精制孢子丝菌素的研制及其诊断儿童孢子丝菌病的效果观察
作者：张亚芹 姜兰香 李钟洙 姜萍 张民夫 田锐沙 高继光
单位：张亚芹(130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科)；姜兰香(130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科)；李钟洙(130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科)；姜萍(130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科)；张民夫(130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科)田锐沙(130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科)高继光(东丰县中医院皮肤科)
关键词：
中华儿科杂志000419 我们研制出精制孢子丝菌素，并对46例孢子丝菌病患儿进行皮试观察，获满意结果，现报道如下。
临床资料：自1988～1996年临床诊为孢子丝菌病的患儿46例。其中男27例，女19例；白城地区28例，内蒙地区10例，长春地区8例；年龄最小3个月，最大14岁；病程最短2周，最长6年，平均病期为4个月；分型以固定型居多为32例，淋巴管型10例，皮肤播散型4例；发病部位以面部最多共43例，其中眼睑发病6例，四肢发病仅3例。皮损特点为炎性肉芽肿及皮下结节，其中1例为两次冷冻治疗复发的疣状增生。病例确诊依据为孢子丝菌素皮试、真菌培养及病理组织切片HE及PAS染色，临床特征及治疗效果综合判断。临床工作中遇有皮损似孢子丝菌病患儿，孢子丝菌素皮试阴性，病理组织切片排除孢子丝菌病患儿5例，形成自然对照组。皮肤癣菌病患儿20例，健康儿童30例。
, http://www.100md.com
孢子丝菌素的制备：(1)取我科真菌室保存的申克孢子丝菌菌种，无菌操作下划线法接种于8只250 ml茄瓶沙斜面培养基上，20℃培养2周，长出较厚菌膜用丙酮冲洗，2 h后吹干，获灭活的孢子丝菌干粉。参照真菌抗原提取法[1]，取5 g干粉加入250 ml柯卡提取液中，电动玻璃匀浆机研磨(8 000 r/min) 30 min，4℃磁力搅拌器提取72 h，孢子丝菌充分吸收后过滤，滤液透析24 h，校正pH为7.5，负压蔡氏滤器(0.2 μm)过滤除菌，获2倍稀释的孢子丝菌素制剂，4℃冰箱保存备用。(2)无菌测定：无菌操作下抽取上述抗原液分别接种于肉汤培养基及沙氏培养基上，20℃培养2周，观察无细菌及真菌生长。(3)毒力试验：取10只20 g体重的雄性小白鼠，5只每只腹腔内注入抗原液0.5 ml，另5只每只腹腔内注入生理盐水0.5 ml，喂养2周，小鼠生长良好，二组间无差异。(4)抗原效价测定：应用Lowry法测定2倍稀释抗原液，采用岛津UV-190型分光光度计测定750 nm的吸光度值，作标准曲线经换算得蛋白含量为60 μg/ml。(5)抗原液的最后稀释浓度为1∶100，1 ml/g分装后4℃冰箱保存备用。
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皮试及结果制定：(1)于前臂内侧皮内注射孢子丝菌素0.1 ml，48 h观察结果。(2)制定标准：阴性：与溶媒对照类似的帽针大小丘疹或红晕。可疑：直径小于0.5 cm的水肿性红斑。结果：46例中，孢子丝菌素皮试，真菌培养及病理检查皆做者共21例，不宜作病理检查者25例，孢子丝菌素皮试阳性者共45例，阳性率98%，真菌培养阳性者43例，病理检查为炎性肉芽肿；自然对照组、皮肤癣菌病20例、正常儿童30例皮试结果均阴性。全部确诊病例均予10%碘化钾溶液5～10 ml，每日3次口服，经2～4个月治愈，随访半年以上无复发。
讨论：孢子丝菌病是由申克孢子丝菌引起的慢性深部真菌病。主要侵犯皮肤及皮下组织，且可侵犯内脏器官。目前诊断该病常用的方法有：皮损渗出液涂片Gram及PAS染色镜检，直接镜检检出率低，据统计国内自1947～1996年已公开发表的1 647例该病患者中做直接镜检(需取组织块或患处脓液)费时长，至少需1～2周；而儿童患者有相当部分病例(占54.3%)不宜作病理检查。孢子丝菌素皮试快速、简便更适于儿童患者应用。孢子丝菌素的制备已经历了四个阶段：(1)标准的孢子丝菌素(相当于菌苗制备)[2]；(2)液体培养滤液[3]；(3)多糖衍生物的粗制剂[4]；(4)多肽抗原制剂[5]。本组即经历了第3阶段，一般认为人体感染申克孢子丝菌后5～15 d即可出现皮试阳性反应。因申克孢子的菌与白色念珠菌有相同的抗原决定簇，其相关系数为0.89%[6]，故用白色念珠菌吸收孢子丝菌素，从而有效地清除了二者间的交叉抗原性，故此孢子丝菌素具有高特异性，全部确诊病例皆通过各种手段，相互验证，结果可靠。故认为此方法可作为诊断儿童孢子丝菌病的首选方法之一。
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参考文献
1，张庆松,主编. 临床变态反应学. 上海: 上海科学技术出版社,1988.267-268.
2，Posada HR. Skin test with sporotrichin. Its sensitivity and specificity. Mycopathol Mycol Appl, 1968, 36: 42-53.
3，Costa Eo, Diniz LS, Netto CF, et al. Epidemiological study of sporotrichosis and histoplasmosis in captive Latin American wild mammals. Mycopathologia, 1994, 125: 19-22.
4，Toriello C, Arjona-Rosado LC, Diaz ML, et al. Efficiency of crude and purified fungal antigens in serodiagnosis to discriminate mycotic from other respiratory disease. Mycoses, 1991, 34: 133-140.
, 百拇医药
5，Ghosh A, Chakrabarti A, Sharma VK, et al. Sporotrichosis in Himachal Pradesh (north India). Trans R Soc Trop Med Hyg, 1999, 93: 41-45.
6，Stetle RW, Cannady PB Jr, Moore WL Jr, et al. Skin test and blastogenic responses to Sporotrichun Schenckii. J Clin Invest, 1976, 57: 156-160.
(收稿日期：1999-08-05), http://www.100md.com
单位：张亚芹(130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科)；姜兰香(130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科)；李钟洙(130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科)；姜萍(130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科)；张民夫(130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科)田锐沙(130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科)高继光(东丰县中医院皮肤科)
关键词：
中华儿科杂志000419 我们研制出精制孢子丝菌素，并对46例孢子丝菌病患儿进行皮试观察，获满意结果，现报道如下。
临床资料：自1988～1996年临床诊为孢子丝菌病的患儿46例。其中男27例，女19例；白城地区28例，内蒙地区10例，长春地区8例；年龄最小3个月，最大14岁；病程最短2周，最长6年，平均病期为4个月；分型以固定型居多为32例，淋巴管型10例，皮肤播散型4例；发病部位以面部最多共43例，其中眼睑发病6例，四肢发病仅3例。皮损特点为炎性肉芽肿及皮下结节，其中1例为两次冷冻治疗复发的疣状增生。病例确诊依据为孢子丝菌素皮试、真菌培养及病理组织切片HE及PAS染色，临床特征及治疗效果综合判断。临床工作中遇有皮损似孢子丝菌病患儿，孢子丝菌素皮试阴性，病理组织切片排除孢子丝菌病患儿5例，形成自然对照组。皮肤癣菌病患儿20例，健康儿童30例。
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孢子丝菌素的制备：(1)取我科真菌室保存的申克孢子丝菌菌种，无菌操作下划线法接种于8只250 ml茄瓶沙斜面培养基上，20℃培养2周，长出较厚菌膜用丙酮冲洗，2 h后吹干，获灭活的孢子丝菌干粉。参照真菌抗原提取法[1]，取5 g干粉加入250 ml柯卡提取液中，电动玻璃匀浆机研磨(8 000 r/min) 30 min，4℃磁力搅拌器提取72 h，孢子丝菌充分吸收后过滤，滤液透析24 h，校正pH为7.5，负压蔡氏滤器(0.2 μm)过滤除菌，获2倍稀释的孢子丝菌素制剂，4℃冰箱保存备用。(2)无菌测定：无菌操作下抽取上述抗原液分别接种于肉汤培养基及沙氏培养基上，20℃培养2周，观察无细菌及真菌生长。(3)毒力试验：取10只20 g体重的雄性小白鼠，5只每只腹腔内注入抗原液0.5 ml，另5只每只腹腔内注入生理盐水0.5 ml，喂养2周，小鼠生长良好，二组间无差异。(4)抗原效价测定：应用Lowry法测定2倍稀释抗原液，采用岛津UV-190型分光光度计测定750 nm的吸光度值，作标准曲线经换算得蛋白含量为60 μg/ml。(5)抗原液的最后稀释浓度为1∶100，1 ml/g分装后4℃冰箱保存备用。
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皮试及结果制定：(1)于前臂内侧皮内注射孢子丝菌素0.1 ml，48 h观察结果。(2)制定标准：阴性：与溶媒对照类似的帽针大小丘疹或红晕。可疑：直径小于0.5 cm的水肿性红斑。结果：46例中，孢子丝菌素皮试，真菌培养及病理检查皆做者共21例，不宜作病理检查者25例，孢子丝菌素皮试阳性者共45例，阳性率98%，真菌培养阳性者43例，病理检查为炎性肉芽肿；自然对照组、皮肤癣菌病20例、正常儿童30例皮试结果均阴性。全部确诊病例均予10%碘化钾溶液5～10 ml，每日3次口服，经2～4个月治愈，随访半年以上无复发。
讨论：孢子丝菌病是由申克孢子丝菌引起的慢性深部真菌病。主要侵犯皮肤及皮下组织，且可侵犯内脏器官。目前诊断该病常用的方法有：皮损渗出液涂片Gram及PAS染色镜检，直接镜检检出率低，据统计国内自1947～1996年已公开发表的1 647例该病患者中做直接镜检(需取组织块或患处脓液)费时长，至少需1～2周；而儿童患者有相当部分病例(占54.3%)不宜作病理检查。孢子丝菌素皮试快速、简便更适于儿童患者应用。孢子丝菌素的制备已经历了四个阶段：(1)标准的孢子丝菌素(相当于菌苗制备)[2]；(2)液体培养滤液[3]；(3)多糖衍生物的粗制剂[4]；(4)多肽抗原制剂[5]。本组即经历了第3阶段，一般认为人体感染申克孢子丝菌后5～15 d即可出现皮试阳性反应。因申克孢子的菌与白色念珠菌有相同的抗原决定簇，其相关系数为0.89%[6]，故用白色念珠菌吸收孢子丝菌素，从而有效地清除了二者间的交叉抗原性，故此孢子丝菌素具有高特异性，全部确诊病例皆通过各种手段，相互验证，结果可靠。故认为此方法可作为诊断儿童孢子丝菌病的首选方法之一。
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参考文献
1，张庆松,主编. 临床变态反应学. 上海: 上海科学技术出版社,1988.267-268.
2，Posada HR. Skin test with sporotrichin. Its sensitivity and specificity. Mycopathol Mycol Appl, 1968, 36: 42-53.
3，Costa Eo, Diniz LS, Netto CF, et al. Epidemiological study of sporotrichosis and histoplasmosis in captive Latin American wild mammals. Mycopathologia, 1994, 125: 19-22.
4，Toriello C, Arjona-Rosado LC, Diaz ML, et al. Efficiency of crude and purified fungal antigens in serodiagnosis to discriminate mycotic from other respiratory disease. Mycoses, 1991, 34: 133-140.
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5，Ghosh A, Chakrabarti A, Sharma VK, et al. Sporotrichosis in Himachal Pradesh (north India). Trans R Soc Trop Med Hyg, 1999, 93: 41-45.
6，Stetle RW, Cannady PB Jr, Moore WL Jr, et al. Skin test and blastogenic responses to Sporotrichun Schenckii. J Clin Invest, 1976, 57: 156-160.
(收稿日期：1999-08-05), http://www.100md.com