病毒性心肌炎病原学诊断及患儿细胞免疫功能变化的研究
作者：范瑾 宁淑敏
单位：范瑾(730030 兰州医学院第二附属医院儿科)；宁淑敏(730030 兰州医学院第二附属医院儿科)
关键词：
中华儿科杂志000215 我们采用聚合酶链反应(PCR)技术诊断 40例心肌炎患儿，并对30 例临床诊断为心肌炎患儿外周血可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R)及T细胞亚群在急性期、恢复期的变化进行探讨，现报告如下。
对象
为1996年6月～1998年 12 月在我院儿科住院的患儿， 按1994年全国小儿心血管专业学术会议修订的病毒性心肌炎诊断标准[1]， 临床诊断为急性心肌炎30例(病程为6个月内)和疑似心肌炎10例，其中男26例，女14例；年龄2个月～14岁，平均5.5岁。患儿于入院后均做心电图、心脏X线、心肌酶谱及超声心动图检查，并取血测定柯萨奇病毒B组RNA(CVB-RNA)，T细胞亚群及sIL-2R，部份患儿测定恢复期sIL-2R及T细胞亚群。另外，选择近期无感染、腹泻病史及无心脏异常的健康儿童22例，作为正常对照组。
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方法
1.PCR测定患儿血清CVB-RNA：取血2 ml， 将标本预处理，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步抽提法从患儿血清中提取病毒RNA ，反转录cDNA，经2次PCR扩增，扩增片断为400 bp和190 bp，电泳鉴定，经放射自显影后观察结果。
2.血清sIL- 2R 检测：用单克隆抗体夹心ELISA法测定sIL-2R。试剂盒由白求恩医科大学基础免疫室提供。
3.外周血T细胞亚群测定：取静脉血3 ml，用花环法测定T 淋巴细胞亚群计数。
统计学处理：检测结果以(
±s)表示，组间比较采用方差分析和两两比较q检验。
结果
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1.临床诊断心肌炎组、疑似心肌炎组和正常组血清 CVB-RNA测定结果见表1。在30例临床诊断心肌炎组和10例疑似心肌炎组中，CVB-RNA 阳性率分别为47%和30%，在22名正常组中，CVB-R
NA阳性率9%。临床诊断心肌炎组和疑似心肌炎组CVB-RNA阳性率高于正常对照组。
表1 三组患儿血清CVB-RNA的检测 组别
例数
CVB-RNA阳性者
例数
阳性率 (%)
正常对照组
22
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2
9
心肌炎组
30
14
47
疑似心肌炎组
10
3
30
2.正常对照组、不同病期心肌炎组患儿外周血sIL-2R (×103 U/L)和T细胞亚群(%)的变化(±s)见表2。
, 百拇医药
表2 正常对照组、不同病期心肌炎组患儿血清
sIL-2R(×103 U/L)和T 细胞亚群(%，±s) 组别
例
数
sIL-2R
(×103 U/L)
CD3
CD4
CD8
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CD4/CD8
正常对照
22
258±136
72±6
46±5
27.9±4.6
1.66±0.33
急性期
30
632±293*
66±6
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45±4
39.4±3.6*
1.14±0.15*
恢复期
18
283±186
68±6
48±5
28.5±2.5
1.67±0.31
* 与正常对照组比较，P<0.01 急性心肌炎组血清sIL-2R水平及CD8明显高于正常对照组和恢复期组。经统计学处理，差异有显著意义，P<0.01；而恢复期组与正常对照组比较，差异无显著意义，P>0.05；急性心肌炎组CD4/CD8比值低于正常对照组和恢复期组，经统计学处理，差异有显著意义，P<0.01，而恢复期组CD4/CD8与正常对照组比较，差异无显著意义，P>0.05。
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讨论
1.PCR技术诊断病毒性心肌炎：我们采用PCR技术测定40例心肌炎患儿血清CVB-RNA。结果表明，在40例临床诊断为心肌炎和疑似心肌炎的患儿中，血清CVB-RNA阳性者17例，阳性率43%。其中临床诊断心肌炎组CVB-RNA阳性率高于疑似心肌炎组，分别为47%和30%。在22名正常对照组中，CVB-RNA阳性者2例，阳性率9%，心肌炎组和正常组比较，差异有显著意义，提示COXB病毒感染确是心肌炎的主要病原， PCR技术应用是早期确诊病毒性心肌炎的有效手段。近年来，一些资料表明，在心肌炎后期或扩张型心肌病(DCM)心脏组织中， 持续存在病毒RNA，这种病毒基因的持续存在使病人易发生发展为慢性心肌炎[2]。在本组病程为4～6月的患儿中，有2/6例CVB-RNA阳性，这些患儿在临床上表现为反复呼吸道感染，不同程度房室扩大、心功能不全。我们认为这种病毒在体内的存在可能与患儿病情迁延不愈有关。
, 百拇医药 2.心肌炎患儿细胞免疫功能变化的研究：sIL-2R是1985年由Rubin等人发现的，他是mIL-2R 脱落至体液中的产物。sIL-2R可与白细胞介素2膜受体(mIL-2R)竞争性结合IL-2，并能中和活化T 细胞周围的IL-2，降低机体自分泌效应，一般被视为一种血清免疫抑制因子，测定由细胞分泌或细胞脱落的sIL-2R含量，可了解某些疾病时机体的免疫状态[3]。研究结果显示，心肌炎急性期患儿血清 sIL-2R水平明显升高，与正常对照组比较，差异有显著意义；而恢复期sIL-2R水平降低。说明随着病毒入侵、刺激、激活机体的免疫系统，使T 淋巴细胞增殖，分泌并释放sIL-2R入血，使血清sIL-2R升高。高水平的sIL-2R可与mIL-2R竞争性结合IL-2，并中和活化T淋巴细胞周围的IL-2。IL-2减少将导致T细胞，NK及其它效应细胞抗病毒能力下降，使机体不能有效清除病毒及阻止病毒复制，引起持续感染。
我们在病毒性心肌炎患儿T细胞亚群的研究中也发现了T细胞系统的异常改变，我们观察到心肌炎急性期CD3(成熟淋巴细胞)，CD4(辅助性T细胞)与正常组比较，无显著性差异，P>0.05，而急性期CD8细胞与正常对照组比较，显著升高，P<0.01，CD4/CD8比值下降，而恢复期CD8细胞及CD4/CD8比值与正常对照组比较，差异无显著性意义。抑制性T淋巴细胞(CD8)具有抑制B淋巴细胞分化，抑制抗体合成及细胞毒性T细胞的作用[4]，CD8活性增强，CD4/CD8比值失调可使上述功能增强，导致机体免疫反应平衡失调，造成组织损伤。
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通过本研究，我们认为病毒性心肌炎急性期患儿CD8升高，CD4/CD8下降及sIL-2R水平升高与病毒感染有关；动态观察急性期和恢复期T细胞亚群及sIL-2R的变化可发现心肌炎急性期机体存在免疫调节功能异常。
基金项目：甘肃省科委自然科学基金暨中青年基金资助项目(ZQ-95-028)
参考文献
[1]李家宜.关于再次修改心肌炎诊断标准的说明.中华儿科杂志,1994,32:349.
[2]Archard LC,Khan MA,Soterion BA, et al.Characterization of Coxsackie B virus RNA in myocarclium from patients with dilated cardiomyopath by nucleotide sequencing of reverse transcription-nested polymerse chain reaction products. Hum pathol,1998,29:578-584.
[3]Rubin LA, Nelson DL.The soluble interlaukin- 2 receptor: biology,function,and clinical application. Ann Int Med, 1990,113:619.
[4]孙毅平,李玉芬,孙宪军，等.病毒性心肌炎COXB IgM及T细胞亚群、红细胞免疫的检测与临床意义.国外医学儿科分册,1998,25:152-153.
收稿日期：1999-07-08, http://www.100md.com
单位：范瑾(730030 兰州医学院第二附属医院儿科)；宁淑敏(730030 兰州医学院第二附属医院儿科)
关键词：
中华儿科杂志000215 我们采用聚合酶链反应(PCR)技术诊断 40例心肌炎患儿，并对30 例临床诊断为心肌炎患儿外周血可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R)及T细胞亚群在急性期、恢复期的变化进行探讨，现报告如下。
对象
为1996年6月～1998年 12 月在我院儿科住院的患儿， 按1994年全国小儿心血管专业学术会议修订的病毒性心肌炎诊断标准[1]， 临床诊断为急性心肌炎30例(病程为6个月内)和疑似心肌炎10例，其中男26例，女14例；年龄2个月～14岁，平均5.5岁。患儿于入院后均做心电图、心脏X线、心肌酶谱及超声心动图检查，并取血测定柯萨奇病毒B组RNA(CVB-RNA)，T细胞亚群及sIL-2R，部份患儿测定恢复期sIL-2R及T细胞亚群。另外，选择近期无感染、腹泻病史及无心脏异常的健康儿童22例，作为正常对照组。
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方法
1.PCR测定患儿血清CVB-RNA：取血2 ml， 将标本预处理，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步抽提法从患儿血清中提取病毒RNA ，反转录cDNA，经2次PCR扩增，扩增片断为400 bp和190 bp，电泳鉴定，经放射自显影后观察结果。
2.血清sIL- 2R 检测：用单克隆抗体夹心ELISA法测定sIL-2R。试剂盒由白求恩医科大学基础免疫室提供。
3.外周血T细胞亚群测定：取静脉血3 ml，用花环法测定T 淋巴细胞亚群计数。
统计学处理：检测结果以(
±s)表示，组间比较采用方差分析和两两比较q检验。结果
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1.临床诊断心肌炎组、疑似心肌炎组和正常组血清 CVB-RNA测定结果见表1。在30例临床诊断心肌炎组和10例疑似心肌炎组中，CVB-RNA 阳性率分别为47%和30%，在22名正常组中，CVB-R
NA阳性率9%。临床诊断心肌炎组和疑似心肌炎组CVB-RNA阳性率高于正常对照组。
表1 三组患儿血清CVB-RNA的检测 组别
例数
CVB-RNA阳性者
例数
阳性率 (%)
正常对照组
22
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2
9
心肌炎组
30
14
47
疑似心肌炎组
10
3
30
2.正常对照组、不同病期心肌炎组患儿外周血sIL-2R (×103 U/L)和T细胞亚群(%)的变化(
±s)见表2。, 百拇医药
表2 正常对照组、不同病期心肌炎组患儿血清
sIL-2R(×103 U/L)和T 细胞亚群(%，
±s) 组别例
数
sIL-2R
(×103 U/L)
CD3
CD4
CD8
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CD4/CD8
正常对照
22
258±136
72±6
46±5
27.9±4.6
1.66±0.33
急性期
30
632±293*
66±6
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45±4
39.4±3.6*
1.14±0.15*
恢复期
18
283±186
68±6
48±5
28.5±2.5
1.67±0.31
* 与正常对照组比较，P<0.01 急性心肌炎组血清sIL-2R水平及CD8明显高于正常对照组和恢复期组。经统计学处理，差异有显著意义，P<0.01；而恢复期组与正常对照组比较，差异无显著意义，P>0.05；急性心肌炎组CD4/CD8比值低于正常对照组和恢复期组，经统计学处理，差异有显著意义，P<0.01，而恢复期组CD4/CD8与正常对照组比较，差异无显著意义，P>0.05。
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讨论
1.PCR技术诊断病毒性心肌炎：我们采用PCR技术测定40例心肌炎患儿血清CVB-RNA。结果表明，在40例临床诊断为心肌炎和疑似心肌炎的患儿中，血清CVB-RNA阳性者17例，阳性率43%。其中临床诊断心肌炎组CVB-RNA阳性率高于疑似心肌炎组，分别为47%和30%。在22名正常对照组中，CVB-RNA阳性者2例，阳性率9%，心肌炎组和正常组比较，差异有显著意义，提示COXB病毒感染确是心肌炎的主要病原， PCR技术应用是早期确诊病毒性心肌炎的有效手段。近年来，一些资料表明，在心肌炎后期或扩张型心肌病(DCM)心脏组织中， 持续存在病毒RNA，这种病毒基因的持续存在使病人易发生发展为慢性心肌炎[2]。在本组病程为4～6月的患儿中，有2/6例CVB-RNA阳性，这些患儿在临床上表现为反复呼吸道感染，不同程度房室扩大、心功能不全。我们认为这种病毒在体内的存在可能与患儿病情迁延不愈有关。
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我们在病毒性心肌炎患儿T细胞亚群的研究中也发现了T细胞系统的异常改变，我们观察到心肌炎急性期CD3(成熟淋巴细胞)，CD4(辅助性T细胞)与正常组比较，无显著性差异，P>0.05，而急性期CD8细胞与正常对照组比较，显著升高，P<0.01，CD4/CD8比值下降，而恢复期CD8细胞及CD4/CD8比值与正常对照组比较，差异无显著性意义。抑制性T淋巴细胞(CD8)具有抑制B淋巴细胞分化，抑制抗体合成及细胞毒性T细胞的作用[4]，CD8活性增强，CD4/CD8比值失调可使上述功能增强，导致机体免疫反应平衡失调，造成组织损伤。
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通过本研究，我们认为病毒性心肌炎急性期患儿CD8升高，CD4/CD8下降及sIL-2R水平升高与病毒感染有关；动态观察急性期和恢复期T细胞亚群及sIL-2R的变化可发现心肌炎急性期机体存在免疫调节功能异常。
基金项目：甘肃省科委自然科学基金暨中青年基金资助项目(ZQ-95-028)
参考文献
[1]李家宜.关于再次修改心肌炎诊断标准的说明.中华儿科杂志,1994,32:349.
[2]Archard LC,Khan MA,Soterion BA, et al.Characterization of Coxsackie B virus RNA in myocarclium from patients with dilated cardiomyopath by nucleotide sequencing of reverse transcription-nested polymerse chain reaction products. Hum pathol,1998,29:578-584.
[3]Rubin LA, Nelson DL.The soluble interlaukin- 2 receptor: biology,function,and clinical application. Ann Int Med, 1990,113:619.
[4]孙毅平,李玉芬,孙宪军，等.病毒性心肌炎COXB IgM及T细胞亚群、红细胞免疫的检测与临床意义.国外医学儿科分册,1998,25:152-153.
收稿日期：1999-07-08, http://www.100md.com