正常肌肉和Duchenne肌营养不良肌肉中脑型一氧化氮合酶 mRNA及其蛋白表达量的研究
作者：朱敏生 潘英 王刚 许祥裕 范毓华 沈月 智刚 Kim S Lau James T Stull
单位：朱敏生(210002 南京军区军事医学研究所)； 潘英(210002 南京军区军事医学研究所)； 许祥裕(210002 南京军区军事医学研究所)； 沈月(210002 南京军区军事医学研究所)； 王刚(南京儿童医院神经外科)；范毓华(南京儿童医院神经外科)；智刚 (美国西南医学中心)；Kim S Lau(美国西南医学中心)；James T Stull(美国西南医学中心)
关键词：一氧化氮合酶；RNA；信使；肌营养不良
中华儿科杂志000212 【摘要】 目的 检测正常人与Duchenne 肌营养不良症(DMD)患儿肌肉中脑型一氧化氮合酶(nNOS )mRNA及其蛋白的表达水平。方法 建立高敏感性的RNA酶保护实验, 并通过Western blot分析的方法，对10例DMD肌肉标本和5例正常儿童肌肉标本中nNOS mRNA及其蛋白表达情况进行检测。结果 DMD患儿肌肉中nNOS mRNA的表达量只有正常肌肉的10%, nNOS蛋白亦有相同的表达规律。结论 nNOS蛋白在DMD肌肉细胞和肌膜上呈低含量，是由于nNOS在转录水平上合成减少所致。
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Differential expression of nNOS mRNA and nNOS protein in normal and Duchenne muscular dystrophic muscles
ZHU Minsheng PAN Ying WANG Gang et al.
Nanjing Military Institute of Medical Sciences, Nanjing 210002, China
【Abstract】 Objective To compare the expression level of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) mRNA and nNOS protein in normal and Duchenne muscular dystrophy (DMD)muscles. Methods The authors developed modified highly sensitive RNase protection assay and western blot assay, and thereby determined nNOS mRNA and its protein in skeletal muscles of 10 DMD patients and 5 normal control children. Results The results showed that the expression of nNOS mRNA in DMD muscles was only 10% of that in normal muscles. Accordingly, nNOS protein expression level in DMD muscles was also significantly lower than that in normal muscles. Conclusion The decrease of nNOS protein in skeletal muscles of DMD patients may be due to low expression of nNOS mRNA at transcription level.
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【Key words】 Nitric-oxide synthase; RNA, messenger; Muscular dystrophy
Duchenne肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophic，DMD)是一种常见的儿科遗传病,主要病因是由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin)先天缺陷[1，2]。主要病理过程为肌肉纤维进行性萎缩变性,坏死和脂肪填充。dystrophin是一个膜结构蛋白,近年来发现它能与脑型一氧化氮合酶(neuronal nitric synthase, nNOS)通过GLGF氨基酸序列相结合,并将nNOS锚定于肌膜上。 当dystrophin缺乏时, 这种结合丧失或减弱[1-3 ],此时, nNOS仅存在于肌纤维胞质中,有人认为这种游离形式的nNOS可能与DMD损伤有关[4] 。但人们又发现在mdx小鼠(已先天剔除dystrophin)的肌肉中,不但nNOS在肌膜上消失,而且 nNOS mRNA也逐渐减少[5] 。 这就提示游离形式的nNOS亦会随之减少,难以成为DMD损伤的重要因素。由于动物模型和人往往存在着多方面的差别,在人DMD肌肉中nNOS的表达情况如何是值得探讨的问题。由于nNOS mRNA在组织中的丰度很低且标本取材受限,测定其mRNA水平较难。我们通过改良,建立了高敏感性的RNase保护实验,成功地比较了nNOS 蛋白和mRNA在正常儿童和DMD肌肉中表达水平,为研究nNOS在DMD损伤中的作用提供了依据。
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材料和方法
一、材料
1.主要酶、蛋白、DNA及试剂: 各种分子生物学工具酶购于Promega公司、华美试剂和Fluka公司；地高辛标记的RNA合成混合物、碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体和酶底物购于宝灵曼公司；Zeta尼龙膜购于BioRad公司；大肠杆菌tRNA、硫酸葡聚糖、甲酰胺购于华美公司,其他试剂购于Sigma公司和国产分析纯试剂。
2.质粒和细菌: pCMV/nNOS:由美国西南医学中心Kim S Lau提供,该质粒含有大鼠nNOS的全长cDNA。 pGEM3z购于Promega 公司； pGEM/actin质粒由智刚教授提供；JM109细菌由本室保存。
3. 肌肉标本来源及临床资料:10例DMD腓肠肌标本均来源于南京市儿童医院,年龄4～12岁,男性。经临床诊断,病理活检和肌电图诊断为DMD,5例正常儿童腓肠肌标本分别为南京市儿童医院和江苏省人民医院正常的外伤儿童的新鲜标本。
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二、方法
1.PCR、体外转录等基本操作按分子克隆手册[6] 进行。
2.RNA的提取:采用一步法[7]提取RNA 。
3.改良RNase 保护实验:首先制备RNA探针。用PCR方法扩增nNOS特异性序列( 701-881aa),再将扩增产物克隆入pGEM3z中,经线性化后得到模板DNA,按宝灵曼公司的产品说明书进行各种RNA探针的制备。将1 μg地高辛标记的RNA探针与不同剂量的样品RNA混合溶解在杂交液中(40 mmol/L、 pH 6.4, EDTA 1 mmol/L、pH 8.0, NaCl 0.4 mol/L, 80% 甲酰胺), 80℃孵育10 min后,置于50℃杂交至少4 h。向杂交后孵育液中加入300 μl的RNase/DNase I消化液(RNase 40 μg/ml, DNase I 5 U/ml, EDTA 5 mmol/L、 pH 7.5, Tris Cl 10 mmol/L、 pH 7.4, NaCl 300 mmol/L), 在30℃孵育60 min,酚氯仿抽提1次后,通过狭缝印迹转移到Zeta尼龙膜上,用TBST洗膜,TBST/5% 奶粉封闭,然后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体Fab孵育,NBT/BCIP作底物液显色。
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4. Western blot 分析:参见我们以前采用的ECL化学发光法[8]。
5. nNOS RNA探针的制备:按我们以前的报道扩增nNOS特异性基因片段[9],将此片段用Xho Ⅰ和BamH Ⅰ酶切,与已用相同酶酶切的pGEM3z载体连接,筛选得到重组质粒DNA,再用BamH Ⅰ或Xho Ⅰ单酶切,即得到可供体外转录的DNA模板。当用T7 RNA聚合酶时可得到nNOS的反义RNA探针,用以检测nNOS 的mRNA；当用SP6 RNA聚合酶时即得到nNOS有义RNA探针,用作阴性对照。 alpha-actin线性模板由T7 RNA聚合酶转录后得到反义探针,用于RNA检测的内标准。
结果
一、nNOS mRNA 在DMD和正常肌肉中的表达
将不同剂量的正常腓肠肌的RNA样品与nNOS反义RNA探针杂交,杂交后转移到尼龙膜上进行常规免疫检测。实验结果表明:当正常肌肉RNA样品量为10 μg时可检测到很强的阳性信号,当RNA样品量为0.1 μg时亦可检测到明显的阳性信号,通过黑度扫描可以发现样品量与杂交信号有良好的线性关系。 将DMD样品RNA也按梯度稀释进行杂交,发现DMD肌肉中的mRMA水平明显低于正常对照,尤其是上样量为0.5 μg时这种差别更为易见。另外,当用细菌tRNA代替样品RNA时，未见明显的杂交信号,用有义RNA探针时亦未见任何杂交信号,说明该改良的杂交方法为特异性杂交。
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为了定量比较nNOS mRNA的差别,我们在以下的实验中上样量均为0.5 μg,通过扫描的方法定量测得各组的相对百分比,经计算测得DMD肌肉中mRNA的表达量仅为正常肌肉的(10±2.6)%,差异有显著意义(P<0.01)。
二、nNOS 蛋白在DMD肌肉中的表达
将肌肉组织匀浆,直接加入载样缓冲液,进行SDS-PAGE电泳、膜转移,用nNOS抗体[10]作为一抗进行Western blot 分析。结果可见正常肌肉中有明显的nNOS蛋白阳性带,而DMD组的蛋白阳性带不明显。
讨论
NO是一个性质极为活泼的自由基信使分子,在信号传导,自由基损伤等过程中发挥着重要作用。NOS主要由三种NOS同功酶合成，NOS的含量变化与NO的产量直接相关[11]。在正常横纹肌肌膜,肌结头等处含有大量的nNOS,而DMD时含量明显减少[3-5],这就提示nNOS在横纹肌功能和DMD损伤的过程中可能起重要作用。我们通过Western blot的方法亦证实，DMD肌肉中的nNOS含量明显减少。这种减少有人认为nNOS膜转运失常所致。我们的研究结果证实，人DMD肌肉中的nNOS mRNA水平明显低于正常组,且nNOS蛋白的表达亦有相似的规律，这一结果与mdx动物实验的结果[5]是一致的。这也就提示:DMD肌肉中nNOS的减少可能是由于nNOS在转录水平合成降低所致,而并不是向膜外转运障碍引起的。
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目前已发现,肌肉细胞中还存在有营养不良的补偿蛋白[12，13] ,如Utrophin等类似蛋白。该蛋白的N端亦含有GLGF氨基酸序列,能与nNOS结合，当营养不良蛋白缺乏时可代替nNOS的膜转运过程,这一事实亦支持上述推论。
Bredt[4]1996年提出,在DMD进行性损伤过程中,由于nNOS的转运障碍,导致肌肉纤维中NO产量过高,NO与O2形成强毒性的过氧化氮自由基,进而引起DMD进行性损伤。根据本结果和已往报道,这一假说是难以成立的。
nNOS mRNA在细胞中的表达速度非常低,加上临床取材量少,检测mRNA水平非常困难.我们曾用常规的Northern blot和RNase 保护实验,均未检测成功。本次将RNase保护实验进行改良后,敏感性大大提高。改良后的方法具有简便,不需同位素,敏感性高以及易于定量分析等优点,对检测低丰度RNA水平尤为适用。
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参考文献
[1]Koenig M, Monaco AP, Kunkel LM. The complete sequence of systrophin pridicts a rod-shaped cytoskeltal protein. Cell ， 1988，53:219-226.
[2]Ibraghimov-Beskrovnaya O, Ervasti JM, Leveille CJ, et al. Primary structure of dystrophin-associated glycoproteins linking dystrophin to the extra cellular matrix. Nature， 1992,355:696-702.
[3]Brenman JE, Chao DS, Xia H, et al. Nitric oxide synthase complexed with dystrophin in and absent from skeletal muscles sarcolemma in Duchenne musculat dystrophy. Cell， 1995,82:743-752.
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[4]Bredt DS. Targeting nitric oxide to its target. PSEBM ， 1996, 211: 41-48.
[5]Chang WJ, Iannaccone ST, Lau KS, et al. Neuronal nitric oxide synthase and dystrophin-deficient muscular dystrophy. PNAS USA ，1996, 93: 9142-9147.
[6]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: CSH press, 1989,14.5-14.20.
[7]Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation bu acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987, 162: 156-159.
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[8]朱敏生,沈月, 许祥裕，等. 细胞性一氧化氮供体的建立及其对肿瘤细胞凋亡的诱导效应. 中华微生物和免疫学杂志 ， 1998,18:197-201.
[9]朱敏生, 沈月, 许祥裕,等. 脑型一氧化氮合酶的钙调蛋白结合区的表达及活性鉴定. 生物工程学报， 1998,14:276-280.
[10]陈强,朱敏生,沈月，等.nNOS特异性片段的重组表达及特异性抗体的制备.中国免疫学杂志，1998,3.15：71-73.
[11]Lowenstein CJ, Synder SH. Nitric oxide, a novel biologic messenger. Cell，1992, 70: 705-707.
[12]朱敏生, 许祥裕,沈月，等. 脑型一氧化氮合酶在Duchenne进行性肌营养不良肌肉中的表达特征. 江苏医药 ，1998,24增刊：285-286.
[13]Compbell KP, Crosbie RH. Muscular dystrophy: utrophin to the rescue. Nature， 1996,384:308-309.
收稿日期：1999-01-08, 百拇医药
单位：朱敏生(210002 南京军区军事医学研究所)； 潘英(210002 南京军区军事医学研究所)； 许祥裕(210002 南京军区军事医学研究所)； 沈月(210002 南京军区军事医学研究所)； 王刚(南京儿童医院神经外科)；范毓华(南京儿童医院神经外科)；智刚 (美国西南医学中心)；Kim S Lau(美国西南医学中心)；James T Stull(美国西南医学中心)
关键词：一氧化氮合酶；RNA；信使；肌营养不良
中华儿科杂志000212 【摘要】 目的 检测正常人与Duchenne 肌营养不良症(DMD)患儿肌肉中脑型一氧化氮合酶(nNOS )mRNA及其蛋白的表达水平。方法 建立高敏感性的RNA酶保护实验, 并通过Western blot分析的方法，对10例DMD肌肉标本和5例正常儿童肌肉标本中nNOS mRNA及其蛋白表达情况进行检测。结果 DMD患儿肌肉中nNOS mRNA的表达量只有正常肌肉的10%, nNOS蛋白亦有相同的表达规律。结论 nNOS蛋白在DMD肌肉细胞和肌膜上呈低含量，是由于nNOS在转录水平上合成减少所致。
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Differential expression of nNOS mRNA and nNOS protein in normal and Duchenne muscular dystrophic muscles
ZHU Minsheng PAN Ying WANG Gang et al.
Nanjing Military Institute of Medical Sciences, Nanjing 210002, China
【Abstract】 Objective To compare the expression level of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) mRNA and nNOS protein in normal and Duchenne muscular dystrophy (DMD)muscles. Methods The authors developed modified highly sensitive RNase protection assay and western blot assay, and thereby determined nNOS mRNA and its protein in skeletal muscles of 10 DMD patients and 5 normal control children. Results The results showed that the expression of nNOS mRNA in DMD muscles was only 10% of that in normal muscles. Accordingly, nNOS protein expression level in DMD muscles was also significantly lower than that in normal muscles. Conclusion The decrease of nNOS protein in skeletal muscles of DMD patients may be due to low expression of nNOS mRNA at transcription level.
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【Key words】 Nitric-oxide synthase; RNA, messenger; Muscular dystrophy
Duchenne肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophic，DMD)是一种常见的儿科遗传病,主要病因是由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin)先天缺陷[1，2]。主要病理过程为肌肉纤维进行性萎缩变性,坏死和脂肪填充。dystrophin是一个膜结构蛋白,近年来发现它能与脑型一氧化氮合酶(neuronal nitric synthase, nNOS)通过GLGF氨基酸序列相结合,并将nNOS锚定于肌膜上。 当dystrophin缺乏时, 这种结合丧失或减弱[1-3 ],此时, nNOS仅存在于肌纤维胞质中,有人认为这种游离形式的nNOS可能与DMD损伤有关[4] 。但人们又发现在mdx小鼠(已先天剔除dystrophin)的肌肉中,不但nNOS在肌膜上消失,而且 nNOS mRNA也逐渐减少[5] 。 这就提示游离形式的nNOS亦会随之减少,难以成为DMD损伤的重要因素。由于动物模型和人往往存在着多方面的差别,在人DMD肌肉中nNOS的表达情况如何是值得探讨的问题。由于nNOS mRNA在组织中的丰度很低且标本取材受限,测定其mRNA水平较难。我们通过改良,建立了高敏感性的RNase保护实验,成功地比较了nNOS 蛋白和mRNA在正常儿童和DMD肌肉中表达水平,为研究nNOS在DMD损伤中的作用提供了依据。
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材料和方法
一、材料
1.主要酶、蛋白、DNA及试剂: 各种分子生物学工具酶购于Promega公司、华美试剂和Fluka公司；地高辛标记的RNA合成混合物、碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体和酶底物购于宝灵曼公司；Zeta尼龙膜购于BioRad公司；大肠杆菌tRNA、硫酸葡聚糖、甲酰胺购于华美公司,其他试剂购于Sigma公司和国产分析纯试剂。
2.质粒和细菌: pCMV/nNOS:由美国西南医学中心Kim S Lau提供,该质粒含有大鼠nNOS的全长cDNA。 pGEM3z购于Promega 公司； pGEM/actin质粒由智刚教授提供；JM109细菌由本室保存。
3. 肌肉标本来源及临床资料:10例DMD腓肠肌标本均来源于南京市儿童医院,年龄4～12岁,男性。经临床诊断,病理活检和肌电图诊断为DMD,5例正常儿童腓肠肌标本分别为南京市儿童医院和江苏省人民医院正常的外伤儿童的新鲜标本。
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二、方法
1.PCR、体外转录等基本操作按分子克隆手册[6] 进行。
2.RNA的提取:采用一步法[7]提取RNA 。
3.改良RNase 保护实验:首先制备RNA探针。用PCR方法扩增nNOS特异性序列( 701-881aa),再将扩增产物克隆入pGEM3z中,经线性化后得到模板DNA,按宝灵曼公司的产品说明书进行各种RNA探针的制备。将1 μg地高辛标记的RNA探针与不同剂量的样品RNA混合溶解在杂交液中(40 mmol/L、 pH 6.4, EDTA 1 mmol/L、pH 8.0, NaCl 0.4 mol/L, 80% 甲酰胺), 80℃孵育10 min后,置于50℃杂交至少4 h。向杂交后孵育液中加入300 μl的RNase/DNase I消化液(RNase 40 μg/ml, DNase I 5 U/ml, EDTA 5 mmol/L、 pH 7.5, Tris Cl 10 mmol/L、 pH 7.4, NaCl 300 mmol/L), 在30℃孵育60 min,酚氯仿抽提1次后,通过狭缝印迹转移到Zeta尼龙膜上,用TBST洗膜,TBST/5% 奶粉封闭,然后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体Fab孵育,NBT/BCIP作底物液显色。
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4. Western blot 分析:参见我们以前采用的ECL化学发光法[8]。
5. nNOS RNA探针的制备:按我们以前的报道扩增nNOS特异性基因片段[9],将此片段用Xho Ⅰ和BamH Ⅰ酶切,与已用相同酶酶切的pGEM3z载体连接,筛选得到重组质粒DNA,再用BamH Ⅰ或Xho Ⅰ单酶切,即得到可供体外转录的DNA模板。当用T7 RNA聚合酶时可得到nNOS的反义RNA探针,用以检测nNOS 的mRNA；当用SP6 RNA聚合酶时即得到nNOS有义RNA探针,用作阴性对照。 alpha-actin线性模板由T7 RNA聚合酶转录后得到反义探针,用于RNA检测的内标准。
结果
一、nNOS mRNA 在DMD和正常肌肉中的表达
将不同剂量的正常腓肠肌的RNA样品与nNOS反义RNA探针杂交,杂交后转移到尼龙膜上进行常规免疫检测。实验结果表明:当正常肌肉RNA样品量为10 μg时可检测到很强的阳性信号,当RNA样品量为0.1 μg时亦可检测到明显的阳性信号,通过黑度扫描可以发现样品量与杂交信号有良好的线性关系。 将DMD样品RNA也按梯度稀释进行杂交,发现DMD肌肉中的mRMA水平明显低于正常对照,尤其是上样量为0.5 μg时这种差别更为易见。另外,当用细菌tRNA代替样品RNA时，未见明显的杂交信号,用有义RNA探针时亦未见任何杂交信号,说明该改良的杂交方法为特异性杂交。
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为了定量比较nNOS mRNA的差别,我们在以下的实验中上样量均为0.5 μg,通过扫描的方法定量测得各组的相对百分比,经计算测得DMD肌肉中mRNA的表达量仅为正常肌肉的(10±2.6)%,差异有显著意义(P<0.01)。
二、nNOS 蛋白在DMD肌肉中的表达
将肌肉组织匀浆,直接加入载样缓冲液,进行SDS-PAGE电泳、膜转移,用nNOS抗体[10]作为一抗进行Western blot 分析。结果可见正常肌肉中有明显的nNOS蛋白阳性带,而DMD组的蛋白阳性带不明显。
讨论
NO是一个性质极为活泼的自由基信使分子,在信号传导,自由基损伤等过程中发挥着重要作用。NOS主要由三种NOS同功酶合成，NOS的含量变化与NO的产量直接相关[11]。在正常横纹肌肌膜,肌结头等处含有大量的nNOS,而DMD时含量明显减少[3-5],这就提示nNOS在横纹肌功能和DMD损伤的过程中可能起重要作用。我们通过Western blot的方法亦证实，DMD肌肉中的nNOS含量明显减少。这种减少有人认为nNOS膜转运失常所致。我们的研究结果证实，人DMD肌肉中的nNOS mRNA水平明显低于正常组,且nNOS蛋白的表达亦有相似的规律，这一结果与mdx动物实验的结果[5]是一致的。这也就提示:DMD肌肉中nNOS的减少可能是由于nNOS在转录水平合成降低所致,而并不是向膜外转运障碍引起的。
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目前已发现,肌肉细胞中还存在有营养不良的补偿蛋白[12，13] ,如Utrophin等类似蛋白。该蛋白的N端亦含有GLGF氨基酸序列,能与nNOS结合，当营养不良蛋白缺乏时可代替nNOS的膜转运过程,这一事实亦支持上述推论。
Bredt[4]1996年提出,在DMD进行性损伤过程中,由于nNOS的转运障碍,导致肌肉纤维中NO产量过高,NO与O2形成强毒性的过氧化氮自由基,进而引起DMD进行性损伤。根据本结果和已往报道,这一假说是难以成立的。
nNOS mRNA在细胞中的表达速度非常低,加上临床取材量少,检测mRNA水平非常困难.我们曾用常规的Northern blot和RNase 保护实验,均未检测成功。本次将RNase保护实验进行改良后,敏感性大大提高。改良后的方法具有简便,不需同位素,敏感性高以及易于定量分析等优点,对检测低丰度RNA水平尤为适用。
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参考文献
[1]Koenig M, Monaco AP, Kunkel LM. The complete sequence of systrophin pridicts a rod-shaped cytoskeltal protein. Cell ， 1988，53:219-226.
[2]Ibraghimov-Beskrovnaya O, Ervasti JM, Leveille CJ, et al. Primary structure of dystrophin-associated glycoproteins linking dystrophin to the extra cellular matrix. Nature， 1992,355:696-702.
[3]Brenman JE, Chao DS, Xia H, et al. Nitric oxide synthase complexed with dystrophin in and absent from skeletal muscles sarcolemma in Duchenne musculat dystrophy. Cell， 1995,82:743-752.
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[6]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: CSH press, 1989,14.5-14.20.
[7]Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation bu acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987, 162: 156-159.
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[8]朱敏生,沈月, 许祥裕，等. 细胞性一氧化氮供体的建立及其对肿瘤细胞凋亡的诱导效应. 中华微生物和免疫学杂志 ， 1998,18:197-201.
[9]朱敏生, 沈月, 许祥裕,等. 脑型一氧化氮合酶的钙调蛋白结合区的表达及活性鉴定. 生物工程学报， 1998,14:276-280.
[10]陈强,朱敏生,沈月，等.nNOS特异性片段的重组表达及特异性抗体的制备.中国免疫学杂志，1998,3.15：71-73.
[11]Lowenstein CJ, Synder SH. Nitric oxide, a novel biologic messenger. Cell，1992, 70: 705-707.
[12]朱敏生, 许祥裕,沈月，等. 脑型一氧化氮合酶在Duchenne进行性肌营养不良肌肉中的表达特征. 江苏医药 ，1998,24增刊：285-286.
[13]Compbell KP, Crosbie RH. Muscular dystrophy: utrophin to the rescue. Nature， 1996,384:308-309.
收稿日期：1999-01-08, 百拇医药