轮状病毒VP4全基因的序列分析及其在原核系统中的初步表达
作者：霍云雯 钱渊 李国华 肖玮
单位：100020 首都儿科研究所 北京市感染与免疫中心实验室
关键词：轮状病毒属；基因；结构；病毒；基因表达；序列分析
中华儿科杂志991110
【摘要】 目的 研究轮状病毒(RV)我国地方株VP4基因特点，并获得高效表达的VP4。方法 采用RT-PCR技术扩增RV P1A型我国地方株CR188的完整VP4基因，克隆到原核表达质粒pET21a(+)中：(1)用末端终止法进行核苷酸序列测定，并与人(HRV)标准株作比较分析。(2)重组质粒转化原核表达宿主菌E.coli BL21(DE3)，异丙硫半乳糖甙(IPTG)诱导表达，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot对其表达产物进行鉴定。结果 (1)CR188 VP4基因全长2359 bp，含编码775个氨基酸的单一的开放读码框架(ORF)，与相同血清型标准株之间氨基酸序列具有高度同源性(94%～98%)，与不同血清型标准株间相比较，则同源性较低(64%～78%)。(2)重组VP4表达量在诱导2～3小时时最高，占细胞总蛋白的11%；表达蛋白与小鼠抗A组RV VP4 P1A型特异性单克隆抗体(单抗)发生反应。结论 序列分析预测血清型的结果与临床标本的实验室诊断一致，CR188 VP4为P1A型；VP4全基因在原核系统中获得表达，表达的重组VP4抗原可被型特异性单抗识别。
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Sequence analysis and prokaryotic expression of full-length VP4 gene of rotavirus group A
HUO Yunwen，QIAN Yuan, LI Guohua, et al.
Capital Institute of Pediatrics, Beijing Municipal Laboratory of Infection and Immunity, Beijing 100020
【Abstract】 Objective To characterize VP4 gene of human rotavirus field strain in China and obtain highly-expressed VP4 protein. Methods Full-length VP4 gene of human rotavirus CR188 strain was amplified by RT-PCR and cloned into prokaryotic expression plasmid pET21a(+): (1) The VP4 gene was sequenced with terminal-termination method and compared with previously published strains. (2) The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced by isopropyl thiogalactoside (IPTG). The expressed protein was detected by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot.Results (1) The cloned VP4 gene was 2359 bp in length and had a long open reading frame (ORF) coding for 775 amino acids. Comparative analysis of the deduced amino acid sequences of VP4 indicates a high degree of homology among the same serotypes (94%-98%) and a low degree of homology among the various serotypes (64%-78%). (2) The maximal quantity of expressed protein was harvested at the hours 2-3 following induction and showed 11 % of expression level in the whole cell protein. Monoclonal antibodies against group A rotavirus VP4 could specifically recognize the expressed protein epitopes in Western blot assay. Conclusion Sequence analysis and laboratory diagnosis using clinical sample indicated consistently that the serotype of CR188 was P1A; The VP4 gene was highly expressed in prokaryotic system and with the same antigenicity of natural VP4.
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【Key words】 Rotavirus Genes, structural，viral Gene expression Sequence analysis
A组轮状病毒(RV)所致的胃肠炎在世界各地都有相当高的发病率，是引起婴幼儿重症腹泻的最重要病原[1]。RV结构蛋白VP4是刺激机体产生保护性抗体的主要抗原之一，本研究初步探讨了从临床粪便标本中检测到的RV VP4基因的一级结构特点，以及通过序列分析预测RV血清型别的方法，并且将地方株VP4完整基因在大肠杆菌中进行了表达。
材料和方法
一、标本来源
RV我国地方株CR188从北京地区一腹泻患儿粪便标本中检测到，Dot blot(点杂交)分析为P1A型。
二、质粒与主要试剂
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质粒pET21a(+)及其表达宿主菌E.coli BL21(DE3)为Novagen公司产品。各种限制性内切酶和修饰酶、Super ScriptTMⅡ逆转录酶、诱导剂IPTG均购自GIBCO-BRL公司。T7 DNA测序试剂盒购自上海Promega公司。引物由上海生工生物工程公司合成。Gene Clean Kit为原平公司产品。小鼠抗A组RV VP4 P1A型特异性单克隆抗体(单抗)由日本札幌大学医学院Koki Taniguchi博士惠赠。
三、方法
1. 病毒核酸提取及其VP4基因的RT-PCR扩增：从粪便标本中提取和纯化病毒核酸，以纯化的核酸为模板RT-PCR扩增VP4基因。PCR产物经Gene Clean Kit回收纯化，供克隆用。RT-PCR扩增引物根据P1A型标准株Wa VP4基因的末端保守序列设计，5′端1510和3′端1511两个引物的5′端均带有BamHⅠ酶切位点(GGATCC)。
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1510：5′-[CACGGATCCGGCTATAAAATGGCTTCA]-3′
1511：5′-[CACGGATCCGGTCACATCCTCAATAGC]-3′
2. 重组质粒pET21a(+)-VP4的构建：将RT-PCR扩增的完整VP4基因cDNA片段与质粒pET21a(+)连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA，用限制性内切酶酶切筛选和鉴定重组质粒pET21a(+)-VP4克隆。
3. 测序：参照T7 DNA测序试剂盒说明书进行末端终止法测序。测序中间所用引物根据已测序列设计。用Goldkey软件(军事医学科学院)进行核苷酸及氨基酸序列分析。
4. 诱导表达和样品制备： 将重组质粒pET21a(+)-VP4转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)， LB培养基扩增至A600值(曾称光密度OD)约0.6时，加入诱导剂异丙硫半乳糖甙(IPTG)，继续培养一定时间后收集细菌。离心收集菌体，预冷洗液洗涤后冰浴超声，取一部分为细胞总蛋白样品，剩下的样品4℃12000 r/min离心15分钟，上清为可溶性蛋白样品，沉淀为不可溶性蛋白样品。
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5. 表达产物的鉴定：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(5%浓缩胶，8%分离胶)完毕后，凝胶用Coomassie Blue染色，凝胶密度扫描仪(BIO-RAD Laboratories GS-700 Densitometer)分析。Western blot检测重组VP4的抗原特异性。
结果
一、VP4全基因的序列分析
克隆的CR188 VP4完整基因全长2359 bp，5′端有9个、3′端有25个非编码核苷酸，全基因含单一的ORF，编码775个氨基酸。与五个不同型别的标准株的氨基酸序列进行比较分析，显示我国地方株CR188 VP4氨基酸序列与标准株相似：(1)存在一些高变区如氨基酸73-204、578-608区等，这些高变区在P1A型间保守，在不同血清型间高度变异，高变区以外的区域在各型RV 间保守。(2)胰酶作用点240和246位的精氨酸完全保守，CR188与P1A型标准株Wa、KU在胰酶作用区氨基酸240-246完全同序：RSIQYKR，245位的赖氨酸构成潜在的另一胰酶作用点，可能和病毒毒力有关。(3)26个脯氨酸和4个半胱氨酸是保守的，唯独69M(P4型)序列中一个半胱氨酸残基出现在氨基酸203位，而非保守的216位。
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VP4全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较(表1)，结果表明：我们所测P1A型地方株CR188的VP4氨基酸序列与P1A型标准株非常接近(94%～98%)，与P1B型标准株较接近(91%)，不同型之间同源性较低(64%～78%)。
表1 RV 地方株CR188与标准株之间VP4基因核苷酸与氨基酸序列同源性(%) 标准株血清型
Wa
P1A
KU
P1A
DS-1
P1B
M37
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P2
K8
P3
69M
P4
核苷酸序列同源性
91
97
87
75
65
69
氨基酸序列同源性
, 百拇医药
94
98
91
78
64
71
二、表达产物的鉴定
制备的表达产物样品经SDS-PAGE、Coomassie Blue染色后的结果(图1)显示：细胞总蛋白样品和不溶性蛋白样品在预期位置(约88 000)均出现一条蛋白带，可溶性蛋白样品及对照各样品在此位置均无这条带，提示重组VP4主要以不溶性蛋白的形式表达。
1：蛋白标准分子量(high-range)；2：表达的细胞总蛋白；3：对照的细胞总蛋白；4：表达的不溶性蛋白；5: 对照的不溶性蛋白；6：表达的可溶性蛋白；7：对照的可溶性蛋白
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图1 CR188 VP4表达产物经SDS-PAGE和Coomassie Blue染色
在表达动态试验中，诱导后1个小时起，每隔1小时取500 μl样品，至表达6小时止，Coomassie Blue染色分析，重组VP4蛋白表达量并不和表达时间的延长呈正相关，诱导2～3小时时最高，用凝胶密度扫描仪分析，重组VP4蛋白的表达占细胞总蛋白的11%。
不溶性表达产物用抗A组RV P1A型特异性单抗进行Western blot分析(图2)显示，细胞总蛋白样品和不溶性蛋白样品在预期位置(约88000)出现着色浓重的条带，可溶性蛋白样品及对照各样品在此位置均无这条带，证实CR188 VP4获得了特异性表达。另外，细胞总蛋白样品和可溶性蛋白样品约在170000处、细胞总蛋白样品和不溶性蛋白样品在70000处分别出现一条着色较浅的条带。
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1：表达的可溶性蛋白；2：表达的不溶性蛋白；3：表达的细胞总蛋白；4：蛋白标准分子量(high-range)；5：对照的细胞总蛋白；6：对照的不溶性蛋白；7：对照的可溶性蛋白
图2 型特异性单抗YO-2C2对CR188 VP4表达蛋白的Western blot分析
讨论
A组RV引起的婴幼儿秋冬季腹泻占感染性腹泻的40 %以上，尤其在新生儿和婴幼儿中易引起重症腹泻乃至死亡。为防治小儿感染性腹泻，世界各国投入了大量人力和物力研究A组RV。随着分子生物学技术的进展，人们对RV结构与功能的了解更加深入，为临床病原学的诊断、疫苗的研制提供了重要的理论基础和指导。
一、序列分析预测RV血清型
根据结构蛋白VP4可以将RV分为11个型及4个亚型(P血清型)，我们以往的研究发现A组RV 在我国的流行以P1A型为主[2]。传统的RV血清学分型方法是，先做繁杂的人RV分离培养，再用空斑减少中和试验滴定组织培养中的病毒滴度。近年来，单抗EIA、Dot blot、PCR等实验室方法常用于临床的快速诊断，但一部分RV诊断阳性的标本分型不明。血清型别的分子基础是蛋白的氨基酸序列及其编码基因核苷酸序列的差异，因此通过序列分析的方法可以预测血清型，尤其是对Dot blot等方法不能分型的临床标本很有意义。文献报道，由VP4氨基酸序列同源性预测血清型的同型判断标准为同源性≥89%[3]，并进一步证明仅根据氨基酸84-180高变区序列的同源性即可判定[4，5]。在我们的工作中，CR188 VP4氨基酸序列与P1A型标准株之间序列同源性非常高(94%～98%)，与P2～P4型标准株之间序列同源性较低(64%～78%)；临床标本的Dot blot分型结果CR188为P1A型，证明序列分析预测血清型和实验室分型结果一致。而不同亚型间(P1A与P1B)序列同源性达91%，高于同型判断标准，提示同型中不同亚型较不同型之间关系更趋密切。
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二、表达的VP4制备免疫血清用于临床病原学诊断
以往用于临床病原学诊断的试剂，是从患儿的粪便标本中提纯病毒颗粒作抗原免疫动物制备免疫血清，其缺点在于不可避免的会受到粪便中其他成分的干扰，可能产生假阳性；再者，VP4仅占病毒毒粒蛋白的1.5%，免疫血清中抗VP4的成分甚微，效价较低。如果采用实验室表达的抗原性良好的VP4作抗原，因为其成分的高度单一，不会有假阳性的缺点，而且具有抗原背景资料齐全、制备方便、实验可重复性好等优点。对VP4的高效表达还有助于进行其多肽的功能性、抗原性和免疫原性的研究。本研究在原核系统中有效表达了地方株VP4完整基因，检测到重组VP4的特异表达，为进一步的研究工作打下基础。单抗YO-2C2的Western blot结果显示重组表达的VP4蛋白除预期约88 000的主要条带外，还有约170 000、70 000两条浅浅的蛋白带。约170 000的蛋白带可能是VP4蛋白的二聚体，主要以可溶性蛋白形式表达，或者是可溶性重组VP4蛋白结合宿主菌的某种蛋白成分而形成。约70 000的蛋白带推测与表达产物的降解有关，由于表达的融合蛋白氨基端和羧基端均为非天然末端，可能易被宿主菌内的某些酶降解。用三种抗A组RV VP4 P1A型特异性单抗检测重组表达的不溶性蛋白样品，单抗YO-2C2反应结果强阳性，并且100℃加热变性样品和37℃处理样品无差异；单抗KU6B11和YO-IS3的37℃处理样品反应结果阳性，100℃加热变性样品反应结果均为阴性。可能有些单抗(如YO-2C2)识别的抗原决定簇在氨基酸序列一级结构上是连续的，不受蛋白空间构型影响，变性后仍能和单抗反应；有些抗原决定簇却依赖蛋白的空间构型，变性后不再被相应单抗(如KU6B11、YO-IS3)识别。
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RV感染的主要流行型别为G1-G4型(G血清型以VP7为分型抗原)，都属于P1型。即如果以VP7为保护性抗原需要四价疫苗，但是如果以VP4为保护性抗原，用P1型单价疫苗就能达到预防目的[3]。VP4不需要糖基化和特殊的空间结构，有较多的交叉保护作用，有关的中和抗原决定簇相当稳定，原核及真核表达都具有良好的抗原性[6，7]，因此VP4的研究越来越受到重视和发展。迄今尚未见我国地方株VP4完整基因有效表达的报道，我们检测到重组VP4蛋白的特异表达，将有益于我国RV 毒株VP4型别的研究和RV感染性婴幼儿腹泻的防治工作。
资助项目：本课题由国家自然科学基金资助(基金编号：39570036)及北京市自然科学基金资助(基金编号：7951002)
参考文献
1 Kapikian AZ, Chanock RM. Rotaviruses. In: Fields, ed. Fields virology. 3rd ed. New York: Raven, 1996. 1657-1708.
, http://www.100md.com
2 袁丽娟，钱渊，刘军，等. 北京等我国四个地区婴幼儿腹泻RV VP4和VP7型别的研究. 病毒学报,1994,10:136-144.
3 Gorziglia M, Larralde G,Kapikian AZ, et al. Antigenic relationships among human rotaviruses as determined by outer capsid protein VP4. Proc Natl Acad Sci USA,1990,l87:7155-7159.
4 Larralde G, Li B, Kapikian AZ, et al. Serotype-specific epitope(s) present on the VP8 subunit of rotavirus VP4 protein. J Virol, 1991, 65: 3213-3218.
, 百拇医药
5 Larralde G, Gorziglia M. Distribution of conserved and specific epitopes on the VP8 subunit of rotavirus VP4. J Virol, 1992， 66: 7438-7443.
6 Redmond MJ, Ijaz MK, Parker MD, et al. Assembly of recombinant rotavirus proteins into virus-like particles and assessment of vaccine potential. Vaccine, 1993, 11: 273-281.
7 Mahajan NP, Durga RC. Nucleotide sequence and expression in E. coli of the complete P4 type VP4 from a G2 setotype human rotavirus. Arch Virol, 1996, 141:315-329.
收稿：1998-10-12
修回：1999-05-17, 百拇医药
单位：100020 首都儿科研究所 北京市感染与免疫中心实验室
关键词：轮状病毒属；基因；结构；病毒；基因表达；序列分析
中华儿科杂志991110
【摘要】 目的 研究轮状病毒(RV)我国地方株VP4基因特点，并获得高效表达的VP4。方法 采用RT-PCR技术扩增RV P1A型我国地方株CR188的完整VP4基因，克隆到原核表达质粒pET21a(+)中：(1)用末端终止法进行核苷酸序列测定，并与人(HRV)标准株作比较分析。(2)重组质粒转化原核表达宿主菌E.coli BL21(DE3)，异丙硫半乳糖甙(IPTG)诱导表达，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot对其表达产物进行鉴定。结果 (1)CR188 VP4基因全长2359 bp，含编码775个氨基酸的单一的开放读码框架(ORF)，与相同血清型标准株之间氨基酸序列具有高度同源性(94%～98%)，与不同血清型标准株间相比较，则同源性较低(64%～78%)。(2)重组VP4表达量在诱导2～3小时时最高，占细胞总蛋白的11%；表达蛋白与小鼠抗A组RV VP4 P1A型特异性单克隆抗体(单抗)发生反应。结论 序列分析预测血清型的结果与临床标本的实验室诊断一致，CR188 VP4为P1A型；VP4全基因在原核系统中获得表达，表达的重组VP4抗原可被型特异性单抗识别。
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Sequence analysis and prokaryotic expression of full-length VP4 gene of rotavirus group A
HUO Yunwen，QIAN Yuan, LI Guohua, et al.
Capital Institute of Pediatrics, Beijing Municipal Laboratory of Infection and Immunity, Beijing 100020
【Abstract】 Objective To characterize VP4 gene of human rotavirus field strain in China and obtain highly-expressed VP4 protein. Methods Full-length VP4 gene of human rotavirus CR188 strain was amplified by RT-PCR and cloned into prokaryotic expression plasmid pET21a(+): (1) The VP4 gene was sequenced with terminal-termination method and compared with previously published strains. (2) The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced by isopropyl thiogalactoside (IPTG). The expressed protein was detected by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot.Results (1) The cloned VP4 gene was 2359 bp in length and had a long open reading frame (ORF) coding for 775 amino acids. Comparative analysis of the deduced amino acid sequences of VP4 indicates a high degree of homology among the same serotypes (94%-98%) and a low degree of homology among the various serotypes (64%-78%). (2) The maximal quantity of expressed protein was harvested at the hours 2-3 following induction and showed 11 % of expression level in the whole cell protein. Monoclonal antibodies against group A rotavirus VP4 could specifically recognize the expressed protein epitopes in Western blot assay. Conclusion Sequence analysis and laboratory diagnosis using clinical sample indicated consistently that the serotype of CR188 was P1A; The VP4 gene was highly expressed in prokaryotic system and with the same antigenicity of natural VP4.
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【Key words】 Rotavirus Genes, structural，viral Gene expression Sequence analysis
A组轮状病毒(RV)所致的胃肠炎在世界各地都有相当高的发病率，是引起婴幼儿重症腹泻的最重要病原[1]。RV结构蛋白VP4是刺激机体产生保护性抗体的主要抗原之一，本研究初步探讨了从临床粪便标本中检测到的RV VP4基因的一级结构特点，以及通过序列分析预测RV血清型别的方法，并且将地方株VP4完整基因在大肠杆菌中进行了表达。
材料和方法
一、标本来源
RV我国地方株CR188从北京地区一腹泻患儿粪便标本中检测到，Dot blot(点杂交)分析为P1A型。
二、质粒与主要试剂
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质粒pET21a(+)及其表达宿主菌E.coli BL21(DE3)为Novagen公司产品。各种限制性内切酶和修饰酶、Super ScriptTMⅡ逆转录酶、诱导剂IPTG均购自GIBCO-BRL公司。T7 DNA测序试剂盒购自上海Promega公司。引物由上海生工生物工程公司合成。Gene Clean Kit为原平公司产品。小鼠抗A组RV VP4 P1A型特异性单克隆抗体(单抗)由日本札幌大学医学院Koki Taniguchi博士惠赠。
三、方法
1. 病毒核酸提取及其VP4基因的RT-PCR扩增：从粪便标本中提取和纯化病毒核酸，以纯化的核酸为模板RT-PCR扩增VP4基因。PCR产物经Gene Clean Kit回收纯化，供克隆用。RT-PCR扩增引物根据P1A型标准株Wa VP4基因的末端保守序列设计，5′端1510和3′端1511两个引物的5′端均带有BamHⅠ酶切位点(GGATCC)。
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1510：5′-[CACGGATCCGGCTATAAAATGGCTTCA]-3′
1511：5′-[CACGGATCCGGTCACATCCTCAATAGC]-3′
2. 重组质粒pET21a(+)-VP4的构建：将RT-PCR扩增的完整VP4基因cDNA片段与质粒pET21a(+)连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA，用限制性内切酶酶切筛选和鉴定重组质粒pET21a(+)-VP4克隆。
3. 测序：参照T7 DNA测序试剂盒说明书进行末端终止法测序。测序中间所用引物根据已测序列设计。用Goldkey软件(军事医学科学院)进行核苷酸及氨基酸序列分析。
4. 诱导表达和样品制备： 将重组质粒pET21a(+)-VP4转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)， LB培养基扩增至A600值(曾称光密度OD)约0.6时，加入诱导剂异丙硫半乳糖甙(IPTG)，继续培养一定时间后收集细菌。离心收集菌体，预冷洗液洗涤后冰浴超声，取一部分为细胞总蛋白样品，剩下的样品4℃12000 r/min离心15分钟，上清为可溶性蛋白样品，沉淀为不可溶性蛋白样品。
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5. 表达产物的鉴定：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(5%浓缩胶，8%分离胶)完毕后，凝胶用Coomassie Blue染色，凝胶密度扫描仪(BIO-RAD Laboratories GS-700 Densitometer)分析。Western blot检测重组VP4的抗原特异性。
结果
一、VP4全基因的序列分析
克隆的CR188 VP4完整基因全长2359 bp，5′端有9个、3′端有25个非编码核苷酸，全基因含单一的ORF，编码775个氨基酸。与五个不同型别的标准株的氨基酸序列进行比较分析，显示我国地方株CR188 VP4氨基酸序列与标准株相似：(1)存在一些高变区如氨基酸73-204、578-608区等，这些高变区在P1A型间保守，在不同血清型间高度变异，高变区以外的区域在各型RV 间保守。(2)胰酶作用点240和246位的精氨酸完全保守，CR188与P1A型标准株Wa、KU在胰酶作用区氨基酸240-246完全同序：RSIQYKR，245位的赖氨酸构成潜在的另一胰酶作用点，可能和病毒毒力有关。(3)26个脯氨酸和4个半胱氨酸是保守的，唯独69M(P4型)序列中一个半胱氨酸残基出现在氨基酸203位，而非保守的216位。
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VP4全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较(表1)，结果表明：我们所测P1A型地方株CR188的VP4氨基酸序列与P1A型标准株非常接近(94%～98%)，与P1B型标准株较接近(91%)，不同型之间同源性较低(64%～78%)。
表1 RV 地方株CR188与标准株之间VP4基因核苷酸与氨基酸序列同源性(%) 标准株血清型
Wa
P1A
KU
P1A
DS-1
P1B
M37
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P2
K8
P3
69M
P4
核苷酸序列同源性
91
97
87
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69
氨基酸序列同源性
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94
98
91
78
64
71
二、表达产物的鉴定
制备的表达产物样品经SDS-PAGE、Coomassie Blue染色后的结果(图1)显示：细胞总蛋白样品和不溶性蛋白样品在预期位置(约88 000)均出现一条蛋白带，可溶性蛋白样品及对照各样品在此位置均无这条带，提示重组VP4主要以不溶性蛋白的形式表达。
1：蛋白标准分子量(high-range)；2：表达的细胞总蛋白；3：对照的细胞总蛋白；4：表达的不溶性蛋白；5: 对照的不溶性蛋白；6：表达的可溶性蛋白；7：对照的可溶性蛋白
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图1 CR188 VP4表达产物经SDS-PAGE和Coomassie Blue染色
在表达动态试验中，诱导后1个小时起，每隔1小时取500 μl样品，至表达6小时止，Coomassie Blue染色分析，重组VP4蛋白表达量并不和表达时间的延长呈正相关，诱导2～3小时时最高，用凝胶密度扫描仪分析，重组VP4蛋白的表达占细胞总蛋白的11%。
不溶性表达产物用抗A组RV P1A型特异性单抗进行Western blot分析(图2)显示，细胞总蛋白样品和不溶性蛋白样品在预期位置(约88000)出现着色浓重的条带，可溶性蛋白样品及对照各样品在此位置均无这条带，证实CR188 VP4获得了特异性表达。另外，细胞总蛋白样品和可溶性蛋白样品约在170000处、细胞总蛋白样品和不溶性蛋白样品在70000处分别出现一条着色较浅的条带。
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1：表达的可溶性蛋白；2：表达的不溶性蛋白；3：表达的细胞总蛋白；4：蛋白标准分子量(high-range)；5：对照的细胞总蛋白；6：对照的不溶性蛋白；7：对照的可溶性蛋白
图2 型特异性单抗YO-2C2对CR188 VP4表达蛋白的Western blot分析
讨论
A组RV引起的婴幼儿秋冬季腹泻占感染性腹泻的40 %以上，尤其在新生儿和婴幼儿中易引起重症腹泻乃至死亡。为防治小儿感染性腹泻，世界各国投入了大量人力和物力研究A组RV。随着分子生物学技术的进展，人们对RV结构与功能的了解更加深入，为临床病原学的诊断、疫苗的研制提供了重要的理论基础和指导。
一、序列分析预测RV血清型
根据结构蛋白VP4可以将RV分为11个型及4个亚型(P血清型)，我们以往的研究发现A组RV 在我国的流行以P1A型为主[2]。传统的RV血清学分型方法是，先做繁杂的人RV分离培养，再用空斑减少中和试验滴定组织培养中的病毒滴度。近年来，单抗EIA、Dot blot、PCR等实验室方法常用于临床的快速诊断，但一部分RV诊断阳性的标本分型不明。血清型别的分子基础是蛋白的氨基酸序列及其编码基因核苷酸序列的差异，因此通过序列分析的方法可以预测血清型，尤其是对Dot blot等方法不能分型的临床标本很有意义。文献报道，由VP4氨基酸序列同源性预测血清型的同型判断标准为同源性≥89%[3]，并进一步证明仅根据氨基酸84-180高变区序列的同源性即可判定[4，5]。在我们的工作中，CR188 VP4氨基酸序列与P1A型标准株之间序列同源性非常高(94%～98%)，与P2～P4型标准株之间序列同源性较低(64%～78%)；临床标本的Dot blot分型结果CR188为P1A型，证明序列分析预测血清型和实验室分型结果一致。而不同亚型间(P1A与P1B)序列同源性达91%，高于同型判断标准，提示同型中不同亚型较不同型之间关系更趋密切。
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二、表达的VP4制备免疫血清用于临床病原学诊断
以往用于临床病原学诊断的试剂，是从患儿的粪便标本中提纯病毒颗粒作抗原免疫动物制备免疫血清，其缺点在于不可避免的会受到粪便中其他成分的干扰，可能产生假阳性；再者，VP4仅占病毒毒粒蛋白的1.5%，免疫血清中抗VP4的成分甚微，效价较低。如果采用实验室表达的抗原性良好的VP4作抗原，因为其成分的高度单一，不会有假阳性的缺点，而且具有抗原背景资料齐全、制备方便、实验可重复性好等优点。对VP4的高效表达还有助于进行其多肽的功能性、抗原性和免疫原性的研究。本研究在原核系统中有效表达了地方株VP4完整基因，检测到重组VP4的特异表达，为进一步的研究工作打下基础。单抗YO-2C2的Western blot结果显示重组表达的VP4蛋白除预期约88 000的主要条带外，还有约170 000、70 000两条浅浅的蛋白带。约170 000的蛋白带可能是VP4蛋白的二聚体，主要以可溶性蛋白形式表达，或者是可溶性重组VP4蛋白结合宿主菌的某种蛋白成分而形成。约70 000的蛋白带推测与表达产物的降解有关，由于表达的融合蛋白氨基端和羧基端均为非天然末端，可能易被宿主菌内的某些酶降解。用三种抗A组RV VP4 P1A型特异性单抗检测重组表达的不溶性蛋白样品，单抗YO-2C2反应结果强阳性，并且100℃加热变性样品和37℃处理样品无差异；单抗KU6B11和YO-IS3的37℃处理样品反应结果阳性，100℃加热变性样品反应结果均为阴性。可能有些单抗(如YO-2C2)识别的抗原决定簇在氨基酸序列一级结构上是连续的，不受蛋白空间构型影响，变性后仍能和单抗反应；有些抗原决定簇却依赖蛋白的空间构型，变性后不再被相应单抗(如KU6B11、YO-IS3)识别。
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RV感染的主要流行型别为G1-G4型(G血清型以VP7为分型抗原)，都属于P1型。即如果以VP7为保护性抗原需要四价疫苗，但是如果以VP4为保护性抗原，用P1型单价疫苗就能达到预防目的[3]。VP4不需要糖基化和特殊的空间结构，有较多的交叉保护作用，有关的中和抗原决定簇相当稳定，原核及真核表达都具有良好的抗原性[6，7]，因此VP4的研究越来越受到重视和发展。迄今尚未见我国地方株VP4完整基因有效表达的报道，我们检测到重组VP4蛋白的特异表达，将有益于我国RV 毒株VP4型别的研究和RV感染性婴幼儿腹泻的防治工作。
资助项目：本课题由国家自然科学基金资助(基金编号：39570036)及北京市自然科学基金资助(基金编号：7951002)
参考文献
1 Kapikian AZ, Chanock RM. Rotaviruses. In: Fields, ed. Fields virology. 3rd ed. New York: Raven, 1996. 1657-1708.
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2 袁丽娟，钱渊，刘军，等. 北京等我国四个地区婴幼儿腹泻RV VP4和VP7型别的研究. 病毒学报,1994,10:136-144.
3 Gorziglia M, Larralde G,Kapikian AZ, et al. Antigenic relationships among human rotaviruses as determined by outer capsid protein VP4. Proc Natl Acad Sci USA,1990,l87:7155-7159.
4 Larralde G, Li B, Kapikian AZ, et al. Serotype-specific epitope(s) present on the VP8 subunit of rotavirus VP4 protein. J Virol, 1991, 65: 3213-3218.
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5 Larralde G, Gorziglia M. Distribution of conserved and specific epitopes on the VP8 subunit of rotavirus VP4. J Virol, 1992， 66: 7438-7443.
6 Redmond MJ, Ijaz MK, Parker MD, et al. Assembly of recombinant rotavirus proteins into virus-like particles and assessment of vaccine potential. Vaccine, 1993, 11: 273-281.
7 Mahajan NP, Durga RC. Nucleotide sequence and expression in E. coli of the complete P4 type VP4 from a G2 setotype human rotavirus. Arch Virol, 1996, 141:315-329.
收稿：1998-10-12
修回：1999-05-17, 百拇医药