血小板生成素和多个细胞因子对体外巨核细胞生长的作用
作者：杨默 李桂霞 阮文宾 李志光 戚其威 成明光 霍泰辉
单位：杨默(香港中文大学医学院儿科学系)；李桂霞(香港中文大学医学院儿科学系)；阮文宾(香港中文大学医学院儿科学系)；李志光(香港中文大学医学院儿科学系)；戚其威(香港中文大学医学院儿科学系)；成明光(香港中文大学医学院儿科学系)；霍泰辉(香港中文大学医学院儿科学系)
关键词：
中华儿科杂志000914 血小板生成是一个复杂、多水平调控的生物学过程，包括造血干细胞增殖、分化成巨核细胞，再由成熟的巨核细胞释出血小板[1，2]。肺部可能是血小板从巨核细胞释放的主要场所，循环的巨核细胞通过肺的毛细血管床时，在毛细血管的挤压下，经“碎片化(fragmentation)”作用后在肺静脉血中形成循环血小板[3]。然而，亦有研究认为巨核细胞在骨髓中直接释出血小板。巨核细胞生成的细胞因子调控主要由血小板生成素(TPO)调节。另外，多个造血生长因子和细胞因子亦不同程度地参与该过程，包括白细胞介素1(IL-1)、IL-3、IL-6、IL-11和Flt-3配体(Flt-3 Ligand)及干细胞因子(SCF)等[1，2]。结缔组织生长因子如血小板源性生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子(aFGF)等可能通过影响骨髓造血微环境对巨核细胞生长起一定的作用。本研究观察不同浓度的TPO对巨核细胞集落生成的影响，TPO与IL-3和IL-6、造血干细胞生长因子(Flt-3 Ligand，SCF)和结缔组织生长因子(aFGF、PDGF)对巨核细胞生长的调控及相互作用。
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材料和方法
1.细胞因子及材料：重组人(rh)的TPO、IL-3、IL-6、Flt-3 Ligand、SCF、aFGF和PDGF-BB均购自Genzyme公司。牛血清蛋白(BSA)、2-硫基乙醇(2-mercaptoethanol)和牛血浆(bavine plasma)购自Sigma公司。
2.动物：6～10周大的Balb/c雌性小鼠，分别由香港中文大学动物中心和澳大利亚新南威尔士大学动物中心提供。用颈椎拉断的方法处死，然后取双侧股骨。将取出的小鼠股骨两端剪开后，插入21～23号针头，用2～5 ml IMDM(iscove's modified dulbecco's medium)培养液将骨髓冲洗到离心管。骨髓细胞经移液管打匀后，在22℃、1 200 r/min离心10 min。经2次离心洗净后，做细胞计数。通常从每只小鼠可获取(5～10)×106个骨髓细胞。
, 百拇医药 3.巨核细胞集落培养：小鼠的巨核细胞集落培养使用血浆凝块法(plasma clot colony culture)[4]。7 d后在原位使用1%甲醛固定细胞，然后室温下过夜干燥，再进行巨核细胞AchE染色和计数。
4.AchE染色：巨核细胞集落生成的培养皿，经固定、干燥后，用磷酸缓冲液(PBS) (pH 6.0)冲洗1次，进行AchE染色，鉴别巨核细胞[4]。大于或等于3个巨核细胞的组合可确认为一个巨核细胞集落，做巨核细胞集落计数。
5.统计方法：采用配对t检验进行分析。
结果
1.不同剂量TPO对巨核细胞生长的影响：血浆凝块培养小鼠骨髓细胞在不同浓度(0～100 ng/ml)TPO的作用下，经过7 d的培养，可见TPO显著地促进巨核细胞集落的生成。与无TPO的对照组比较，TPO浓度为5 ng/ml开始有生长促进作用(P<0.05)，呈现最大的生长刺激活性时浓度为20～100 ng/ml(P<0.01)。
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2.TPO与IL对巨核细胞生长的影响及相互作用：比较在理想的有效作用范围内相同浓度(20 ng/ml)的TPO、IL-3和IL-6对巨核细胞集落生成的影响。结果可见TPO、细胞因子IL-3和IL-6均有刺激巨核细胞集落生长的作用，其中以TPO的作用活性最强(表1)。与无生长因子的对照组比较，差异有显著性。进一步观察TPO与细胞因子的协同作用，发现TPO加上IL-3和IL-6对巨核细胞集落生长有最大的促进作用。TPO分别加上IL-3和IL-6也有轻度的活性增强(表1)。提示白细胞介素参与巨核细胞的生长调控。
表1 TPO、IL-3和IL-6对巨核细胞集落生成的影响
(n=4,
±s) 组别
巨核细胞集落数
[CFU-MK/(2×105)细胞]
, 百拇医药
P值
对照组
15.0±2.0
TPO(20 ng/ml)
68.0±5.5
<0.01
IL-3(20 ng/ml)
40.0±4.5
<0.01
IL-6(20 ng/ml)
32.0±4.0
<0.01
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TPO+IL-3
72.0±4.2
<0.01
TPO+IL-6
76.0±5.0
<0.01
TPO+IL-3+IL-6
79.5±7.0
<0.01
注：P值为各组与对照组比较；TPO：血小板生成素；IL：白细胞 介素 3.TPO与造血生长因子对巨核细胞的作用：与对照组比较，TPO、TPO+Flt-3 Ligand和TPO+SCF均有促进巨核细胞集落生长的作用，差异有显著性(表2)。但Flt-3 Ligand和SCF分别与TPO作用，未见增加TPO对巨核细胞生长的刺激作用(表2)。提示Flt-3 Ligand和SCF作为造血干细胞生长因子，对分化后巨核细胞生长缺乏特异性的作用。
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4.TPO与结缔组织生长因子对巨核细胞生长的作用：比较发现PDGF和aFGF对巨核细胞生长呈正向调节作用，但其生长活性低于TPO(表3)。由于骨髓的微环境对造血细胞的生长有不可忽视的作用，提示结缔组织生长因子可间接地参与巨核细胞的生长调控。
表2 TPO与Flt-3 Ligand 和SCF对巨核细胞集落
生成的影响(n=3，±s) 组别
巨核细胞集落数
[CFU-MK/(2×105)细胞]
P值
对照组
, 百拇医药
6±1
TPO(20 ng/ml)
35±8
<0.01
TPO+Flt-3 Ligand (20 ng/ml)
32±10
<0.01
TPO+SCF(20 ng/ml)
25±6
<0.01
注：P值为各组与对照组比较；TPO、血小板生成素；Flt-3 ligand: Flt-3配体表3 TPO、PDGF和aFGF对巨核细胞集落
, 百拇医药
生成的影响(n=4，±s) 组别
巨核细胞集落[CFU-MK/(2×105)细胞]
P值
对照
生长因子
TPO(20 ng/ml)
3.8±0.5
27.5±4.7
<0.01
PDGF(50 ng/ml)
, 百拇医药
4.0±1.1
18.0±3.0
<0.01
aFGF(20 ng/ml)
4.0±1.1
12.5±2.0
<0.05
注：P值为与对照组比较
讨论
本研究证实TPO在体外有显著的促巨核细胞生长作用。在我们的血浆凝块培养中，TPO在20 ng/ml开始呈现最大的生长活性，而且其活性较IL-3和IL-6为高。在动物体内试验，TPO在1.0 g/(kg*d)是较理想的作用剂量，治疗后7～14 d血小板显著上升[2]。部分临床研究亦表明了TPO能有效和安全地升高血小板。但是，TPO两个方面的副作用也开始引起人们的注意：其一，TPO可活化血小板，刺激血小板聚集，可能会导致血栓形成；其二，TPO治疗后，体内可能会有抗TPO抗体的出现。但无论如何，TPO是一个有潜力的提升血小板的药物。重组人巨核细胞生长和发育因子(rHuMGDF)是TPO截短后的功能分子，经聚乙烯醇修饰后为PEG-rHuMGDF，目前，TPO和PEG-rHuMGF尚在临床试用阶段，还未得到美国FDA允许正式进入市场。
, 百拇医药
多个白细胞介素也不同程度地直接或间接地参与巨核细胞的生长调控。IL-3可能主要作用于巨核细胞的增殖，IL-6作用于巨核细胞的成熟。我们的另一项研究发现IL-1β协同TPO有最大的巨核细胞生长活性。IL-1β不仅协同TPO显著地促进巨核细胞生长，而且还增加巨核细胞的转录因子NF-E2的表达，并证实巨核细胞系表达IL-1 Ⅰ型和Ⅱ型受体[5]，提示IL-1β直接地参与巨核细胞的生长调控，并起一个重要的作用。另外，IL-1β作为主要的炎性细胞因子，在炎性反应时其升高往往伴随血小板增多(thrombocytosis)，也提示了炎性反应性的血小板增多IL-1β在其中扮演了一个重要的角色。尽管IL-1β，IL-3和IL-6对巨核细胞生长有促进作用，但由于它们的副作用等因素，可能限制在临床上的应用。而IL-Ⅱ被证实有效和安全地提升血小板，并得到美国FDA允许在临床使用[6]。实验研究也证实IL-Ⅱ可增强TPO促进巨核细胞生长的作用。
造血干细胞生长因子主要作用在早期的造血干细胞，对分化后的巨核细胞系缺乏特异性的作用。过去的研究也发现，尽管Flt-3 Ligand对体外扩增CD+34细胞的作用强于SCF，但Flt-3 Ligand与SCF一样对巨核细胞集落生长无明显促进作用。研究并进一步证实巨核细胞系4个细胞株Meg-ol.Dami.CHRF-288-Ⅱ和M-07e均无Flt-3 Ligand受体的表达[7]。
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尽管结缔组织生长因子有不同程度的增进巨核细胞生长的作用，而且低数目的PDGF受体亦在巨核细胞和血小板得到证实[8]。但我们认为结缔组织因子可能更主要是通过作用于骨髓的间质细胞，使间质细胞产生更多的TPO细胞因子[9]，间接地促进造血细胞和巨核细胞的生长和发育。
参考文献
1，杨默.血小板生成素和血小板内容物对巨核细胞生成的调控.中华儿科杂志,1998，36：369-370.
2，Kaushansky K. Thrombopoietin. N Engl J Med, 1998, 339:746-753.
3，Martin J, Slater DN, Trowbridge EA. Abnormal intrapulmonary platelet production: a possible cause of vascular and lung disease. Lancet, 1983, 9:793-796.
, 百拇医药
4，Yang M, Chesterman CN, Chong BH. Recombinant PDGF enhances megakaryocytopoiesis in vitro. Br J Haematol, 1995, 91: 285-289.
5，Yang M, Chan PK, Li K, et al. Identification of IL-1 type Ⅰ and type Ⅱ receptors on Meg-ol and platelets. Blood, 1998, 92: 579.
6，Du X, Williams DA. Interleukin-Ⅱ: review of molecular, cell biology and clinical use. Blood, 1997, 89: 3897-3908.
7，Yang M, Li K, Yau FW, et al. Lack of stimulative effect of Flt-3 ligand on megakaryocytopoiesis. Blood, 1997, 90: 3466.
, 百拇医药
8，Yang M, Khachigian LM, Hicks C, et al. Identification of PDGF receptors on human megakaryocytes and megakaryocytic cell line. Thromb Haemostas, 1997, 78: 892-896.
9，Guerriero A, Worford L, Holland HK, et al. Thrombopoietin is synthesized by bone marrow stromal cells. Blood, 1997, 90: 3444-3455.
(收稿日期：1999-10-10), 百拇医药
单位：杨默(香港中文大学医学院儿科学系)；李桂霞(香港中文大学医学院儿科学系)；阮文宾(香港中文大学医学院儿科学系)；李志光(香港中文大学医学院儿科学系)；戚其威(香港中文大学医学院儿科学系)；成明光(香港中文大学医学院儿科学系)；霍泰辉(香港中文大学医学院儿科学系)
关键词：
中华儿科杂志000914 血小板生成是一个复杂、多水平调控的生物学过程，包括造血干细胞增殖、分化成巨核细胞，再由成熟的巨核细胞释出血小板[1，2]。肺部可能是血小板从巨核细胞释放的主要场所，循环的巨核细胞通过肺的毛细血管床时，在毛细血管的挤压下，经“碎片化(fragmentation)”作用后在肺静脉血中形成循环血小板[3]。然而，亦有研究认为巨核细胞在骨髓中直接释出血小板。巨核细胞生成的细胞因子调控主要由血小板生成素(TPO)调节。另外，多个造血生长因子和细胞因子亦不同程度地参与该过程，包括白细胞介素1(IL-1)、IL-3、IL-6、IL-11和Flt-3配体(Flt-3 Ligand)及干细胞因子(SCF)等[1，2]。结缔组织生长因子如血小板源性生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子(aFGF)等可能通过影响骨髓造血微环境对巨核细胞生长起一定的作用。本研究观察不同浓度的TPO对巨核细胞集落生成的影响，TPO与IL-3和IL-6、造血干细胞生长因子(Flt-3 Ligand，SCF)和结缔组织生长因子(aFGF、PDGF)对巨核细胞生长的调控及相互作用。
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材料和方法
1.细胞因子及材料：重组人(rh)的TPO、IL-3、IL-6、Flt-3 Ligand、SCF、aFGF和PDGF-BB均购自Genzyme公司。牛血清蛋白(BSA)、2-硫基乙醇(2-mercaptoethanol)和牛血浆(bavine plasma)购自Sigma公司。
2.动物：6～10周大的Balb/c雌性小鼠，分别由香港中文大学动物中心和澳大利亚新南威尔士大学动物中心提供。用颈椎拉断的方法处死，然后取双侧股骨。将取出的小鼠股骨两端剪开后，插入21～23号针头，用2～5 ml IMDM(iscove's modified dulbecco's medium)培养液将骨髓冲洗到离心管。骨髓细胞经移液管打匀后，在22℃、1 200 r/min离心10 min。经2次离心洗净后，做细胞计数。通常从每只小鼠可获取(5～10)×106个骨髓细胞。
, 百拇医药 3.巨核细胞集落培养：小鼠的巨核细胞集落培养使用血浆凝块法(plasma clot colony culture)[4]。7 d后在原位使用1%甲醛固定细胞，然后室温下过夜干燥，再进行巨核细胞AchE染色和计数。
4.AchE染色：巨核细胞集落生成的培养皿，经固定、干燥后，用磷酸缓冲液(PBS) (pH 6.0)冲洗1次，进行AchE染色，鉴别巨核细胞[4]。大于或等于3个巨核细胞的组合可确认为一个巨核细胞集落，做巨核细胞集落计数。
5.统计方法：采用配对t检验进行分析。
结果
1.不同剂量TPO对巨核细胞生长的影响：血浆凝块培养小鼠骨髓细胞在不同浓度(0～100 ng/ml)TPO的作用下，经过7 d的培养，可见TPO显著地促进巨核细胞集落的生成。与无TPO的对照组比较，TPO浓度为5 ng/ml开始有生长促进作用(P<0.05)，呈现最大的生长刺激活性时浓度为20～100 ng/ml(P<0.01)。
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2.TPO与IL对巨核细胞生长的影响及相互作用：比较在理想的有效作用范围内相同浓度(20 ng/ml)的TPO、IL-3和IL-6对巨核细胞集落生成的影响。结果可见TPO、细胞因子IL-3和IL-6均有刺激巨核细胞集落生长的作用，其中以TPO的作用活性最强(表1)。与无生长因子的对照组比较，差异有显著性。进一步观察TPO与细胞因子的协同作用，发现TPO加上IL-3和IL-6对巨核细胞集落生长有最大的促进作用。TPO分别加上IL-3和IL-6也有轻度的活性增强(表1)。提示白细胞介素参与巨核细胞的生长调控。
表1 TPO、IL-3和IL-6对巨核细胞集落生成的影响
(n=4,
±s) 组别巨核细胞集落数
[CFU-MK/(2×105)细胞]
, 百拇医药
P值
对照组
15.0±2.0
TPO(20 ng/ml)
68.0±5.5
<0.01
IL-3(20 ng/ml)
40.0±4.5
<0.01
IL-6(20 ng/ml)
32.0±4.0
<0.01
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TPO+IL-3
72.0±4.2
<0.01
TPO+IL-6
76.0±5.0
<0.01
TPO+IL-3+IL-6
79.5±7.0
<0.01
注：P值为各组与对照组比较；TPO：血小板生成素；IL：白细胞 介素 3.TPO与造血生长因子对巨核细胞的作用：与对照组比较，TPO、TPO+Flt-3 Ligand和TPO+SCF均有促进巨核细胞集落生长的作用，差异有显著性(表2)。但Flt-3 Ligand和SCF分别与TPO作用，未见增加TPO对巨核细胞生长的刺激作用(表2)。提示Flt-3 Ligand和SCF作为造血干细胞生长因子，对分化后巨核细胞生长缺乏特异性的作用。
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4.TPO与结缔组织生长因子对巨核细胞生长的作用：比较发现PDGF和aFGF对巨核细胞生长呈正向调节作用，但其生长活性低于TPO(表3)。由于骨髓的微环境对造血细胞的生长有不可忽视的作用，提示结缔组织生长因子可间接地参与巨核细胞的生长调控。
表2 TPO与Flt-3 Ligand 和SCF对巨核细胞集落
生成的影响(n=3，
±s) 组别巨核细胞集落数
[CFU-MK/(2×105)细胞]
P值
对照组
, 百拇医药
6±1
TPO(20 ng/ml)
35±8
<0.01
TPO+Flt-3 Ligand (20 ng/ml)
32±10
<0.01
TPO+SCF(20 ng/ml)
25±6
<0.01
注：P值为各组与对照组比较；TPO、血小板生成素；Flt-3 ligand: Flt-3配体表3 TPO、PDGF和aFGF对巨核细胞集落
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生成的影响(n=4，
±s) 组别巨核细胞集落[CFU-MK/(2×105)细胞]
P值
对照
生长因子
TPO(20 ng/ml)
3.8±0.5
27.5±4.7
<0.01
PDGF(50 ng/ml)
, 百拇医药
4.0±1.1
18.0±3.0
<0.01
aFGF(20 ng/ml)
4.0±1.1
12.5±2.0
<0.05
注：P值为与对照组比较
讨论
本研究证实TPO在体外有显著的促巨核细胞生长作用。在我们的血浆凝块培养中，TPO在20 ng/ml开始呈现最大的生长活性，而且其活性较IL-3和IL-6为高。在动物体内试验，TPO在1.0 g/(kg*d)是较理想的作用剂量，治疗后7～14 d血小板显著上升[2]。部分临床研究亦表明了TPO能有效和安全地升高血小板。但是，TPO两个方面的副作用也开始引起人们的注意：其一，TPO可活化血小板，刺激血小板聚集，可能会导致血栓形成；其二，TPO治疗后，体内可能会有抗TPO抗体的出现。但无论如何，TPO是一个有潜力的提升血小板的药物。重组人巨核细胞生长和发育因子(rHuMGDF)是TPO截短后的功能分子，经聚乙烯醇修饰后为PEG-rHuMGDF，目前，TPO和PEG-rHuMGF尚在临床试用阶段，还未得到美国FDA允许正式进入市场。
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多个白细胞介素也不同程度地直接或间接地参与巨核细胞的生长调控。IL-3可能主要作用于巨核细胞的增殖，IL-6作用于巨核细胞的成熟。我们的另一项研究发现IL-1β协同TPO有最大的巨核细胞生长活性。IL-1β不仅协同TPO显著地促进巨核细胞生长，而且还增加巨核细胞的转录因子NF-E2的表达，并证实巨核细胞系表达IL-1 Ⅰ型和Ⅱ型受体[5]，提示IL-1β直接地参与巨核细胞的生长调控，并起一个重要的作用。另外，IL-1β作为主要的炎性细胞因子，在炎性反应时其升高往往伴随血小板增多(thrombocytosis)，也提示了炎性反应性的血小板增多IL-1β在其中扮演了一个重要的角色。尽管IL-1β，IL-3和IL-6对巨核细胞生长有促进作用，但由于它们的副作用等因素，可能限制在临床上的应用。而IL-Ⅱ被证实有效和安全地提升血小板，并得到美国FDA允许在临床使用[6]。实验研究也证实IL-Ⅱ可增强TPO促进巨核细胞生长的作用。
造血干细胞生长因子主要作用在早期的造血干细胞，对分化后的巨核细胞系缺乏特异性的作用。过去的研究也发现，尽管Flt-3 Ligand对体外扩增CD+34细胞的作用强于SCF，但Flt-3 Ligand与SCF一样对巨核细胞集落生长无明显促进作用。研究并进一步证实巨核细胞系4个细胞株Meg-ol.Dami.CHRF-288-Ⅱ和M-07e均无Flt-3 Ligand受体的表达[7]。
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尽管结缔组织生长因子有不同程度的增进巨核细胞生长的作用，而且低数目的PDGF受体亦在巨核细胞和血小板得到证实[8]。但我们认为结缔组织因子可能更主要是通过作用于骨髓的间质细胞，使间质细胞产生更多的TPO细胞因子[9]，间接地促进造血细胞和巨核细胞的生长和发育。
参考文献
1，杨默.血小板生成素和血小板内容物对巨核细胞生成的调控.中华儿科杂志,1998，36：369-370.
2，Kaushansky K. Thrombopoietin. N Engl J Med, 1998, 339:746-753.
3，Martin J, Slater DN, Trowbridge EA. Abnormal intrapulmonary platelet production: a possible cause of vascular and lung disease. Lancet, 1983, 9:793-796.
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4，Yang M, Chesterman CN, Chong BH. Recombinant PDGF enhances megakaryocytopoiesis in vitro. Br J Haematol, 1995, 91: 285-289.
5，Yang M, Chan PK, Li K, et al. Identification of IL-1 type Ⅰ and type Ⅱ receptors on Meg-ol and platelets. Blood, 1998, 92: 579.
6，Du X, Williams DA. Interleukin-Ⅱ: review of molecular, cell biology and clinical use. Blood, 1997, 89: 3897-3908.
7，Yang M, Li K, Yau FW, et al. Lack of stimulative effect of Flt-3 ligand on megakaryocytopoiesis. Blood, 1997, 90: 3466.
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8，Yang M, Khachigian LM, Hicks C, et al. Identification of PDGF receptors on human megakaryocytes and megakaryocytic cell line. Thromb Haemostas, 1997, 78: 892-896.
9，Guerriero A, Worford L, Holland HK, et al. Thrombopoietin is synthesized by bone marrow stromal cells. Blood, 1997, 90: 3444-3455.
(收稿日期：1999-10-10), 百拇医药