肺炎患儿肺炎衣原体感染情况的研究
作者：傅文永 杨思睿 鲁继荣 成焕吉 刘桂英 孙景辉 宋丽君
单位：傅文永 杨思睿 鲁继荣 成焕吉 刘桂英 孙景辉 宋丽君(130021 长春，白求恩医科大学第一临床学院儿科)
关键词：
中华儿科杂志000315
随着人们认识的深入，肺炎衣原体已被公认为人类急性呼吸道感染的重要病原。为了解长春地区儿童肺炎衣原体感染状况，探讨协助临床诊断的方法，我们采用细胞培养及微量免疫荧光试验两种方法，对肺炎患儿进行肺炎衣原体的检测，现将结果报告如下。
对象和方法
1.病例选择：1997年2月～1997年8月，在我科住院的1个月～14岁患儿共87例，诊断均符合肺炎的诊断标准[1]。其中3岁以上患儿46例，3岁及以下患儿41例；男35例，女52例。同期采集儿外科2周内无呼吸道感染病史患儿(1个月～14岁)23例作为正常对照。
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2.标本的处理：(1)鼻咽分泌物的采集及处理：在入院24h内，应用抗生素之前，用无菌棉签刮取患儿咽部上皮细胞，并立即洗脱入蔗糖磷酸盐运送培养基，用冰盒运送到4℃的冰箱中备用。(2)血液采集及处理：第1份血于发病第1周内采集；第2份血于病程3～4周采集，每份血液标本离心1 500 r/min，取血清，-20℃冻存备用。
3.肺炎衣原体的培养：Hep-2细胞在螺口的单层细胞管中生长成良好的单层后，将生长液弃去，用PBS洗1次，取患儿标本各0.2 ml分别加入3支单层细胞管中，3 000 r/min离心60 min，置于37℃ 5% CO2孵箱中2 h，去上清，加入肺炎衣原体生长培养基1 ml(含10%胎牛血清的改良MEM培养基，加链霉素100 U/ml)。置同样条件的孵箱中72 h后取出1管鉴定，如阳性，将第2管传代培养72 h，仍阳性者-70℃冻存；原始培养阴性者，将第2管再传1代，阳性者冻存，阴性者弃之。每次接种标本同时设阴性对照。
, 百拇医药 4.肺炎衣原体鉴定：采用间接免疫荧光法鉴定。取出培养管中的小盖玻片，用PBS轻洗后干燥，丙酮固定10 min，加入单克隆抗体(北京协和医院血清室赠)，37℃湿孵30min，PBS冲洗后加入FITC标记的羊抗鼠IgG后，PBS冲洗，在日本OLYMPUS荧光显微镜下观察，阳性者可以看到致密的黄绿色荧光包涵体。
5.血清特异性IgG、IgM的测定：采用微量免疫荧光法检测。抗原板由北京协和医院血清室提供，用Wang等[2]描述的方法检测肺炎衣原体的IgG和IgM。IgG从1∶16开始稀释，IgM 从1∶4开始稀释，结合物是兔抗人IgG和兔抗人IgM荧光抗体(DAKO公司)。荧光显微镜下暗本底上可见散布均匀的针尖大小密集的黄绿色荧光颗粒为滴定终点。IgM阳性血清标本检测类风湿因子(上海医学化验所乳胶试剂盒)。肺炎衣原体急性感染的血清学诊断标准(有下列任一项即可诊断)：(1)双份血清抗体IgG或IgM升高4倍及以上；(2)IgM≥1∶16；(3) IgG≥1∶512。既往感染诊断标准1∶16≤IgG<1∶512。
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结果
1.肺炎组87例肺炎患儿鼻咽分泌物肺炎衣原体的分离结果为11例阳性，阳性率13 %，其中年龄最小11个月，最大14岁。3岁以上儿童6例，阳性率13%(6/46)，3岁及以下儿童5例，阳性率12%(5/41)。两者差异无显著意义(表1)。男5例，阳性率14%(5/35)，女性6例，阳性率11%(6/52)，差异无显著意义。23例正常对照结果均为阴性。
表1 肺炎衣原体分离阳性病例的年龄分布 年龄(岁)
检测例数
阳性例数
阳性率(%)
<1
12
, 百拇医药
1
8
～3
29
4
14
～6
21
2
10
～14
25
4
15
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合计
87
11
13
2. 87例肺炎患者中有84例收集到早期单份血清或者双份血清，23例可诊断为既往和(或)急性感染，总阳性率27%(23/84)，其中19例可诊断有既往感染，阳性率23%(19/84)；9例可诊断为急性感染，阳性率10%(9/84)，在分离阳性的11例标本中，有8例符合急性感染的诊断标准。23例正常对照患儿血清学有4例符合既往感染诊断标准，阳性率17%。IgM阳性者检测类风湿因子均阴性。
讨论
肺炎衣原体是新近命名的一种病原体，除可导致上呼吸道感染、支气管炎、肺炎、哮喘等呼吸道疾病外，又与人类的许多非呼吸道疾病如心内膜炎，结节性红斑、肝炎、脑炎、等相关[3]。但其培养困难，在一定程度上限制了人们对其进一步研究。目前，在建立敏感的细胞培养体系、基因表达方式、动物模型等方面尚待开发。在我国，其感染率、发病率、流行规律等均有待明确。细胞培养法目前仍被认为是证实肺炎衣原体存在的“金标准”，由于其肺炎衣原体命力脆弱，采集、运送及保存的条件要求高，可能是导致分离临床标本容易失败的重要原因。我们认为，在对临床标本进行分离时，充分刮取到鼻咽部的上皮细胞并避免隔夜冻存是保证成功的关键，在接种后的质量控制是比较容易的。在11例分离阳性的病例中无明显的年龄及性别差异，这一结果与以往认为的肺炎衣原体感染多发生于年长儿童及成人的观点不尽一致。在分离培养阳性的11例中，有8例通过血清学检测确定为肺炎衣原体急性感染，有1例未采到血清，另外2例微量免疫荧光试验阴性，考虑有2种可能：(1)肺炎由其他病原引起，肺炎衣原体在患儿的鼻咽部只是处于携带状态。(2)肺炎衣原体为患儿肺炎的致病原，但尚未引起血清中抗体的升高。两例微量免疫荧光试验阴性的血清均采自1岁左右儿童，年龄小，初次感染概率很大，血清均采自发病1周以内，故抗体尚未升高的可能性很大。我们在实验中发现，如果仅检测发病1周内的单份血清，既使同时检测IgG和IgM，阳性率也很低，仅有5例可诊断急性感染，这可能与婴幼儿初次感染的概率较大有关，已有报道证实肺炎衣原体初次感染抗体产生迟缓[4]。由于细胞培养的条件要求较高且费时费力，不宜做为常规检测手段，用微量免疫荧光试验检测有时会因抗体产生迟缓而有可能会导致阳性率偏低，因此，应尽快建立一种更有效的适于儿科临床的早期诊断方法。肺炎组血清学既往感染率为23%，对照组既往感染率为17%，差异无显著意义(χ2=0.3，P>0.1)；肺炎组用两种方法检测结果可说明近期急性感染率在10%以上，从而可以看出在长春地区肺炎衣原体的感染是非常普遍的，在儿童中有近1/5的儿童有过既往感染，有10%左右的儿童肺炎是由肺炎衣原体引起的。有报道肺炎衣原体每隔4年左右有一次流行高峰，持续1～2年，因此，加强流行病学调查，监测其流行状况，以有针对性地采取一些防治措施是非常有必要的。Verkoyen等[5]报道类风湿因子的出现与年龄相关，30岁以下为0；31～50岁为 5%；51～70 岁为14%。本实验中，IgM阳性的血清中也未检测出类风湿因子。
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参考文献
1，中华人民共和国卫生部.小儿肺炎防治方案.中华儿科杂志,1987,25:47-49.
2，Wang SP, Kuo CC, Grayston JT. Formalinized chlamydia trachomatis organisms as antigen in the micro-immunofluorescence test.J Cli Microbiol, 1979,10:259-263.
3，饶贤才.肺炎衣原体研究进展.人兽共患病杂志, 1994,10:46-49.
4，Mandell Gl, Benneff JE, Dolin R. Principles and practice of infection diseases. 4th ed. New York: Clurchill Ivingstone, 1995.1696-1698.
5，Verkoyen RP, Hazenberg MA, Vanhaaren CH, et al. Age-related interferance with chlamydia pnumoniae Microimm-unofluorescence serology due to circulating rheumatoid factor. J Cli Microbiol, 1992,30:1287-1290.
(收稿日期：1999-05-25), 百拇医药
单位：傅文永 杨思睿 鲁继荣 成焕吉 刘桂英 孙景辉 宋丽君(130021 长春，白求恩医科大学第一临床学院儿科)
关键词：
中华儿科杂志000315
随着人们认识的深入，肺炎衣原体已被公认为人类急性呼吸道感染的重要病原。为了解长春地区儿童肺炎衣原体感染状况，探讨协助临床诊断的方法，我们采用细胞培养及微量免疫荧光试验两种方法，对肺炎患儿进行肺炎衣原体的检测，现将结果报告如下。
对象和方法
1.病例选择：1997年2月～1997年8月，在我科住院的1个月～14岁患儿共87例，诊断均符合肺炎的诊断标准[1]。其中3岁以上患儿46例，3岁及以下患儿41例；男35例，女52例。同期采集儿外科2周内无呼吸道感染病史患儿(1个月～14岁)23例作为正常对照。
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2.标本的处理：(1)鼻咽分泌物的采集及处理：在入院24h内，应用抗生素之前，用无菌棉签刮取患儿咽部上皮细胞，并立即洗脱入蔗糖磷酸盐运送培养基，用冰盒运送到4℃的冰箱中备用。(2)血液采集及处理：第1份血于发病第1周内采集；第2份血于病程3～4周采集，每份血液标本离心1 500 r/min，取血清，-20℃冻存备用。
3.肺炎衣原体的培养：Hep-2细胞在螺口的单层细胞管中生长成良好的单层后，将生长液弃去，用PBS洗1次，取患儿标本各0.2 ml分别加入3支单层细胞管中，3 000 r/min离心60 min，置于37℃ 5% CO2孵箱中2 h，去上清，加入肺炎衣原体生长培养基1 ml(含10%胎牛血清的改良MEM培养基，加链霉素100 U/ml)。置同样条件的孵箱中72 h后取出1管鉴定，如阳性，将第2管传代培养72 h，仍阳性者-70℃冻存；原始培养阴性者，将第2管再传1代，阳性者冻存，阴性者弃之。每次接种标本同时设阴性对照。
, 百拇医药 4.肺炎衣原体鉴定：采用间接免疫荧光法鉴定。取出培养管中的小盖玻片，用PBS轻洗后干燥，丙酮固定10 min，加入单克隆抗体(北京协和医院血清室赠)，37℃湿孵30min，PBS冲洗后加入FITC标记的羊抗鼠IgG后，PBS冲洗，在日本OLYMPUS荧光显微镜下观察，阳性者可以看到致密的黄绿色荧光包涵体。
5.血清特异性IgG、IgM的测定：采用微量免疫荧光法检测。抗原板由北京协和医院血清室提供，用Wang等[2]描述的方法检测肺炎衣原体的IgG和IgM。IgG从1∶16开始稀释，IgM 从1∶4开始稀释，结合物是兔抗人IgG和兔抗人IgM荧光抗体(DAKO公司)。荧光显微镜下暗本底上可见散布均匀的针尖大小密集的黄绿色荧光颗粒为滴定终点。IgM阳性血清标本检测类风湿因子(上海医学化验所乳胶试剂盒)。肺炎衣原体急性感染的血清学诊断标准(有下列任一项即可诊断)：(1)双份血清抗体IgG或IgM升高4倍及以上；(2)IgM≥1∶16；(3) IgG≥1∶512。既往感染诊断标准1∶16≤IgG<1∶512。
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结果
1.肺炎组87例肺炎患儿鼻咽分泌物肺炎衣原体的分离结果为11例阳性，阳性率13 %，其中年龄最小11个月，最大14岁。3岁以上儿童6例，阳性率13%(6/46)，3岁及以下儿童5例，阳性率12%(5/41)。两者差异无显著意义(表1)。男5例，阳性率14%(5/35)，女性6例，阳性率11%(6/52)，差异无显著意义。23例正常对照结果均为阴性。
表1 肺炎衣原体分离阳性病例的年龄分布 年龄(岁)
检测例数
阳性例数
阳性率(%)
<1
12
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1
8
～3
29
4
14
～6
21
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10
～14
25
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合计
87
11
13
2. 87例肺炎患者中有84例收集到早期单份血清或者双份血清，23例可诊断为既往和(或)急性感染，总阳性率27%(23/84)，其中19例可诊断有既往感染，阳性率23%(19/84)；9例可诊断为急性感染，阳性率10%(9/84)，在分离阳性的11例标本中，有8例符合急性感染的诊断标准。23例正常对照患儿血清学有4例符合既往感染诊断标准，阳性率17%。IgM阳性者检测类风湿因子均阴性。
讨论
肺炎衣原体是新近命名的一种病原体，除可导致上呼吸道感染、支气管炎、肺炎、哮喘等呼吸道疾病外，又与人类的许多非呼吸道疾病如心内膜炎，结节性红斑、肝炎、脑炎、等相关[3]。但其培养困难，在一定程度上限制了人们对其进一步研究。目前，在建立敏感的细胞培养体系、基因表达方式、动物模型等方面尚待开发。在我国，其感染率、发病率、流行规律等均有待明确。细胞培养法目前仍被认为是证实肺炎衣原体存在的“金标准”，由于其肺炎衣原体命力脆弱，采集、运送及保存的条件要求高，可能是导致分离临床标本容易失败的重要原因。我们认为，在对临床标本进行分离时，充分刮取到鼻咽部的上皮细胞并避免隔夜冻存是保证成功的关键，在接种后的质量控制是比较容易的。在11例分离阳性的病例中无明显的年龄及性别差异，这一结果与以往认为的肺炎衣原体感染多发生于年长儿童及成人的观点不尽一致。在分离培养阳性的11例中，有8例通过血清学检测确定为肺炎衣原体急性感染，有1例未采到血清，另外2例微量免疫荧光试验阴性，考虑有2种可能：(1)肺炎由其他病原引起，肺炎衣原体在患儿的鼻咽部只是处于携带状态。(2)肺炎衣原体为患儿肺炎的致病原，但尚未引起血清中抗体的升高。两例微量免疫荧光试验阴性的血清均采自1岁左右儿童，年龄小，初次感染概率很大，血清均采自发病1周以内，故抗体尚未升高的可能性很大。我们在实验中发现，如果仅检测发病1周内的单份血清，既使同时检测IgG和IgM，阳性率也很低，仅有5例可诊断急性感染，这可能与婴幼儿初次感染的概率较大有关，已有报道证实肺炎衣原体初次感染抗体产生迟缓[4]。由于细胞培养的条件要求较高且费时费力，不宜做为常规检测手段，用微量免疫荧光试验检测有时会因抗体产生迟缓而有可能会导致阳性率偏低，因此，应尽快建立一种更有效的适于儿科临床的早期诊断方法。肺炎组血清学既往感染率为23%，对照组既往感染率为17%，差异无显著意义(χ2=0.3，P>0.1)；肺炎组用两种方法检测结果可说明近期急性感染率在10%以上，从而可以看出在长春地区肺炎衣原体的感染是非常普遍的，在儿童中有近1/5的儿童有过既往感染，有10%左右的儿童肺炎是由肺炎衣原体引起的。有报道肺炎衣原体每隔4年左右有一次流行高峰，持续1～2年，因此，加强流行病学调查，监测其流行状况，以有针对性地采取一些防治措施是非常有必要的。Verkoyen等[5]报道类风湿因子的出现与年龄相关，30岁以下为0；31～50岁为 5%；51～70 岁为14%。本实验中，IgM阳性的血清中也未检测出类风湿因子。
, http://www.100md.com
参考文献
1，中华人民共和国卫生部.小儿肺炎防治方案.中华儿科杂志,1987,25:47-49.
2，Wang SP, Kuo CC, Grayston JT. Formalinized chlamydia trachomatis organisms as antigen in the micro-immunofluorescence test.J Cli Microbiol, 1979,10:259-263.
3，饶贤才.肺炎衣原体研究进展.人兽共患病杂志, 1994,10:46-49.
4，Mandell Gl, Benneff JE, Dolin R. Principles and practice of infection diseases. 4th ed. New York: Clurchill Ivingstone, 1995.1696-1698.
5，Verkoyen RP, Hazenberg MA, Vanhaaren CH, et al. Age-related interferance with chlamydia pnumoniae Microimm-unofluorescence serology due to circulating rheumatoid factor. J Cli Microbiol, 1992,30:1287-1290.
(收稿日期：1999-05-25), 百拇医药