血管紧张素转换酶抑制剂及血管紧张素受体阻断剂对残肾慢性肾衰竭幼鼠肾小球硬化的影响
作者：马宏 王翠玲
单位：马宏(030001 山西医科大学第一医院儿内科)；王翠玲(030001 山西医科大学第一医院儿内科)
关键词：
中华儿科杂志000518 进行性肾小球硬化是慢性肾脏病变的基本病理变化，细胞外基质(ECM)的过度沉积是诱导肾小球硬化的因素之一。既往研究提示肾素血管紧张素系统可促进系膜细胞肥大，血管平滑肌细胞增殖，及ECM过度产生和沉积而致肾硬化或纤维化。我们采用5/6肾切除大鼠模型，观察了血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)苯那普利及Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体(AT1)阻滞剂氯沙坦对肾小球硬化的治疗作用及其机理。
材料和方法
1. 实验动物分组及给药方法：SD雌性幼年(4周龄)大鼠共51只，体重为130～150 g，随机分为4组：假手术组(1组)12只(存活10 只)；5/6肾切除未治疗组(2组)15只(存活8只)；5/6肾切除氯沙坦治疗组(3组)[氯沙坦30 mg/(kg*d)]12只(存活7只)；5/6肾切除苯那普利治疗组(4组)[苯那普利6 mg/(kg*d)]12只(存活7只)。
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2. 5/6肾切除模型制备：将SD大鼠用硫喷妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，俯位固定于鼠台上，于左背中1/3旁正中1.5 cm纵行切口2 cm，暴露左肾，钝分离肾包膜，切除左肾上、下极2/3肾组织，明胶海棉止血，分层缝合。1周后右肾旁正中1.5 cm纵切口切除右肾，制备成5/6肾切除大鼠。假手术组大鼠只作肾包膜剥离。
3. 大鼠体重、血压、血、尿生化指标测定：于治疗开始、第4周、第8周分别收集24h尿检测尿蛋白(考马斯亮兰法)，并测大鼠尾动脉血压和体重，治疗第8周末杀鼠取血检测尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白。
4. 肾脏病理检查：4 %多聚甲醛固定组织，用75 %、95 %、100 %酒精脱水，三氯甲烷透明、浸蜡、石蜡包埋、3 μm切片、PAS染色。按Rejis目测法于光镜下对肾小球硬化程度进行半定量分析，即根据每个肾小球毛细血管袢塌陷或消失、系膜细胞增殖和基质加宽来评分，并分为0～4级：0级无损伤；1级每个肾小球硬化面积<25 %；2 级硬化面积为25 %～50 %；3级硬化面积为50 %～70 %；4 级硬化面积为75%～100%。从每张切片所有肾小球平均积分来反映全肾平均硬化指数(GSI)，即GSI=[(1×n1+2×n2+3×n3+4×n4)/切片肾小球总数]×100%。
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5. 残肾纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)、转化生长因子-β (TGF-β1)免疫组化染色：石蜡切片制备同上，蜡脱水化，3 %H2O2灭活10 min、PBS洗3次，微波抗原修复15 min ，羊血清封闭10 min ，将PAI-1一抗(1∶150/PBS)于湿盒内37℃孵育1 h、PBS冲洗，Bio-IgG室温孵育30 min、PBS冲洗、IgG-HRP室温孵育30 min、PAS冲洗，DAB-H2O2发色5 min ，封片。TGF-β1一抗(1∶50/PBS)的操作步骤同上。
6. 统计学处理：数据均用均值±标准差表示，采用单因素方差分析(SNK检验)进行检验。
结果
1.大鼠体重、蛋白尿及血压变化：5/6肾切除各组大鼠于手术后体重明显下降，而治疗后各组大鼠体重趋于恢复；未治疗组尿蛋白及血压升高随病变出现和发展而加重,但治疗组尿蛋白及血压变化随治疗的延续而趋于好转。
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2.治疗8周后各组间血生化指标比较：治疗8周后，(1)尿素氮(mmol/L)：1组为6.40±0.27，2组为11.05±0.76，3组为9.45±0.68，4组为9.58±0.65；(2)血肌酐(μmol/L)：1组为50.4±1.2，2组为88.2±2.7，3组为64.6±5.8，4组为66.8±3.6；(3)胆固醇(mmol/L)：1组为1.83±0.08，2组为1.99±0.09，3组为1.62±0.07，4组为1.69±0.09；(4)甘油三酯(mmol/L)：1组为0.86±0.05，2组为1.09±0.08，3组为0.80±0.08，4组为0.66±0.11；(5)低密度脂蛋白胆固醇(mmol/L)：1组为0.53±0.03，2组为0.74±0.03，3组为0.54±0.06，4组为0.51±0.02。上述结果表明，未经治疗的2组各项生化指标均高于1组(P<0.01)，提示2组大鼠的肾功能随病程延长而趋于恶化，除尿素氮下降未达显著界值外，其余指标，经治疗的两组均低于未治疗组，差异有显著或非常显著意义(P<0.05, 0.01)。
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3.各组间肾脏病理改变半定量比较：第8周后各治疗组肾小球系膜细胞增殖、系膜基质增宽硬化、小球内纤维素样渗出及小管间质病变与未治疗组比较均有明显改善，肾小球硬化指数：1组为0.12±0.08，2组为2.23±0.20，3组为1.08±0.09，4组为1.39±0.18(P<0.01)。
4.各组间残肾组织PAI-1和TGF-β1蛋白表达情况比较：免疫组化染色提示苯那普利和氯沙坦治疗组大鼠残肾组织中PAI-1和TGF-β1蛋白表达较未治疗组明显下降。
讨论
近年来的研究提示，在慢性进展性肾脏病变过程中肾素血管紧张素系统起重要作用，给予ACEI等治疗可改善其病变程度[1-4]。但有关血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)作用的精确机制尚未明确。我们采用5/6肾切除慢性肾衰SD幼年大鼠为实验动物模型[2，3]，探讨苯那普利、氯沙坦对肾衰竭大鼠肾功能、血脂、尿蛋白及肾小球硬化的影响。结果提示ACEI、AT1受体阻断剂均有明显降血压、减轻尿蛋白、降低血脂、改善肾功能及抗肾小球硬化的作用。Ang-Ⅱ刺激肾内ECM合成增加而致肾小球硬化可能通过以下机制实现：Ang-Ⅱ可使肾小球内血液动力学发生改变、肾小球内血压增高而致肾小球超滤、血管平滑肌和内皮细胞损伤、脂代谢紊乱及动脉硬化[3，4]，并可直接刺激血管平滑肌、系膜细胞大量产生TGF-β1。TGF-β1一方面诱导ECM蛋白如胶原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、纤维连接蛋白(FN)、蛋白聚糖类的合成增加和沉积[2，3]，另一方面通过诱导PAI-1的超表达，抑制ECM降解[5]， 从而导致ECM在肾小球及小管间质区的大量沉积，引起硬化和纤维化。本研究证实，未治疗组残肾组织中PAI-1和TGF-β1表达明显增加，而TGF-β1合成增加可反向刺激Ang-Ⅱ活性及AT1受体表达，从而形成恶性循环过程。应用ACEI和AT1受体阻断剂可使其表达明显下降[4]，有效地抑制恶性循环[2]。本研究应用苯那普利和氯沙坦治疗，于第8周时肾小球系膜细胞增殖和基质沉积以及间质炎性细胞浸润、小管病变及纤维化程度均有明显改善。总之，ACEI、AT1受体阻断剂能够明显减轻肾组织中由TGF-β1、PAI-1、AT1受体、高脂血症等介导的ECM沉积，具有改善和预防进行性肾脏硬化性病变的作用[2，3]。
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参考文献
1，Hamaguchi A，Kims H，Wanibuchi H，et al.Angiotensin Ⅱ and Ca++-blochers prevent glamerular phenotypic changes in remnant kidney model. J Am Soc Nephrol，1996,7：687-693.
2，Oikawa T，Freeman M，Lo W ，et al.Modulation of plasminogen activator inhibitor-1 in vivo： a new mechanism for the anti-fibrotic effect of renin-angiotensin inhibition.Kid Int，1997,51：164-172.
3，Leonard L .Transforming growth factor-β1 and renal injury following subtotal nephrectomy in the rat：role of the renin-angiotensin system.Kid Int，1997,51：1553-1567.
, 百拇医药
4，Markus K，Aancy AN，Wayne AB，et al. Transforming growth factor-β and angiotensin：the missing link from glomerular hyperfiltration to glomeruloslerosis？ Annu Rew Physiol，1995,57：279-295.
5，Kagami S，Border W A，Miller DE ,et al. Angiotensin Ⅱ stimulates ECM protein synthesis through induction of TGF-β expression in rat glomerular mesangial cells. J Clin Invest，1994,93：2431-2437.
(收稿日期：1999-06-11), 百拇医药
单位：马宏(030001 山西医科大学第一医院儿内科)；王翠玲(030001 山西医科大学第一医院儿内科)
关键词：
中华儿科杂志000518 进行性肾小球硬化是慢性肾脏病变的基本病理变化，细胞外基质(ECM)的过度沉积是诱导肾小球硬化的因素之一。既往研究提示肾素血管紧张素系统可促进系膜细胞肥大，血管平滑肌细胞增殖，及ECM过度产生和沉积而致肾硬化或纤维化。我们采用5/6肾切除大鼠模型，观察了血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)苯那普利及Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体(AT1)阻滞剂氯沙坦对肾小球硬化的治疗作用及其机理。
材料和方法
1. 实验动物分组及给药方法：SD雌性幼年(4周龄)大鼠共51只，体重为130～150 g，随机分为4组：假手术组(1组)12只(存活10 只)；5/6肾切除未治疗组(2组)15只(存活8只)；5/6肾切除氯沙坦治疗组(3组)[氯沙坦30 mg/(kg*d)]12只(存活7只)；5/6肾切除苯那普利治疗组(4组)[苯那普利6 mg/(kg*d)]12只(存活7只)。
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2. 5/6肾切除模型制备：将SD大鼠用硫喷妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，俯位固定于鼠台上，于左背中1/3旁正中1.5 cm纵行切口2 cm，暴露左肾，钝分离肾包膜，切除左肾上、下极2/3肾组织，明胶海棉止血，分层缝合。1周后右肾旁正中1.5 cm纵切口切除右肾，制备成5/6肾切除大鼠。假手术组大鼠只作肾包膜剥离。
3. 大鼠体重、血压、血、尿生化指标测定：于治疗开始、第4周、第8周分别收集24h尿检测尿蛋白(考马斯亮兰法)，并测大鼠尾动脉血压和体重，治疗第8周末杀鼠取血检测尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白。
4. 肾脏病理检查：4 %多聚甲醛固定组织，用75 %、95 %、100 %酒精脱水，三氯甲烷透明、浸蜡、石蜡包埋、3 μm切片、PAS染色。按Rejis目测法于光镜下对肾小球硬化程度进行半定量分析，即根据每个肾小球毛细血管袢塌陷或消失、系膜细胞增殖和基质加宽来评分，并分为0～4级：0级无损伤；1级每个肾小球硬化面积<25 %；2 级硬化面积为25 %～50 %；3级硬化面积为50 %～70 %；4 级硬化面积为75%～100%。从每张切片所有肾小球平均积分来反映全肾平均硬化指数(GSI)，即GSI=[(1×n1+2×n2+3×n3+4×n4)/切片肾小球总数]×100%。
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5. 残肾纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)、转化生长因子-β (TGF-β1)免疫组化染色：石蜡切片制备同上，蜡脱水化，3 %H2O2灭活10 min、PBS洗3次，微波抗原修复15 min ，羊血清封闭10 min ，将PAI-1一抗(1∶150/PBS)于湿盒内37℃孵育1 h、PBS冲洗，Bio-IgG室温孵育30 min、PBS冲洗、IgG-HRP室温孵育30 min、PAS冲洗，DAB-H2O2发色5 min ，封片。TGF-β1一抗(1∶50/PBS)的操作步骤同上。
6. 统计学处理：数据均用均值±标准差表示，采用单因素方差分析(SNK检验)进行检验。
结果
1.大鼠体重、蛋白尿及血压变化：5/6肾切除各组大鼠于手术后体重明显下降，而治疗后各组大鼠体重趋于恢复；未治疗组尿蛋白及血压升高随病变出现和发展而加重,但治疗组尿蛋白及血压变化随治疗的延续而趋于好转。
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2.治疗8周后各组间血生化指标比较：治疗8周后，(1)尿素氮(mmol/L)：1组为6.40±0.27，2组为11.05±0.76，3组为9.45±0.68，4组为9.58±0.65；(2)血肌酐(μmol/L)：1组为50.4±1.2，2组为88.2±2.7，3组为64.6±5.8，4组为66.8±3.6；(3)胆固醇(mmol/L)：1组为1.83±0.08，2组为1.99±0.09，3组为1.62±0.07，4组为1.69±0.09；(4)甘油三酯(mmol/L)：1组为0.86±0.05，2组为1.09±0.08，3组为0.80±0.08，4组为0.66±0.11；(5)低密度脂蛋白胆固醇(mmol/L)：1组为0.53±0.03，2组为0.74±0.03，3组为0.54±0.06，4组为0.51±0.02。上述结果表明，未经治疗的2组各项生化指标均高于1组(P<0.01)，提示2组大鼠的肾功能随病程延长而趋于恶化，除尿素氮下降未达显著界值外，其余指标，经治疗的两组均低于未治疗组，差异有显著或非常显著意义(P<0.05, 0.01)。
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3.各组间肾脏病理改变半定量比较：第8周后各治疗组肾小球系膜细胞增殖、系膜基质增宽硬化、小球内纤维素样渗出及小管间质病变与未治疗组比较均有明显改善，肾小球硬化指数：1组为0.12±0.08，2组为2.23±0.20，3组为1.08±0.09，4组为1.39±0.18(P<0.01)。
4.各组间残肾组织PAI-1和TGF-β1蛋白表达情况比较：免疫组化染色提示苯那普利和氯沙坦治疗组大鼠残肾组织中PAI-1和TGF-β1蛋白表达较未治疗组明显下降。
讨论
近年来的研究提示，在慢性进展性肾脏病变过程中肾素血管紧张素系统起重要作用，给予ACEI等治疗可改善其病变程度[1-4]。但有关血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)作用的精确机制尚未明确。我们采用5/6肾切除慢性肾衰SD幼年大鼠为实验动物模型[2，3]，探讨苯那普利、氯沙坦对肾衰竭大鼠肾功能、血脂、尿蛋白及肾小球硬化的影响。结果提示ACEI、AT1受体阻断剂均有明显降血压、减轻尿蛋白、降低血脂、改善肾功能及抗肾小球硬化的作用。Ang-Ⅱ刺激肾内ECM合成增加而致肾小球硬化可能通过以下机制实现：Ang-Ⅱ可使肾小球内血液动力学发生改变、肾小球内血压增高而致肾小球超滤、血管平滑肌和内皮细胞损伤、脂代谢紊乱及动脉硬化[3，4]，并可直接刺激血管平滑肌、系膜细胞大量产生TGF-β1。TGF-β1一方面诱导ECM蛋白如胶原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、纤维连接蛋白(FN)、蛋白聚糖类的合成增加和沉积[2，3]，另一方面通过诱导PAI-1的超表达，抑制ECM降解[5]， 从而导致ECM在肾小球及小管间质区的大量沉积，引起硬化和纤维化。本研究证实，未治疗组残肾组织中PAI-1和TGF-β1表达明显增加，而TGF-β1合成增加可反向刺激Ang-Ⅱ活性及AT1受体表达，从而形成恶性循环过程。应用ACEI和AT1受体阻断剂可使其表达明显下降[4]，有效地抑制恶性循环[2]。本研究应用苯那普利和氯沙坦治疗，于第8周时肾小球系膜细胞增殖和基质沉积以及间质炎性细胞浸润、小管病变及纤维化程度均有明显改善。总之，ACEI、AT1受体阻断剂能够明显减轻肾组织中由TGF-β1、PAI-1、AT1受体、高脂血症等介导的ECM沉积，具有改善和预防进行性肾脏硬化性病变的作用[2，3]。
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参考文献
1，Hamaguchi A，Kims H，Wanibuchi H，et al.Angiotensin Ⅱ and Ca++-blochers prevent glamerular phenotypic changes in remnant kidney model. J Am Soc Nephrol，1996,7：687-693.
2，Oikawa T，Freeman M，Lo W ，et al.Modulation of plasminogen activator inhibitor-1 in vivo： a new mechanism for the anti-fibrotic effect of renin-angiotensin inhibition.Kid Int，1997,51：164-172.
3，Leonard L .Transforming growth factor-β1 and renal injury following subtotal nephrectomy in the rat：role of the renin-angiotensin system.Kid Int，1997,51：1553-1567.
, 百拇医药
4，Markus K，Aancy AN，Wayne AB，et al. Transforming growth factor-β and angiotensin：the missing link from glomerular hyperfiltration to glomeruloslerosis？ Annu Rew Physiol，1995,57：279-295.
5，Kagami S，Border W A，Miller DE ,et al. Angiotensin Ⅱ stimulates ECM protein synthesis through induction of TGF-β expression in rat glomerular mesangial cells. J Clin Invest，1994,93：2431-2437.
(收稿日期：1999-06-11), 百拇医药