润(↑)、残 留轴索变性原纤维(
) (甲苯胺蓝染色 光镜 ×400)2.经静脉注射诱发的改变：实验鼠坐骨神经髓鞘脱失率为14.9%(220/1 480)，轴索变性率为5.1%(75/1 480)(表2)。两菌株间原纤维异常发生率差异无显著意义(χ2=3.19, P>0.05)。3种丝裂原中,PWM的致病力最强,但LPS诱导的PBMC上清液仅引起轴索变性。半薄切片镜下所见与外膜下注射者相似,并与原纤维分离镜下观察结果一致(图3，4 )。对照组无任何病变。脊神经节、脊神经根半薄切片镜下见显著轴索变性和(或)髓鞘脱失,尤以神经根更突出,且脊髓神经节,脊神经根病变发生率明显高于坐骨神经,提示本组实验性神经病以近端多见。
, 百拇医药
图3 经PWM刺激的CJ感染后大鼠PBMC上清液静脉注射后的大鼠坐骨神经原纤维 示节段性脱髓鞘 改变(锇酸染色 光镜 ×40)
图4 与图3同标本的神经原纤维半薄切片 可见大片原纤维丢失, 许多原纤维髓鞘异常菲薄(▲), 同时伴有轴索变性 (
) 和轴索丛状再生 (cluster)现象 (↑) (甲苯胺蓝染色 光镜 ×400)表2 不同丝裂原诱导的Cj感染大鼠的PBMC上清液静脉注射致病变神经原纤维比较 丝裂原
种类
被检纤维数(条)
轴索变性纤维数(率%)
, 百拇医药
脱髓鞘纤维数(率%)
Cj-131
Cj-X
对照
Cj-131
Cj-X
对照
Cj-131
Cj-X
对照
PHA
320
320
, 百拇医药
200
86(26.9)*
89(27.8)*
0
80(25.0)
80(25.0)
0
LPS
320
320
200
20( 6.3)*
, http://www.100md.com
10( 3.1)*
0
0
80(25.0)
0
PWM
200
200
80
90(45.0)*
90(45.0)*
0
, 百拇医药
50(25.0)
66(33.3)
0
合计
840
840
480
196(23.3)*
189(22.5)*
0
130(15.5)*
226(26.9)*
, 百拇医药
0
注：各实验组病变纤维发生率与其相应对照组比较，* χ2=6.37～64.0，P<0.05；括号内数据为病变神经原纤维占被检原纤维的百分数
3.电镜观察结果：电镜下坐骨神经轴索空泡变性,髓鞘分层伴巨噬细胞、淋巴细胞浸润;神经节中神经元广泛变性,线粒体明显肿胀(图5，6)。
图5 神经原纤维电镜图 可见病变神经原纤维轴索变性 (↑) (铅、铀染色 电镜 ×10 000)
图6 神经原纤维电镜图 可见病变神经髓鞘分层(
), 轴索 线粒体肿胀(↑) (铅、铀染色 电镜 ×10 000), 百拇医药
二、反复性Cj感染的大鼠血清对周围神经致病作用
1.经感染后大鼠血清外膜下注射后，致1/3以上的原纤维病变。原纤维分离结果示，Cj-131和Cj-X组的原纤维病变发生率各为35.0%(56/160)和39.4%(63/160),与对照组9.4%(30/320)比较差异均有非常显著意义(χ2=47.63，P均<0.01), Cj-131和Cj-X组间差异无显著意义(χ2=0.66，P>0.05)。
2.病变原纤维中以轴索变性发生率为高。Cj-131组的轴索变性与髓鞘脱失者分别占64%(36/56)和36%(20/56)；Cj-X组分别为68%(43/63)和32%(20/63)，而对照组的少数病变原纤维全部为轴索变性。半薄切片表现与原纤维分离结果一致。
三、Cj反复感染后PBMC供鼠的周围神经检查结果
, http://www.100md.com
经历两株Cj反复性感染的21只PBMC供鼠,除 4只的脊神经节和神经根内原纤维有程度不等的轴索变性外,全部坐骨神经和神经根、神经节镜下检查无异常。
四、PBMC供鼠和实验鼠的其他内脏检查
Cj反复感染的PBMC供鼠及经PBMC上清液静脉注射的58只实验鼠肝、肾、大脑组织学观察无任何异常。
五、PWM刺激下PBMC上清液IgG测定
经Cj-131和Cj-X反复感染后大鼠的PBMC上清液中IgG含量均明显升高，分别为(6.9±2.1) mg/L和(6.2±2.0) mg/L,与对照组[(3.0±1.2) mg/L]比较差异有非常显著意义(F=6.24,q=4.72和4.09，P<0.01)。
讨论
, http://www.100md.com
国内外已有较多Cj感染后并发GBS，尤其轴索型GBS，即急性运动轴索神经病(acute motor axonal neuropathy, AMAN)的报道[2，3]。但几乎都是流行病学和临床血清学资料。本组分别以Cj反复性感染大鼠PBMC增殖后上清液或感染后血清进行神经外膜下及静脉注射，虽然实验大鼠未出现肢体麻痹等类似GBS的临床表现，但组织学研究显示有典型的周围神经病变存在，证实Cj感染引发的免疫学反应对周围神经的特异性致病作用。静脉注射后近端较远端更多受累,与多数GBS患者临床表现相似。然而，经历连续5周Cj反复感染的PBMC供鼠，除极少数神经节、神经根内原纤维轴索变性外，镜下检查周围神经无异常；同时，PBMC培养后上清液微氧培养无Cj菌生长，均说明本组实验神经病不是由Cj感染本身直接造成。静脉注入PBMC培养上清液后，引起周围神经组织明显损伤，而肝、肾和大脑镜检却无异常，表明Cj反复感染大鼠的PBMC具有显著的免疫学组织特异性。日本学者Yuki等[4]已证实 Cj的脂多糖成分与周围神经的神经节苷脂GM1四糖末端分子结构相似并有交叉抗原性，本组Cj感染致敏的PBMC对坐骨神经所显示的特异性免疫损伤，进一步支持了Yuki等的上述发现。
, 百拇医药
3种丝裂原中，PHA刺激的上清液显示更严重组织学损害，提示细胞免疫的重要作用。我们同时对本地区14例AMAN患儿急性期PBMC进行类似孵育，其上清液不仅引起相似的实验性神经病，而且发现其中白细胞介素-2 (IL-2)、白细胞介素-6 (IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量显著增高，并与患儿血清含量变化一致[5]。LPS是诱导巨噬细胞产生TNF-α的有效刺激剂，无论静脉或神经外膜下注射，在其刺激下PBMC上清液均主要引起原纤维轴索变性，是否显示TNF-α在轴索变性中的特殊作用，尚待进一步证实。
本组PBMC培养液中IgG含量显著增高。由于PBMC取自Cj反复感染的大鼠，增高的IgG大多应为抗Cj抗体。基于Yuki等的前述发现，有理由相信体液免疫机制在本组实验性神经病中同样起着重要作用。我们曾用加入补体后的GBS患者血清作大鼠坐骨神经外膜下注射，较未加补体的血清引起更严重病变，提示有补体参与体液免疫损伤的可能性。
究竟什么原因导致GBS的不同病理类型？尚存不同意见。Powell等[6]从实验性过敏性神经病的研究认为，急性免疫反应可引起周围神经水肿，后者致神经束内压力骤增和原纤维缺血，以致在髓鞘脱失前已先发生了轴索变性。然而本组原纤维轴索变性的半薄切片中,仅9%(4/44)见到神经束内水肿。由此似难用免疫损伤后神经束内炎性水肿压迫来解释。然而，本实验中外膜下注射PBMC上清液后42.5%的原纤维发生病变，其中80.7%呈典型轴索变性。但以相同上清液作静脉注射时，却多数发生节段性髓鞘脱失。因此，是否因外膜下注射上清液本身会使神经束内局部压力增高，导致了更多的原纤维发生轴索变性。此外，Cj有多种血清型，日本学者从GBS患者粪便中分离出的Cj大多属PEN19[4,6,7]。国内石家庄地区从GBS患者分离到PEN4、5和19型[8]。本组Cj感染后大鼠血清对两株致病菌未显示交叉凝集反应，但在引起实验性周围神经病的致病力上却无显著性差异，说明存在多种血清型Cj引起相似周围神经病的可能性。究竟哪些Cj菌型与周围神经病关系密切，尚待各地作广泛调查。
, 百拇医药
本研究由国家自然科学基金资助(项目编号：397700783)
参考文献
1 冯仁丰,主编. 实用医学检验学. 上海： 上海科学技术出版社, 1996,716-717.
2 Rees JH, Soudain S, Gregon NA. Campylobacter jejuni infection and Guillain-Barré syndrome. N Eng J Med, 1993,333:1374-1379.
3 Ho TW, Mishu B, Li CY, et al. Guillain-Barré syndrome in nothern China relationship to campylobacter jejuni infection and anti-glycolipid antibodies.Brain, 1995,118:597-605.
, 百拇医药
4 Yuki N, yoshino H, Sato S, et al. Acute axonal polyneuropathy associated with anti GM1 antibodies following campylobacter enteritis. Neurology, 1990,40:1900-1902.
5 吴梅，蔡方成. 不同类型格林-巴利综合征单个核细胞特异性免疫活性的临床与实验研究. 中华儿科杂志, 1998, 36:453-456.
6 Powell HC, Myers RR, Mizisin AP, et al.Reesponse of the axon and barrier endothelium in experimental autoimmune neuritis induced by autoreactive T cell lines. Acta Neuropathol,1991,82:364-387.
7 Fujimoto S, Yuki N, ltoh T, et al. Specific serotype of campylobacter jejuni associated with Guillain-Barrè syndrome. J Infect Dis, 1992,165:183-188.
8 李春岩, 刘瑞春, 王桂荣, 等. 空肠弯曲菌与急性运动性轴索型格林-巴利综合征. 中华神经科杂志, 1996,29:230-232.
(收稿：1998-08-10 修回：1999-06-10), 百拇医药