三氧化二砷诱导神经母细胞瘤细胞凋亡机理的研究
作者：伍钢 周云峰 陈同辛 沈蕾 周昕 林梓 王耀平 应大明
单位：伍钢(430071 武汉，湖北医科大学附属第二医院放化疗科)；周云峰(430071 武汉，湖北医科大学附属第二医院放化疗科)；陈同辛(上海第二医科大学附属新华医院)；沈蕾(上海第二医科大学附属新华医院)；周昕(上海第二医科大学附属新华医院)；林梓(上海第二医科大学附属新华医院)；王耀平(上海第二医科大学附属新华医院)；应大明(上海第二医科大学附属新华医院)
关键词：
中华儿科杂志000718 基于三氧化二砷(arsenic trioxide， As2O3)可与细胞重要酶类的疏基结合使酶失活，引起细胞代谢紊乱，造成细胞损伤的特点，本实验在研究As2O3对神经母细胞瘤(neuroblastoma, NB)细胞系SJ-N-SH生长的影响及其作用机制时，初步探讨了抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)与细胞凋亡及bcl-2基因调控的关系，现报告如下。
, 百拇医药
材料和方法
1.材料：NB细胞株SJ-N-SH由日本三重大学惠赠；As2O3由上海第二医科大学附属瑞金医院血液研究所惠赠。
2.凋亡细胞形态学观察：于6孔培养板内放入盖玻片，每孔加3 ml RPMI-1640培养基，3×106 SJ-N-SH细胞，37℃，5%二氧化碳条件下培养24 h后加As2O3，剂量为1.0～2.0 μmol/L，继续培养4～5 d。实验结束时吸去培养基，PBS洗1次，取出盖玻片，晾干。凋亡细胞May-Grundwal-Giemsa染色参照鄂征[1]介绍的方法加以改良。
3.流式细胞仪检测凋亡细胞率：实验分为3组，即对照组(未加As2O3)、As2O3 1.0 μmol/L组、As2O3 2.0 μmol/L组。细胞培养24 h后加 As2O3，继续分别培养72、96、120 h时收获细胞。流式细胞仪标本制备及检测方法参照Nicoletti等[2]介绍的方法。
, http://www.100md.com
4.凋亡细胞DNA凝胶电泳：实验分为3组，即对照组(未加As2O3)、As2O3 1.0 μmol/L组、As2O3 2.0 μmol/L组。加As2O3培养5 d，培养结束时，每管收获5×106细胞。标本制备及实验方法参照姜泊等[3]介绍的方法。
5.bcl-2基因表达的检测：(1)本实验分为对照组和实验组，对照组未加As2O3，实验组加1.0 μmol/L的 As2O3，培养4 d，按常规方法消化收获细胞，PBS清洗2次，1%多聚甲醛固定，染色液重悬细胞，400目纱网过滤。每管加200 μl含bcl-2单克隆抗体的染色液，室温，30 min，PBS洗2次，重悬细胞于200 μl的PBS中，在流式细胞仪上测定bcl-2基因表达阳性细胞率及其荧光强度。(2)本实验设置下列对照：①空白对照：既不加单克隆抗体，也不加第二抗体；②第一抗体对照：不加单克隆抗体，加第二抗体；③第二抗体对照：加单克隆抗体，不加第二抗体。
, http://www.100md.com
6.谷胱甘肽(GSH)含量的测定：本实验分为对照组、 As2O3 1.0 μmol/L、 As2O3 2.0 μmol/L 三组。6孔培养板，每孔5×105 SJ-N-SH细胞，同前述条件孵育24 h后加 As2O3 ，分别于加药后24、48、72和96 h收获细胞，PBS洗2次，调整细胞浓度至1×106/ml，标本制备及检测方法参照沈惠麒等[4]介绍的方法 。
7.统计学处理：两样本均数t 检验或两样本均数方差分析。
结果
1. As2O3 诱导SJ-N-SH细胞凋亡的观察：May-Grundwal-Giemsa染色表明:当As2O3 用量为1.0～2.0 μmol/L,作用时间为5 d时,细胞体积明显缩小,胞浆明显减少,胞核固缩成新月状、块状等多种形态，靠近细胞边缘。而对照组细胞胞核染成紫红色,胞浆中RNA染色为淡蓝色,细胞大小均匀一致。应用流式细胞仪测定凋亡细胞比率，结果发现As2O3 1.0 μmol/L 组和As2O3 2.0 μmol/L 组细胞发生凋亡的比率在作用72 h后即明显高于对照组，随作用时间的延长，凋亡比率呈升高趋势，见图1(图1结果为3次独立实验均值)。通过DNA凝胶电泳，证明在培养基中加入1.0 μmol/L、2.0 μmol/L的As2O3 培养5 d后,实验组细胞的DNA凝胶电泳图均呈典型的“梯型”条带，对照组则无此变化。此结果进一步证实As2O3 可诱导SJ-N-SH细胞发生凋亡。
, 百拇医药
图1 As2O3 对实验和对照组 SJ-N-SH 细胞凋亡率的比较
2.As2O3对SJ-N-SH细胞 bcl-2基因表达的影响：本实验已证实As2O3可诱导SJ-N-SH细胞发生凋亡，至于As203对SJ-N-SH细胞bcl-2基因表达的影响，通过与实验组相比，发现bcl-2 基因表达阳性细胞所占比率实验组为(82±11)%，对照组(76±11)%，P>0.05，差异无显著性，但实验组荧光强度却显著低于对照组，实验组为(27±7)%，对照组为(41±6)%， P<0.01。说明实验组单个细胞bcl-2表达量明显减少，提示As2O3对SJ-N-SH细胞bcl-2基因表达有下调作用。
3. GSH含量的变化与细胞凋亡及bcl-2基因表达的关系：实验结果表明，经与As2O3共同孵育后的SJ-N-SH细胞，GSH含量逐渐下降，培养72 h达到最低值。此时3组的GSH浓度分别为对照组：(8.7±0.7) μg/106 细胞(n=5); As2O3 1 μmol/L组: (5.6±0.8) μg/106 细胞(n=5), As2O3 2 μmol/L组(4.2±0.7) μg/106 细胞(n=5)。经方差分析，两实验组GSH浓度均明显低于对照组(P值均<0.01)。提示，As2O3诱导SJ-N-SH细胞凋亡过程中，存在GSH的消耗。综合比较GSH含量变化与细胞凋亡及bcl-2基因表达间的关系，不难发现GSH含量在第3天即已降低到最低值，而As2O3引起的细胞凋亡高峰发生在第4～5天，此时伴有bcl-2基因表达的明显下调，说明GSH的大量消耗发生在细胞大量凋亡之前。
, 百拇医药
讨论
随着肿瘤细胞生物学和分子生物学研究的不断发展，人们逐渐认识到，细胞正常死亡过程发生障碍可能是肿瘤发生的重要原因。这种细胞的正常死亡过程被称为程序化死亡，亦称凋亡。一旦这种死亡过程发生障碍，将导致细胞的无限增殖而形成肿瘤。现有的临床治疗肿瘤的手段，如中、低剂量放疗、化疗等多是通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤的生长。本研究显示，经As2O3处理后的SJ-N-SH细胞，从细胞形态学变化、流式细胞仪测定DNA倍性及DNA凝胶电泳均证实As2O3诱导SJ-N-SH细胞发生了凋亡。
近来不少文献报道，氧自由基大量生成和细胞氧化还原平衡的崩溃是细胞凋亡的重要介导因素。氧自由基可能通过迅速消耗细胞NAD/NADH库致三磷酸腺苷储备瓦解，引起细胞脂质过氧化和激活类似ced-3、ced-4的“死亡基因”等，引起细胞凋亡[5,6]。As2O3可与细胞重要酶类的巯基结合使酶失活，从而引起细胞代谢紊乱，造成细胞损伤。本结果表明As2O3诱导SJ-N-SH细胞凋亡过程中，细胞内含巯基的主要抗氧化物GSH含量明显下降，处理72 h后达最低点。这种变化出现在细胞凋亡高峰发生之前，提示细胞内抗氧化物的消耗与As2O3诱导的SJ-N-SH细胞凋亡密切关联。
, http://www.100md.com
国外学者Ellerby等[7] 报道bcl-2 过量表达可调升胞内GSH浓度，抑制氧自由基生成。比较As2O3处理SJ-N-SH细胞后，细胞GSH含量的动态变化与bcl-2基因表达的关系，发现随bcl-2基因表达的下调，GSH含量下降。提示bcl-2基因表达下调可能通过减少细胞GSH生成，从而促发氧化应激，引起细胞凋亡。
参考文献
1，鄂征,主编.组织细胞培养技术.第二版.北京:人民卫生出版社,1986.203.
2，Nicoletti I,Migliorati G,Pagliacci MC,et al. A rapid and simple mothod for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide and flow cytometry.J Immunol Methods,1991,139:271-279.
, 百拇医药
3，姜泊,张亚历,周殿元,主编.分子生物学常用实验方法.北京:人民军医出版社,1996.65-66.
4，沈惠麒,赵利英,曲青山,等.组织中谷胱甘肽的荧光测定法.中华劳动卫生职业病杂志,1988,6:103-105.
5，Buttke TM,Sandstrom PA.Oxidative stress as a mediator of apoptosis. Immunol Today,1994,15:7-10.
6，Ferandez A,Kiefer J, Fosdick L,et al. Oxygen radical production and thiol depletion are required for Ca++-mediated endogenous endonuclease activation in apoptotic thymocyte.J Immunol,1995,155:5133-5139.
7，Ellerby LM,Ellerby MD,Park M,et al.Shift of the cellular oxidation-reduction in neural cells expresing Bcl-2. J Neurochem,1996,67:1259-1267.
(收稿日期：1999-07-08), 百拇医药
单位：伍钢(430071 武汉，湖北医科大学附属第二医院放化疗科)；周云峰(430071 武汉，湖北医科大学附属第二医院放化疗科)；陈同辛(上海第二医科大学附属新华医院)；沈蕾(上海第二医科大学附属新华医院)；周昕(上海第二医科大学附属新华医院)；林梓(上海第二医科大学附属新华医院)；王耀平(上海第二医科大学附属新华医院)；应大明(上海第二医科大学附属新华医院)
关键词：
中华儿科杂志000718 基于三氧化二砷(arsenic trioxide， As2O3)可与细胞重要酶类的疏基结合使酶失活，引起细胞代谢紊乱，造成细胞损伤的特点，本实验在研究As2O3对神经母细胞瘤(neuroblastoma, NB)细胞系SJ-N-SH生长的影响及其作用机制时，初步探讨了抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)与细胞凋亡及bcl-2基因调控的关系，现报告如下。
, 百拇医药
材料和方法
1.材料：NB细胞株SJ-N-SH由日本三重大学惠赠；As2O3由上海第二医科大学附属瑞金医院血液研究所惠赠。
2.凋亡细胞形态学观察：于6孔培养板内放入盖玻片，每孔加3 ml RPMI-1640培养基，3×106 SJ-N-SH细胞，37℃，5%二氧化碳条件下培养24 h后加As2O3，剂量为1.0～2.0 μmol/L，继续培养4～5 d。实验结束时吸去培养基，PBS洗1次，取出盖玻片，晾干。凋亡细胞May-Grundwal-Giemsa染色参照鄂征[1]介绍的方法加以改良。
3.流式细胞仪检测凋亡细胞率：实验分为3组，即对照组(未加As2O3)、As2O3 1.0 μmol/L组、As2O3 2.0 μmol/L组。细胞培养24 h后加 As2O3，继续分别培养72、96、120 h时收获细胞。流式细胞仪标本制备及检测方法参照Nicoletti等[2]介绍的方法。
, http://www.100md.com
4.凋亡细胞DNA凝胶电泳：实验分为3组，即对照组(未加As2O3)、As2O3 1.0 μmol/L组、As2O3 2.0 μmol/L组。加As2O3培养5 d，培养结束时，每管收获5×106细胞。标本制备及实验方法参照姜泊等[3]介绍的方法。
5.bcl-2基因表达的检测：(1)本实验分为对照组和实验组，对照组未加As2O3，实验组加1.0 μmol/L的 As2O3，培养4 d，按常规方法消化收获细胞，PBS清洗2次，1%多聚甲醛固定，染色液重悬细胞，400目纱网过滤。每管加200 μl含bcl-2单克隆抗体的染色液，室温，30 min，PBS洗2次，重悬细胞于200 μl的PBS中，在流式细胞仪上测定bcl-2基因表达阳性细胞率及其荧光强度。(2)本实验设置下列对照：①空白对照：既不加单克隆抗体，也不加第二抗体；②第一抗体对照：不加单克隆抗体，加第二抗体；③第二抗体对照：加单克隆抗体，不加第二抗体。
, http://www.100md.com
6.谷胱甘肽(GSH)含量的测定：本实验分为对照组、 As2O3 1.0 μmol/L、 As2O3 2.0 μmol/L 三组。6孔培养板，每孔5×105 SJ-N-SH细胞，同前述条件孵育24 h后加 As2O3 ，分别于加药后24、48、72和96 h收获细胞，PBS洗2次，调整细胞浓度至1×106/ml，标本制备及检测方法参照沈惠麒等[4]介绍的方法 。
7.统计学处理：两样本均数t 检验或两样本均数方差分析。
结果
1. As2O3 诱导SJ-N-SH细胞凋亡的观察：May-Grundwal-Giemsa染色表明:当As2O3 用量为1.0～2.0 μmol/L,作用时间为5 d时,细胞体积明显缩小,胞浆明显减少,胞核固缩成新月状、块状等多种形态，靠近细胞边缘。而对照组细胞胞核染成紫红色,胞浆中RNA染色为淡蓝色,细胞大小均匀一致。应用流式细胞仪测定凋亡细胞比率，结果发现As2O3 1.0 μmol/L 组和As2O3 2.0 μmol/L 组细胞发生凋亡的比率在作用72 h后即明显高于对照组，随作用时间的延长，凋亡比率呈升高趋势，见图1(图1结果为3次独立实验均值)。通过DNA凝胶电泳，证明在培养基中加入1.0 μmol/L、2.0 μmol/L的As2O3 培养5 d后,实验组细胞的DNA凝胶电泳图均呈典型的“梯型”条带，对照组则无此变化。此结果进一步证实As2O3 可诱导SJ-N-SH细胞发生凋亡。
, 百拇医药
图1 As2O3 对实验和对照组 SJ-N-SH 细胞凋亡率的比较
2.As2O3对SJ-N-SH细胞 bcl-2基因表达的影响：本实验已证实As2O3可诱导SJ-N-SH细胞发生凋亡，至于As203对SJ-N-SH细胞bcl-2基因表达的影响，通过与实验组相比，发现bcl-2 基因表达阳性细胞所占比率实验组为(82±11)%，对照组(76±11)%，P>0.05，差异无显著性，但实验组荧光强度却显著低于对照组，实验组为(27±7)%，对照组为(41±6)%， P<0.01。说明实验组单个细胞bcl-2表达量明显减少，提示As2O3对SJ-N-SH细胞bcl-2基因表达有下调作用。
3. GSH含量的变化与细胞凋亡及bcl-2基因表达的关系：实验结果表明，经与As2O3共同孵育后的SJ-N-SH细胞，GSH含量逐渐下降，培养72 h达到最低值。此时3组的GSH浓度分别为对照组：(8.7±0.7) μg/106 细胞(n=5); As2O3 1 μmol/L组: (5.6±0.8) μg/106 细胞(n=5), As2O3 2 μmol/L组(4.2±0.7) μg/106 细胞(n=5)。经方差分析，两实验组GSH浓度均明显低于对照组(P值均<0.01)。提示，As2O3诱导SJ-N-SH细胞凋亡过程中，存在GSH的消耗。综合比较GSH含量变化与细胞凋亡及bcl-2基因表达间的关系，不难发现GSH含量在第3天即已降低到最低值，而As2O3引起的细胞凋亡高峰发生在第4～5天，此时伴有bcl-2基因表达的明显下调，说明GSH的大量消耗发生在细胞大量凋亡之前。
, 百拇医药
讨论
随着肿瘤细胞生物学和分子生物学研究的不断发展，人们逐渐认识到，细胞正常死亡过程发生障碍可能是肿瘤发生的重要原因。这种细胞的正常死亡过程被称为程序化死亡，亦称凋亡。一旦这种死亡过程发生障碍，将导致细胞的无限增殖而形成肿瘤。现有的临床治疗肿瘤的手段，如中、低剂量放疗、化疗等多是通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤的生长。本研究显示，经As2O3处理后的SJ-N-SH细胞，从细胞形态学变化、流式细胞仪测定DNA倍性及DNA凝胶电泳均证实As2O3诱导SJ-N-SH细胞发生了凋亡。
近来不少文献报道，氧自由基大量生成和细胞氧化还原平衡的崩溃是细胞凋亡的重要介导因素。氧自由基可能通过迅速消耗细胞NAD/NADH库致三磷酸腺苷储备瓦解，引起细胞脂质过氧化和激活类似ced-3、ced-4的“死亡基因”等，引起细胞凋亡[5,6]。As2O3可与细胞重要酶类的巯基结合使酶失活，从而引起细胞代谢紊乱，造成细胞损伤。本结果表明As2O3诱导SJ-N-SH细胞凋亡过程中，细胞内含巯基的主要抗氧化物GSH含量明显下降，处理72 h后达最低点。这种变化出现在细胞凋亡高峰发生之前，提示细胞内抗氧化物的消耗与As2O3诱导的SJ-N-SH细胞凋亡密切关联。
, http://www.100md.com
国外学者Ellerby等[7] 报道bcl-2 过量表达可调升胞内GSH浓度，抑制氧自由基生成。比较As2O3处理SJ-N-SH细胞后，细胞GSH含量的动态变化与bcl-2基因表达的关系，发现随bcl-2基因表达的下调，GSH含量下降。提示bcl-2基因表达下调可能通过减少细胞GSH生成，从而促发氧化应激，引起细胞凋亡。
参考文献
1，鄂征,主编.组织细胞培养技术.第二版.北京:人民卫生出版社,1986.203.
2，Nicoletti I,Migliorati G,Pagliacci MC,et al. A rapid and simple mothod for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide and flow cytometry.J Immunol Methods,1991,139:271-279.
, 百拇医药
3，姜泊,张亚历,周殿元,主编.分子生物学常用实验方法.北京:人民军医出版社,1996.65-66.
4，沈惠麒,赵利英,曲青山,等.组织中谷胱甘肽的荧光测定法.中华劳动卫生职业病杂志,1988,6:103-105.
5，Buttke TM,Sandstrom PA.Oxidative stress as a mediator of apoptosis. Immunol Today,1994,15:7-10.
6，Ferandez A,Kiefer J, Fosdick L,et al. Oxygen radical production and thiol depletion are required for Ca++-mediated endogenous endonuclease activation in apoptotic thymocyte.J Immunol,1995,155:5133-5139.
7，Ellerby LM,Ellerby MD,Park M,et al.Shift of the cellular oxidation-reduction in neural cells expresing Bcl-2. J Neurochem,1996,67:1259-1267.
(收稿日期：1999-07-08), 百拇医药