激活Gs蛋白对胆红素诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡影响的研究
作者：李晓瑜 林穗珍 许小林 皮荣标 颜光美
单位：李晓瑜(广州, 中山医科大学附属第一医院儿科 510080)；林穗珍(广州, 中山医科大学附属第一医院儿科 510080)；许小林(药理教研室)；皮荣标(药理教研室)；颜光美(药理教研室)
关键词：胆红素；G蛋白质类；神经元；脱噬作用
中华儿科杂志000105 摘 要：目的 研究激活Gs蛋白对胆红素诱导的小脑颗粒神经元凋亡的影响及作用机制。方法 采用原代培养的新生大鼠小脑颗粒神经元，用霍乱毒素(CT)激活Gs蛋白，用二乙酸荧光素(FDA)染色及四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定胆红素诱导的小脑神经元存活率，125I放射免疫法测定细胞内环磷酸腺苷(cAMP)，Fura-2/AM荧光比值成像技术测定细胞内钙浓度([Ca2+]i)。结果 CT诱导细胞内cAMP升高并呈剂量依赖性地保护胆红素诱导的小脑颗粒神经元凋亡。当加入腺苷环化酶(AC)刺激剂(Forskolin)及cAMP类似物(8-溴-环磷酸腺苷)后，虽导致细胞内cAMP升高，但不能阻断或减弱胆红素诱导的神经元凋亡。另发现胆红素浓度依赖性触发细胞内钙升高，而CT可降低胆红素导致的细胞内钙的升高。结论 Gs蛋白可能参与了小脑颗粒神经元凋亡的调控，激活Gs蛋白拮抗胆红素诱导的神经元凋亡的机制是通过降低细胞内钙而不依赖于cAMP的途径。
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Activation of Gs-protein affects apoptosis of rat cerebellar granule neurons induced by bilirubin
LI Xiaoyu
(Department of Pediatrics, First Hospital, Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China)
LIN Suizhen
(Department of Pediatrics, First Hospital, Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China)
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XU Xiaolin
(Department of Pediatrics, First Hospital, Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China)
Abstract：Objective To investigate the effect and the mechanism of activation of Gs-protein on bilirubin-induced apoptosis of rat cerebellar granule neurons. Methods Primary cultured rat cerebellar granule neurons were exposed to Cholera toxin (CT). The effect of activation of Gs-protein by CT on bilirubin-induced apoptosis was observed. The survival rate of neurons was detected by fluorescein diacetate (FDA) staining and MTT assay. The intracellular [Ca2+]i was measured by the ratio of fura-2/AM with the microspectrofluorometry ratio imaging system. Cytosolic cyclic AMP(cAMP) content was quantitated by using 125 I radioimmunoassay. Results CT could induce the elevation of cAMP content and protect cerebellar granule neurons from the bilirubin-induced apoptosis in a dose-dependent pattern. However, the exposure of cultured cerebellar granule neurons to Forskolin (which stimulates adenylate cyclase directly and enhances Gs-cyclase coupling) and 8-bromo-cAMP (a membrane-permeable analogue of cAMP) did not block or attenuate apoptosis of cerebellar granule neurons induced by bilirubin. On the other hand, bilirubin elevated [Ca2+]i in a concentration-dependent pattern. CT attenuated the rise of [Ca2+]i induced by bilirubin. Conclusion Gs-protein might play a role in the regulation of apoptosis of cerebellar granule neurons. The mechanism of protection against bilirubin-induced apoptosis of cerebellar granule neurons by activation of Gs-protein was associated with decreasing [Ca2+]i in a cAMP-independent way.
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Key words：Bilirubin; G-proteins; Neurons; Apoptosis▲
胆红素脑病是新生儿高胆红素血症中最严重的并发症，常可遗留脑瘫、智力低下等严重后遗症[1]。有关胆红素神经毒性的分子学发病机制尚不十分清楚。本室已报道胆红素可选择性地诱导新生大鼠小脑颗粒神经元凋亡[2]，初步揭示了胆红素神经毒性的分子学发病机制。众多研究已发现细胞凋亡与信号传导系统Ca2+、cAMP、蛋白激酶C等存在着密切关系，同时激活G蛋白可双相调节大鼠小脑颗粒神经元的凋亡[3，4]。因此,本研究通过检测细胞存活率、细胞内cAMP的浓度、细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的变化，探讨激活Gs蛋白对胆红素诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的影响及机制。
材料和方法
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一、材料
1.主要试剂：霍乱毒素(cholera toxin，CT)、8-溴-环磷酸腺苷(8-bromo-cAMP)(美国RBI公司)，Fura-2/AM、EGTA(美国Molecular Probes公司)，神经细胞基础培养液(basal medium eagle′s BME)(美国GIBGO公司)，二甲亚砜(DMSO)、胆红素(bilirubin，BR)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、福司柯林(forskolin，FK)等药物(美国Sigma公司)。
2.动物来源：生后8 d的SD大鼠，体重12～16 g，雌雄不限，由中山医科大学实验动物中心提供。
二、方法
1.大鼠小脑颗粒神经元的培养及凋亡模型的建立：按照我室已建立的方法[2,5]。取生后8 d的SD大鼠的小脑，经过0.5 g/L胰酶消化后制成细胞悬液，加入0.5 g/L胰酶抑制剂和50 mg/L的DNA酶以终止消化，离心5 min(1 500 r/min)，弃上清液，将细胞加入含有10%胎牛血清和25 mmol/L氯化钾的BME中，以1.5×109/L的密度接种于已经用多聚赖氨酸包备的24孔板的培养皿中。接种后24 h加入10 μmol/L的Ara-C以抑制胶质细胞的生长，使神经元的纯化率达到95%以上。细胞在培养皿中培养8 d，加入胆红素3 mg/L后，经Hoechst 33258染色观察细胞核形态学变化,用琼脂糖凝胶电泳法证实胆红素可诱导小脑颗粒神经元的凋亡[2]。
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2.神经元存活率的测定：(1) 荧光染色法[5]取培养第8天的神经元加入胆红素3 mg/L后，在不同时间点测定细胞存活率，给药24 h细胞存活率为51%[2]，故本实验均以给药24 h后测定神经元存活率。每一药物处理组或浓度组及对照组各设3～6个复孔，实验重复3次。方法：去掉培养液, 采用荧光双染色法观察神经元生存状态及形态学变化，并在荧光显微镜下随机拍照。(2)MTT法[6]：在培养液中加入MTT(250 μg/ml)，置5%CO2、37℃的培养箱中4～6 h，去掉培养液，加入DMSO震荡混匀后，在酶标仪(Elx 800，美国)上测定570 nm和630 nm双波的吸光度。酶标仪测得的吸光度(A值)与细胞存活率呈正相关(r2=0.992)。计算：细胞存活率(%)=处理组A值/对照组A值×100%或直接以测得的A值代表细胞存活率。
3. [Ca2+]i的测定[7]：采用Fura-2/AM荧光比值成像技术测定[Ca2+]i。用培养第8天的细胞，加入3 mg/L 的胆红素3 h后，去除培养基，用含5 g/L小牛白蛋白的缓冲液分别清洗细胞，以清除细胞外的胆红素；经5 μmol/L Fura-2/Am负载45 min后的神经元,洗涤3次,放在倒置荧光显微镜下,使用荧光比值成像系统(Imaging 1/FL，美国), 激发波长为340 nm和380 nm，发射波长为510 nm，在计算机自动控制下测定340/380荧光比值, 根据公式计算出[Ca2+]i。
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4.细胞内cAMP浓度的测定：采用125I标记放射免疫方法测定。按文献[8]的方法并稍加修改，细胞在24孔板培养8 d，药物处理组及对照组各设8个复孔，加药2 h后弃尽培养基，用冷PBS洗2次，各孔立即加含1%三氯醋酸的70%乙醇溶液(破坏细胞膜和酶的活性，400 μl/孔)，置-30℃过夜。再将液体转移到青霉素小瓶中，60～80℃水浴蒸干，每瓶加50 mmol/L醋酸缓冲液400 μl，置-30℃待测。具体操作按上海中医学院提供的125I-cAMP试剂盒说明书进行，根据标准曲线回归方程计算出cAMP量，结果以pmol/孔表示。
三、统计学处理
测量数据用均值±标准差(
±s)表示，显著性检验采用方差分析及SNK-q检验(用spss 7.0统计软件包)。所测得cAMP浓度为正态分布。
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结果
一、激活Gs蛋白对胆红素神经毒性的影响
用培养8 d的大鼠小脑颗粒神经元加入不同浓度的CT(0～4 mg/L)预处理4 h后，再加入3 mg/L胆红素，24 h后测神经元存活率，结果CT在0、2、4 mg/L时神经元的存活率分别为(40.0±2.5)%、(78.0±2.6)%、(95.0±2.7)%(实验重复3次，结果类似)，说明CT呈剂量依赖性地保护胆红素诱导的神经元死亡(图1～4)。
图1-4神经元的生存状况及形态学变化
(荧光双染色法,绿色为活细胞,红色为死亡细胞光镜×200)
图1对照组神经元
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图2BR(3mg/L)处理组
图3CT(2mg/L)+BR(3mg/L)处理组
图4CT(4mg/L)+BR(3mg/L)处理组
二、激活Gs蛋白后细胞内cAMP浓度的变化
培养8 d的大鼠小脑神经元经2 mg/L CT预处理4 h，再加入胆红素(3 mg/L)，作用2.5 h后，收集细胞,测定cAMP浓度。发现加入CT及腺苷环化酶(AC)激活剂(FK)组cAMP浓度均较对照组及单独胆红素组明显升高，差异有显著意义；而单独胆红素组cAMP浓度较对照组无明显改变，FK组cAMP升高较CT组更显著(图5，F值=36.8)。
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注：BR：胆红素；CT：霍乱毒素；FK：福司柯林；
* P<0.05，** P<0.001，均为与对照及BR组比较
图5 胆红素诱导小脑神经元凋亡时细胞内cAMP浓度的变化及CT、FK对其的影响(n=8)
同一批细胞在BR作用24 h后同时以MTT法检测细胞存活率，发现加入CT处理组细胞存活率高于单独BR组，而加入FK及膜渗透性的cAMP类似物8-brome-cAMP预处理细胞后细胞存活率与单独BR组比较无明显差异，对BR的神经毒性无保护作用(图6)，说明CT激活Gs蛋白保护BR的神经毒性是不依赖cAMP途径的。
注：BR：胆红素；CT：霍乱毒素；FK：福司柯林；
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8-bro-cAMP：8-溴-环磷酸腺苷；与BR组比较，* P<0.01
图6 各药物对小脑颗粒神经元存活率的影响(n=6)
三、胆红素诱导神经元死亡时[Ca2+]i的变化及CT的影响
用培养8 d的大鼠小脑颗粒神经元加入胆红素10 mg/L后在不同时间里测定细胞内胆红素所发出的荧光强度(其荧光强度与胆红素的量呈正相关)[2]，发现加入胆红素作用2.5～3 h时细胞内荧光强度最强。故加入浓度为2.5、5、10和20 mg/L的胆红素2.5 h后，测定，[Ca2+]i分别为(284±16)、(361±32)、(808±69)和(820±53)nmol/L(各浓度组细胞数为60),说明胆红素剂量依赖性地触发[Ca2+]i的升高。用CT预处理细胞后，再加入3 mg/L胆红素作用2.5 h后测定[Ca2+]i，发现单独胆红素组[Ca2+]i较对照组、CT组及CT+BR组显著升高(表1)，两两比较差异均有显著意义，说明Ca2+参与了胆红素诱导的细胞凋亡,而CT保护BR对神经元的毒性可能是通过降低细胞内钙而实现的。
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表1 CT对胆红素引起的小脑颗粒神经元[Ca2+]i升高的影响(±s, nmol/L) 组别
细胞数(个)
[Ca2+]i
对照组
60
175.3± 2.1
CT组
60
162.5± 3.0*
CT+BR组
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60
151.7± 1.9*
BR组
60
271.7±14.2**
注：与BR组相比, * P<0.01；与对照组相比, ** P<0.001
讨论 胆红素神经毒性的分子学机制目前尚不十分清楚。胆红素引起新生儿脑损伤的典型特点是脑的局部区域或某些神经元对损伤的选择性易感，如：小脑、基底节、浦肯野细胞、海马细胞等[9]。本研究室已报道胆红素在体外可选择性地诱导原代培养的新生大鼠小脑颗粒神经元的凋亡，这一现象与以往临床和病理观察结果相符。像细胞生长、分化一样,大量研究证明细胞凋亡涉及不同信号传递系统的调节。Yan等[4]报道激活G蛋白双向调控小脑颗粒神经元的凋亡,当CT激活Gs时,可拮抗由非去极化浓度的氯化钾(5 mmol/L)所诱导的小脑颗粒神经元的凋亡。而用蜂毒多肽Mastoparan激活Gi/Go蛋白时则可诱导小脑颗粒神经元的凋亡。同时发现，非去极化状态的氯化钾使[Ca2+]i降低，而Mastoparan使[Ca2+]i明显升高，提示Gs蛋白-cAMP、Ca2+信号系统在调控神经元生存起着重要的作用。本研究结果发现Gs蛋白激活剂CT可呈剂量依赖性地保护胆红素诱导的小脑颗粒神经元凋亡，说明Gs蛋白可能参与了胆红素诱导的神经细胞凋亡的调控。G蛋白又称鸟甘酸结合蛋白，存在于细胞膜上，是生物体内重要的细胞内外信号传导系统。细胞质膜上存在着cAMP和肌醇脂质信使系统均与G蛋白紧密相关。目前将G蛋白主要分为5类：Gs、Gi、Gp、Gt、和Go。Gs的主要功能是激活腺苷环化酶(AC)；Gs蛋白对CT敏感，造成Gs蛋白持续激活；而Gi蛋白的主要功能是抑制AC，其对百日咳杆菌毒素敏感[10]。另外Gs蛋白还可能有直接调节神经细胞钙通道，尤其是电压依赖性通道的作用[11]，那么在胆红素诱导神经元凋亡的过程中，Gs蛋白是通过cAMP的途径还是Ca2+途径参与对凋亡的调节呢？实验结果表明，加入CT激活Gs蛋白后，细胞内cAMP明显升高，对胆红素导致的神经毒性有保护作用，但加入腺苷环化酶激活剂FK，以及cAMP类似物8-brome-cAMP后，对BR的神经毒性并无保护作用，说明CT激活Gs蛋白后，并不是通过cAMP途径而起到生物效应的。因此，进一步测定[Ca2+]i， 发现胆红素可引起[Ca2+]i升高。[Ca2+]i的升高介导的细胞凋亡的机制被认为是与钙调蛋白活化蛋白酶Ⅱ，引起细胞周期停止在G2期，进而导致细胞凋亡，还可通过活化蛋白酶、磷酸脂酶、磷酸化酶等传递死亡信号，最后其直接作用的就是活化核酸内切酶，导致DNA被酶切而片段化[12]。加入CT后降低胆红素引起[Ca2+]i升高，而起到对胆红素引起的神经毒性的保护作用。近年来观察到神经递质可通过G蛋白介导对神经细胞电压依赖性离子通道直接发挥调制作用，而不经过目前已知的多种第二信使的介导，已有报道在培养的小脑颗粒细胞谷氨酸通过百日咳杆菌毒素敏感G蛋白(Gi/Go)抑制L型钙通道[11]。因此，推测Gs蛋白的激活通过对钙通道的调节或其他途径降低了胆红素诱导的[Ca2+]i的升高而保护胆红素诱导的神经毒性。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770782)；广东省自然科学基金资助项目(970052)
参考文献：
[1]俞惠民, 洪文澜, 施丽萍. 新生儿高间接胆红素血症患儿远期随访观察. 中华儿科杂志, 1996, 34:324-326.
[2]林穗珍, 李晓瑜, 颜光美. 胆红素诱导大鼠小脑颗粒神经元凋亡的研究. 中华医学杂志, 1999, 79:125-128.
[3]刘睿, 编译. 调节细胞凋亡的信号传导机制. 国外医学免疫学分册, 1995, 5:270-272.
[4]Yan GM, Lin SZ, Irwin RP, et al. Activation of G protein bidirectionallt affects apoptosis of cultured cerebellar granule neurons. J Neurochem, 1995, 65:2425-2431.
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[5]林穗珍, 黎明涛, 李晓瑜, 等. 小檗碱诱导大鼠神经元毒性死亡的研究. 中山医科大学学报, 1998, 19:250-254.
[6]Sladowski D, Steer SJ, Clothier RH, et al. An improved MTT assay. J Immunol Methods, 1993, 157:203-207.
[7]林穗珍, 李晓瑜, 陶亮, 等. 蜂毒肽Mastoparan诱导大鼠小脑颗粒神经元死亡的机制. 中国药理学通报, 1998, 14:332-336.
[8]林曙光, 郑光华, 段小贝, 主编. 细胞信号转导系统. 基础医学与临床. 天津: 天津科学技术出版社, 1996. 112-114.
[9]Ahdab-Barmada M, Moossy J. The neuropathology of kernicterus in the premature neonate: diagnostic problems. J Neuropathol Exp Neurol, 1984, 43:45-52.
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[10]林曙光, 郑光华, 段小贝, 主编. 细胞信号转导系统. 基础医学与临床. 天津:天津科学技术出版社, 1996. 1-8.
[11]吴新生, 何淑舫. G 蛋白对神经细胞电压依赖性离子通道的直接调制作用. 生理科学进展, 1997, 28:14-18.
[12]Nicotera P, Zhivotovsky B, Orrenius S. Nuclear calcium transport and the role of calcium in apoptosis. Cell Calcium, 1994, 16:279-288.
收稿日期：1999-03-12, 百拇医药
单位：李晓瑜(广州, 中山医科大学附属第一医院儿科 510080)；林穗珍(广州, 中山医科大学附属第一医院儿科 510080)；许小林(药理教研室)；皮荣标(药理教研室)；颜光美(药理教研室)
关键词：胆红素；G蛋白质类；神经元；脱噬作用
中华儿科杂志000105 摘 要：目的 研究激活Gs蛋白对胆红素诱导的小脑颗粒神经元凋亡的影响及作用机制。方法 采用原代培养的新生大鼠小脑颗粒神经元，用霍乱毒素(CT)激活Gs蛋白，用二乙酸荧光素(FDA)染色及四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定胆红素诱导的小脑神经元存活率，125I放射免疫法测定细胞内环磷酸腺苷(cAMP)，Fura-2/AM荧光比值成像技术测定细胞内钙浓度([Ca2+]i)。结果 CT诱导细胞内cAMP升高并呈剂量依赖性地保护胆红素诱导的小脑颗粒神经元凋亡。当加入腺苷环化酶(AC)刺激剂(Forskolin)及cAMP类似物(8-溴-环磷酸腺苷)后，虽导致细胞内cAMP升高，但不能阻断或减弱胆红素诱导的神经元凋亡。另发现胆红素浓度依赖性触发细胞内钙升高，而CT可降低胆红素导致的细胞内钙的升高。结论 Gs蛋白可能参与了小脑颗粒神经元凋亡的调控，激活Gs蛋白拮抗胆红素诱导的神经元凋亡的机制是通过降低细胞内钙而不依赖于cAMP的途径。
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Activation of Gs-protein affects apoptosis of rat cerebellar granule neurons induced by bilirubin
LI Xiaoyu
(Department of Pediatrics, First Hospital, Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China)
LIN Suizhen
(Department of Pediatrics, First Hospital, Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China)
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XU Xiaolin
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Abstract：Objective To investigate the effect and the mechanism of activation of Gs-protein on bilirubin-induced apoptosis of rat cerebellar granule neurons. Methods Primary cultured rat cerebellar granule neurons were exposed to Cholera toxin (CT). The effect of activation of Gs-protein by CT on bilirubin-induced apoptosis was observed. The survival rate of neurons was detected by fluorescein diacetate (FDA) staining and MTT assay. The intracellular [Ca2+]i was measured by the ratio of fura-2/AM with the microspectrofluorometry ratio imaging system. Cytosolic cyclic AMP(cAMP) content was quantitated by using 125 I radioimmunoassay. Results CT could induce the elevation of cAMP content and protect cerebellar granule neurons from the bilirubin-induced apoptosis in a dose-dependent pattern. However, the exposure of cultured cerebellar granule neurons to Forskolin (which stimulates adenylate cyclase directly and enhances Gs-cyclase coupling) and 8-bromo-cAMP (a membrane-permeable analogue of cAMP) did not block or attenuate apoptosis of cerebellar granule neurons induced by bilirubin. On the other hand, bilirubin elevated [Ca2+]i in a concentration-dependent pattern. CT attenuated the rise of [Ca2+]i induced by bilirubin. Conclusion Gs-protein might play a role in the regulation of apoptosis of cerebellar granule neurons. The mechanism of protection against bilirubin-induced apoptosis of cerebellar granule neurons by activation of Gs-protein was associated with decreasing [Ca2+]i in a cAMP-independent way.
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Key words：Bilirubin; G-proteins; Neurons; Apoptosis▲
胆红素脑病是新生儿高胆红素血症中最严重的并发症，常可遗留脑瘫、智力低下等严重后遗症[1]。有关胆红素神经毒性的分子学发病机制尚不十分清楚。本室已报道胆红素可选择性地诱导新生大鼠小脑颗粒神经元凋亡[2]，初步揭示了胆红素神经毒性的分子学发病机制。众多研究已发现细胞凋亡与信号传导系统Ca2+、cAMP、蛋白激酶C等存在着密切关系，同时激活G蛋白可双相调节大鼠小脑颗粒神经元的凋亡[3，4]。因此,本研究通过检测细胞存活率、细胞内cAMP的浓度、细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的变化，探讨激活Gs蛋白对胆红素诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的影响及机制。
材料和方法
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一、材料
1.主要试剂：霍乱毒素(cholera toxin，CT)、8-溴-环磷酸腺苷(8-bromo-cAMP)(美国RBI公司)，Fura-2/AM、EGTA(美国Molecular Probes公司)，神经细胞基础培养液(basal medium eagle′s BME)(美国GIBGO公司)，二甲亚砜(DMSO)、胆红素(bilirubin，BR)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、福司柯林(forskolin，FK)等药物(美国Sigma公司)。
2.动物来源：生后8 d的SD大鼠，体重12～16 g，雌雄不限，由中山医科大学实验动物中心提供。
二、方法
1.大鼠小脑颗粒神经元的培养及凋亡模型的建立：按照我室已建立的方法[2,5]。取生后8 d的SD大鼠的小脑，经过0.5 g/L胰酶消化后制成细胞悬液，加入0.5 g/L胰酶抑制剂和50 mg/L的DNA酶以终止消化，离心5 min(1 500 r/min)，弃上清液，将细胞加入含有10%胎牛血清和25 mmol/L氯化钾的BME中，以1.5×109/L的密度接种于已经用多聚赖氨酸包备的24孔板的培养皿中。接种后24 h加入10 μmol/L的Ara-C以抑制胶质细胞的生长，使神经元的纯化率达到95%以上。细胞在培养皿中培养8 d，加入胆红素3 mg/L后，经Hoechst 33258染色观察细胞核形态学变化,用琼脂糖凝胶电泳法证实胆红素可诱导小脑颗粒神经元的凋亡[2]。
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2.神经元存活率的测定：(1) 荧光染色法[5]取培养第8天的神经元加入胆红素3 mg/L后，在不同时间点测定细胞存活率，给药24 h细胞存活率为51%[2]，故本实验均以给药24 h后测定神经元存活率。每一药物处理组或浓度组及对照组各设3～6个复孔，实验重复3次。方法：去掉培养液, 采用荧光双染色法观察神经元生存状态及形态学变化，并在荧光显微镜下随机拍照。(2)MTT法[6]：在培养液中加入MTT(250 μg/ml)，置5%CO2、37℃的培养箱中4～6 h，去掉培养液，加入DMSO震荡混匀后，在酶标仪(Elx 800，美国)上测定570 nm和630 nm双波的吸光度。酶标仪测得的吸光度(A值)与细胞存活率呈正相关(r2=0.992)。计算：细胞存活率(%)=处理组A值/对照组A值×100%或直接以测得的A值代表细胞存活率。
3. [Ca2+]i的测定[7]：采用Fura-2/AM荧光比值成像技术测定[Ca2+]i。用培养第8天的细胞，加入3 mg/L 的胆红素3 h后，去除培养基，用含5 g/L小牛白蛋白的缓冲液分别清洗细胞，以清除细胞外的胆红素；经5 μmol/L Fura-2/Am负载45 min后的神经元,洗涤3次,放在倒置荧光显微镜下,使用荧光比值成像系统(Imaging 1/FL，美国), 激发波长为340 nm和380 nm，发射波长为510 nm，在计算机自动控制下测定340/380荧光比值, 根据公式计算出[Ca2+]i。
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4.细胞内cAMP浓度的测定：采用125I标记放射免疫方法测定。按文献[8]的方法并稍加修改，细胞在24孔板培养8 d，药物处理组及对照组各设8个复孔，加药2 h后弃尽培养基，用冷PBS洗2次，各孔立即加含1%三氯醋酸的70%乙醇溶液(破坏细胞膜和酶的活性，400 μl/孔)，置-30℃过夜。再将液体转移到青霉素小瓶中，60～80℃水浴蒸干，每瓶加50 mmol/L醋酸缓冲液400 μl，置-30℃待测。具体操作按上海中医学院提供的125I-cAMP试剂盒说明书进行，根据标准曲线回归方程计算出cAMP量，结果以pmol/孔表示。
三、统计学处理
测量数据用均值±标准差(
±s)表示，显著性检验采用方差分析及SNK-q检验(用spss 7.0统计软件包)。所测得cAMP浓度为正态分布。, http://www.100md.com
结果
一、激活Gs蛋白对胆红素神经毒性的影响
用培养8 d的大鼠小脑颗粒神经元加入不同浓度的CT(0～4 mg/L)预处理4 h后，再加入3 mg/L胆红素，24 h后测神经元存活率，结果CT在0、2、4 mg/L时神经元的存活率分别为(40.0±2.5)%、(78.0±2.6)%、(95.0±2.7)%(实验重复3次，结果类似)，说明CT呈剂量依赖性地保护胆红素诱导的神经元死亡(图1～4)。
图1-4神经元的生存状况及形态学变化
(荧光双染色法,绿色为活细胞,红色为死亡细胞光镜×200)
图1对照组神经元
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图2BR(3mg/L)处理组
图3CT(2mg/L)+BR(3mg/L)处理组
图4CT(4mg/L)+BR(3mg/L)处理组
二、激活Gs蛋白后细胞内cAMP浓度的变化
培养8 d的大鼠小脑神经元经2 mg/L CT预处理4 h，再加入胆红素(3 mg/L)，作用2.5 h后，收集细胞,测定cAMP浓度。发现加入CT及腺苷环化酶(AC)激活剂(FK)组cAMP浓度均较对照组及单独胆红素组明显升高，差异有显著意义；而单独胆红素组cAMP浓度较对照组无明显改变，FK组cAMP升高较CT组更显著(图5，F值=36.8)。
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注：BR：胆红素；CT：霍乱毒素；FK：福司柯林；
* P<0.05，** P<0.001，均为与对照及BR组比较
图5 胆红素诱导小脑神经元凋亡时细胞内cAMP浓度的变化及CT、FK对其的影响(n=8)
同一批细胞在BR作用24 h后同时以MTT法检测细胞存活率，发现加入CT处理组细胞存活率高于单独BR组，而加入FK及膜渗透性的cAMP类似物8-brome-cAMP预处理细胞后细胞存活率与单独BR组比较无明显差异，对BR的神经毒性无保护作用(图6)，说明CT激活Gs蛋白保护BR的神经毒性是不依赖cAMP途径的。
注：BR：胆红素；CT：霍乱毒素；FK：福司柯林；
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8-bro-cAMP：8-溴-环磷酸腺苷；与BR组比较，* P<0.01
图6 各药物对小脑颗粒神经元存活率的影响(n=6)
三、胆红素诱导神经元死亡时[Ca2+]i的变化及CT的影响
用培养8 d的大鼠小脑颗粒神经元加入胆红素10 mg/L后在不同时间里测定细胞内胆红素所发出的荧光强度(其荧光强度与胆红素的量呈正相关)[2]，发现加入胆红素作用2.5～3 h时细胞内荧光强度最强。故加入浓度为2.5、5、10和20 mg/L的胆红素2.5 h后，测定，[Ca2+]i分别为(284±16)、(361±32)、(808±69)和(820±53)nmol/L(各浓度组细胞数为60),说明胆红素剂量依赖性地触发[Ca2+]i的升高。用CT预处理细胞后，再加入3 mg/L胆红素作用2.5 h后测定[Ca2+]i，发现单独胆红素组[Ca2+]i较对照组、CT组及CT+BR组显著升高(表1)，两两比较差异均有显著意义，说明Ca2+参与了胆红素诱导的细胞凋亡,而CT保护BR对神经元的毒性可能是通过降低细胞内钙而实现的。
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表1 CT对胆红素引起的小脑颗粒神经元[Ca2+]i升高的影响(
±s, nmol/L) 组别细胞数(个)
[Ca2+]i
对照组
60
175.3± 2.1
CT组
60
162.5± 3.0*
CT+BR组
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60
151.7± 1.9*
BR组
60
271.7±14.2**
注：与BR组相比, * P<0.01；与对照组相比, ** P<0.001
讨论 胆红素神经毒性的分子学机制目前尚不十分清楚。胆红素引起新生儿脑损伤的典型特点是脑的局部区域或某些神经元对损伤的选择性易感，如：小脑、基底节、浦肯野细胞、海马细胞等[9]。本研究室已报道胆红素在体外可选择性地诱导原代培养的新生大鼠小脑颗粒神经元的凋亡，这一现象与以往临床和病理观察结果相符。像细胞生长、分化一样,大量研究证明细胞凋亡涉及不同信号传递系统的调节。Yan等[4]报道激活G蛋白双向调控小脑颗粒神经元的凋亡,当CT激活Gs时,可拮抗由非去极化浓度的氯化钾(5 mmol/L)所诱导的小脑颗粒神经元的凋亡。而用蜂毒多肽Mastoparan激活Gi/Go蛋白时则可诱导小脑颗粒神经元的凋亡。同时发现，非去极化状态的氯化钾使[Ca2+]i降低，而Mastoparan使[Ca2+]i明显升高，提示Gs蛋白-cAMP、Ca2+信号系统在调控神经元生存起着重要的作用。本研究结果发现Gs蛋白激活剂CT可呈剂量依赖性地保护胆红素诱导的小脑颗粒神经元凋亡，说明Gs蛋白可能参与了胆红素诱导的神经细胞凋亡的调控。G蛋白又称鸟甘酸结合蛋白，存在于细胞膜上，是生物体内重要的细胞内外信号传导系统。细胞质膜上存在着cAMP和肌醇脂质信使系统均与G蛋白紧密相关。目前将G蛋白主要分为5类：Gs、Gi、Gp、Gt、和Go。Gs的主要功能是激活腺苷环化酶(AC)；Gs蛋白对CT敏感，造成Gs蛋白持续激活；而Gi蛋白的主要功能是抑制AC，其对百日咳杆菌毒素敏感[10]。另外Gs蛋白还可能有直接调节神经细胞钙通道，尤其是电压依赖性通道的作用[11]，那么在胆红素诱导神经元凋亡的过程中，Gs蛋白是通过cAMP的途径还是Ca2+途径参与对凋亡的调节呢？实验结果表明，加入CT激活Gs蛋白后，细胞内cAMP明显升高，对胆红素导致的神经毒性有保护作用，但加入腺苷环化酶激活剂FK，以及cAMP类似物8-brome-cAMP后，对BR的神经毒性并无保护作用，说明CT激活Gs蛋白后，并不是通过cAMP途径而起到生物效应的。因此，进一步测定[Ca2+]i， 发现胆红素可引起[Ca2+]i升高。[Ca2+]i的升高介导的细胞凋亡的机制被认为是与钙调蛋白活化蛋白酶Ⅱ，引起细胞周期停止在G2期，进而导致细胞凋亡，还可通过活化蛋白酶、磷酸脂酶、磷酸化酶等传递死亡信号，最后其直接作用的就是活化核酸内切酶，导致DNA被酶切而片段化[12]。加入CT后降低胆红素引起[Ca2+]i升高，而起到对胆红素引起的神经毒性的保护作用。近年来观察到神经递质可通过G蛋白介导对神经细胞电压依赖性离子通道直接发挥调制作用，而不经过目前已知的多种第二信使的介导，已有报道在培养的小脑颗粒细胞谷氨酸通过百日咳杆菌毒素敏感G蛋白(Gi/Go)抑制L型钙通道[11]。因此，推测Gs蛋白的激活通过对钙通道的调节或其他途径降低了胆红素诱导的[Ca2+]i的升高而保护胆红素诱导的神经毒性。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770782)；广东省自然科学基金资助项目(970052)
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收稿日期：1999-03-12, 百拇医药