异基因外周血造血干细胞移植治疗重型β地中海贫血
作者：方建培 陈纯 黄绍良 吴燕峰 包蓉
单位：方建培(510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科)；陈纯(510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科)；黄绍良(510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科)；吴燕峰(510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科)；包蓉(510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科)
关键词：β地中海贫血经；造血干细胞移植
中华儿科杂志000909 【摘要】 目的 观察异基因外周血造血干细胞移植治疗重型β地中海贫血(简称β地贫)的疗效和副作用。方法 1例β地贫双重杂合子(β17/IVS-II-654突变点)患儿经总量马利兰20 mg/kg，环磷酰胺200 mg/kg、马法兰90 mg/m2和抗胸腺淋巴细胞球蛋白90 mg/kg组成的方案预处理后，输入人类白细胞抗原(HLA)相合的同胞供体外周血造血干细胞悬液56 ml。患儿获得的有核细胞数为14.4×108 /kg，粒单系祖细胞(CFU-GM) 9.5×105 /kg，CD+34CD-38细胞数为14.9×106/ kg。结果 患儿术后13 d时中性粒细胞绝对值(ANC)>0.5×109 /L，40 d 时血小板>20×109 /L；术后20 d聚合酶链反向点杂交法(PCR-RDB)检测患儿为供者型的β17杂合子，性染色体核型从46XX转变为46XY(供者型)。术后20 d起脱离红细胞输注，血红蛋白维持在110 g/L以上，100 d时复查骨髓细胞形态学正常，肝脾不大。16 d时出现急性移植物抗宿主病(aGVHD)I度，经使用甲基强的松龙和泼尼松治疗，于26 d 时aGVHD完全被控制。至今未发生慢性GVHD，现已术后无病存活475 d。结论 异基因外周血造血干细胞移植治疗重型β地贫患儿已获得成功。其出现的aGVHD 可被药物控制。
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Allogeneic peripheral blood stem cells transplantation for treating a patient with β-thalassemia major
FANG Jianpei，CHEN Chun，HUANG Shaoliang
(Department of Pediatrics, Sun Yatsen Memorial Hospital,Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120, China)
【Abstract】 Objective To observe the efficacy and side effects of allogeneic peripheral blood stem cells transplantation (Allo-PBSCT) for the treatment of a patient with β-thalassemia major. Methods After conditioning with chemotherapy consisting of busulfan 20 mg/kg, cyclophosphamide 200 mg/kg, melphalan 90 mg/m2 and antithymocyte globulin (ATG) 90 mg/kg, the patient with β-thalassemia of double heterozygosities (mutation sites at CD17 and IVS-II-654) received 56 ml of PBSC which included 14.4×108/kg nucleated cells (NC), 9.5×105/kg colony forming unit-granulocyte and macrophage (CFU-GM) and 14.9×106/kg CD+34CD-38 cells donated by the sibling with the identical HLA. Results The absolute nucleated cell (ANC) numbers reached 0.5×109/L 13 days post-PBSCT. The platelet reached 20×109/L 40 days post-PBSCT. The donor's heterozygosity of CD17 mutation site was only detected by the PCR-RDB at the 20th day. The karyotype changed to 46XY (donor type) from 46XX post transplantation. The hemoglobin of the patient was kept over 110g/L without red blood cells transfusion from the 20th day post transplantation. Normal bone marrow cell morphology presented at the 100th day post-PBSCT. The patient's liver and spleen did not enlarge. The acute graft-versus-host disease (aGVHD) of I° happened at the 16th day, and was controlled at the 26th day by treatments with methoprednisolone and prednisone. There was no chronic GVHD. The patient was free of the disease and survived for 475 days after Allo-PBSCT.Conclusion The results showed that Allo-PBSCT was successful in treating β-thalassemia major. This is the 1st report on treatment of β-thalassemia major with allo-PBSCT in China.
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【Key words】 beta-Thalassemia; Hemotopoietic stem cell transplantation
本研究组曾报道国内首例脐血移植(UCBT)成功治疗重型β地中海贫血(简称β地贫)[1]，但人类白细胞抗原(HLA)相合同胞脐血来源困难。为寻找新的造血干细胞来源，1999年4月，我们用HLA相合的血缘相关供者异基因外周血造血干细胞移植(allo-PBSCT)成功治疗β地贫1例。报告如下。
对象和方法
一、对象
患儿女，2岁5个月，确诊β地贫约2年，于1999年3月11日入院。体检：肝肋下3 cm，脾肋下1.5 cm，血红蛋白(Hb)57 g/L，血红蛋白A2(HbA2)为0.022，血红蛋白F(HbF) 0.759。β地贫基因分析为：β17(A→T)/IVS-II-654(C→T)双重杂合子。为维持Hb 90 g/L，共输注浓缩红细胞800 ml，未使用去铁胺(desferal)。移植前肝右肋下2 cm，质中、边锐，脾肋下未及。骨髓象符合溶血性贫血。肝、肾功能均正常，抗乙型肝炎病毒(HBV)、抗丙型肝炎病毒(HCV)、抗甲型肝炎病毒(HAV)抗体均阴性，巨细胞病毒(CMV)抗体IgG及聚合酶链反应检测CMV-DNA均阴性，血清铁蛋白为1 394 μg/L。
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二、方法
1.供者及HLA配型： 供者为患儿胞兄，14岁，体重52 kg，体检正常。抗HBV、HCV抗体均阴性，CMV抗体IgG(-)。Hb 132 g/L，HbA2 0.04，HbF 0.028，β地贫基因分析为β17杂合子。其HLA配型与受者全相合(表1)。供、受者ABO血型均为“B”。
表1 供者与受者HLA位点配型 供受者
HLA 位点
A
B
Bw
DR
DR(ssp)
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DQ(ssp)
供者
2,-
60(40),46
6,-
14(6),15(2)
14,15
05,-
受者
2,-
60(40),46
6,-
14(6),15(2)
, 百拇医药
14,15
05,-
2. 供者外周血造血干细胞(PBSC)动员、收集和保存:1999年3月10日起给供者注射重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-cSF, 日本Kirin公司产品)300 μg/d [6 μg/(kg.d)]，第5天上午检查外周血WBC为 34.8×109 /L，中性粒细胞绝对值(ANC)为29.9×109/L用Baxter公司CS 3000 plus血细胞分离机经循环8 000 ml单次采集，终体积为56 ml。取样本作单个核细胞(MNC)、粒单系祖细胞 (CFU-GM)培养及流式细胞仪(FACS)测CD+34CD-38细胞数。收获MNCs 15.5×109，CFU-GM 6.88×105，CD+34CD-38 18.4×107，造血干细胞输注加防冻剂(由DMSO，人血白蛋白和1640组成)经程控降温后置于-196℃液氮中保存备用。
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三、移植过程
1.预处理方案： 马利兰(Busulfan, Bu)20 mg/kg每天分4次(术前第9天至第6天，即-9 d～-6 d，下同)口服；环磷酰胺200 mg/kg，分4 d，(-5 d～-2 d)；马法兰90 mg/m2，分2 d(-5 d～-4 d)口服；马抗胸腺淋巴细胞球蛋白90 mg/kg分3 d(-4 d～-2 d)静脉注射。
2.造血干细胞输注(PBSC)： 1999年4月3日(0 d)和4月4日(+1 d)将在液氮中保存20 d的PBSC分批于3 min内融冻后快速从右锁骨下静脉穿刺导管输入患儿体内，同时予碱化尿液、镇静、水化、利尿等综合治疗。复温后输入PBSC的有核细胞(NC)数为14.4×108 /kg(受者体重，下同)，CFU-GM 9.5×105 /kg ，CD+34CD-38 14.9×106 /kg，锥虫蓝拒染率为100%。
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3.治疗经过：患儿入住洁净室内，专人护理。预处理至植入期间予无菌饮食、肠道清洁、消毒，使用无环鸟苷、氟康唑和静脉用丙种球蛋白(IVIG)等防治感染。应用硫乙磺酸钠(美斯钠，mesna)预防出血性膀胱炎。用环孢菌素A(CsA)预防急性移植物抗宿主病(aGVHD)：-1 d起予以CsA 3 mg/(kg*d) 静脉滴注，至+33 d当aGVHD控制后改CsA口服并定期查血清CsA浓度，渐减量维持。为预防肝静脉阻塞综合征，于-9 d起至+21 d使用复方丹参注射液和前列腺素E1(PGE1)，后者按0.3 μg/(kg*h)维持。+3 d至+31 d，予rhG-CSF静脉 或皮下注射(Kirin公司和中外制药产品)。当Hb<60 g/L，血小板(PLT)<20×109 /L或患儿PLT减少而出血时，给予经γ-射线20 Gy～30 Gy照射的成分血输注(加血细胞过滤器)。总计输注红细胞400 ml，PLT 9 U (每U含PLT数为2.0×1011)。结果
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一、 移植后造血重建
外周血干细胞移植(PBSCT)后+3 d WBC数为0，持续3 d，+13 d ANC>0.5×109 /L，WBC达2.9×109 /L，+17 d WBC达高峰为14.2×109 /L，G-CSF减量后WBC下降，+19 d为3.0×109/L，停用G-CSF， +31 d WBC为4.6×109/L。此后，一直稳定在(4.4～7.6)×109/L之间。当+17 d WBC为 14.2×109/L时，患儿出洁净室，+20 d起停止RBC输注；+21 d后Hb为 94～122 g/L。PLT于+8 d下降为32×109/L，+40 d起>30×109/L，停止PLT的输注。因患儿PLT一直处于低水平，+36 d复查骨髓象为骨髓增生明显活跃，粒系0.64，红系0.23，粒、红系统正常。巨核细胞79个/片，其中分类27个，全片未见产板巨核细胞，血小板分布稀疏，偶见大型。故临床诊断为PBSCT合并免疫性血小板减少性紫癜。于+43 d予大剂量IVIG 1 g/(kg.次)冲击，+45 d PLT为31×109/L，+46 d予甲基强的松龙30 mg/(kg*d)静脉滴注3 d后减半，用半量2 d后改泼尼松口服，自+54 d后PLT上升并维持在(40～85)×109/L，+69 d为85×109 /L。+86 d后PLT>100×109/L，+71 d复查骨髓象示骨髓增生明显活跃，粒系0.48，红系0.46，巨核细胞27个/片，其中分类25个，产血小板巨核细胞1个。
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二、aGVHD的治疗
+16 d 患儿双足底、双掌心、胸腹部、臀部、面部出现散在暗红斑丘疹，面积<25%。肝脏右肋下及剑突下5 cm，脾肋下未及。肝功能：天冬氨酸转氨酶(AST) 1 334 nmol/(s*L) (80 U/L)，丙氨酸转氨酶(ALT) 1 234 nmol/(s*L) (74U/L)，胆红素阴性。皮肤活检示淋巴细胞浸润。诊断为轻度GVHD。于+16 d予泼尼松2 mg/(kg*d)口服，症状无改善；于+18 d改用甲基强的松龙20 mg/(kg*d)静脉滴注，+21 d剂量减半；+26 d皮疹完全消退，改为泼尼松0.75 mg/(kg*d)口服，逐渐减量，以小剂量维持治疗。+32 d肝右肋下2 cm，剑突下5.5 cm。
三、 植入证据
1.直接证据：(1)性染色体：术前查患儿性染色体为46，XX。+24 d当外周血WBC为22.3×109/L时作染色体核型分析：计数50个分裂相，染色体总数46条，证实为供者(男性)核型，达100%。+54 d和+470 d结果为100%呈供者型(全部为XY)。(2)地贫基因：于+20 d和+470 d经PCR-RDB法证实患儿β-珠蛋白基因已从β17/654双重杂合子转为β17杂合子。
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2.间接证据：(1)自+20 d起停止RBC输注，Hb一直保持在85～121 g/L之间，且随时间推移，至+40 d后Hb>110 g/L， +470 d Hb达128 g/L。(2) +40 d 时Hb电泳HbA2，HbF正常，+240 d HbA2 0.044，HbF 0.02。+100 d和+470 d骨髓象正常，肝脾均不大。(3) +16 d～+26 d，皮疹经病理证实为淋巴细胞浸润，符合aGVHD。
讨论
一、 关于移植后造血重建
本例采用allo-PBSCT治疗的重型β地贫患儿经性染色体检测证实为100%供者型46，XY，PCR-RDB法检测β地贫基因从CD17(C→A)/654(C→T)双重杂合子转为β17杂合子，临床上已纠正贫血15个月余，Hb维持在110 g/L以上，随访475 d表明：受者重型β地贫已获纠正，近期移植成功。
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本例ANC>0.5×109/L为+13 d，与香港 Li等[2]以allo-PBSCT治疗本病时植入的时间(9 ～18 d)一致。比骨髓移植(BMT)治疗本病的植入时间(7～55 d)平均减少18 d[3]，故在造血重建中优于BMT。快速重建造血可减轻患儿家属的经济负担，缩短平均住院时间，减少由于WBC低下继发性感染的发生机会，减少输血制品的次数和量，从而减少血源性疾病的感染机会。
本例植入具有以下有利因素：(1)患儿年龄小(仅2.5岁)，由于病程短，接受输血的次数少(仅4次，共800 ml)，血清铁蛋白<2 000 μg/L，无必要使用desferal除铁治疗等。按国际上的分类法属Ⅰ度患者[4]，其造血干细胞移植术的成功率达80%以上。(2)预处理方案更为合理。尽管该例患儿呈混合嵌合体(MC)状态，Hb>108 g/L已2年半。但文献报道BMT的MC状态患者排斥率高达20 %。为克服原发性、继发性排斥反应，争取移植长期成功，Issaragrisil 等[5]报道Bu加大至600 mg/m2，Lin 等[6]则为16～18 mg/kg，马法兰90 mg/m2，均收到了良好的植入效果。故我们加强了本例患儿的预处理方案：把Bu增加至20 mg/kg，加入马法兰90 mg/m2，初步结果表明本例植入呈供者型，达到了预期目的。(3)一般认为allo-PBSCT的重建造血MNCs阈值为(4～8)×108/kg，而β地贫患儿的重建造血阈值尚不清楚。香港学者报道allo-PBCST治疗的3例受者获得的NC数分别为13.42×108/kg、7.85×108/kg和13.76×108/kg，CD+34细胞则分别为17.04×106/kg、5.25×106/kg和5.66×106/kg，而后2例植入均因间质性肺炎等合并症死亡[2]。至今国内仍无allo-PBSCT成功治疗本病的长期无病存活的报道。本例的NC数为14.4×108/kg，CD+34细胞数14.9×106/kg，分为0 d和 +1 d输注，获得了成功。
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二、 关于aGVHD
国外采用造血干细胞移植(HSCT)成功治疗本病已达1 000余例，但以BMT为主，文献检索到的allo-PBSCT治疗本病只有5例。原因是多方面的，其中GVHD是令人关注的问题。基础研究表明：动员的外周血T细胞比骨髓高一个对数级，且以成熟淋巴细胞为主，后者参与了aGVHD的发生。以目前allo-PBSCT治疗各种疾病的资料分析，其GVHD的严重程度与BMT无明显差异[2]。本例于术后曾出现aGVHDⅠ度，经甲基强的松龙治疗很快被控制，并于2周内皮疹全部消失，现为475 d，仍无慢性GVHD (cGVHD)，初步表明小儿allo-PBSCT的aGVHD和cGVHD并不比BMT者严重。目前认为可能的原因：(1) aGVHD主要与供、受者间HLA相合程度有关而与T细胞数无关；(2) CD4/CD8比值高于成人，G-CSF动员的PBSC中T细胞不同于骨髓(PBSC中分泌IFN的细胞数少于骨髓)，而且具有抑制GVHD的作用。
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三、关于PLT延迟恢复
本例术后多次骨髓象结果表明，患儿的巨核细胞多而产血小板型巨核细胞缺如，表明巨核细胞系已植入并增殖，诊断为继发性血小板减少。推测可能与预处理时免疫系统被严重摧毁，而重建的免疫功能尚处于紊乱状态，引起免疫性血小板减少。经采用大剂量IVIG，甲基强的松龙“冲击”和肾上腺皮质激素口服等综合治疗，患儿的PLT于+69 d已恢复正常，也证实了免疫因素的存在和治疗的有效性。
志谢 本研究的部分工作承香港中文大学威尔斯亲王医院儿科李志光顾问医生、广州市中心血站田兆嵩教授、本校医学遗传室曾瑞萍教授等的帮助
参考文献
1，黄绍良，方建培，周敦华，等.脐血造血干细胞移植治疗重型β地中海贫血.中华儿科杂志，1998,36:671-673.
2，Li CK, Patrick M P Yuen, Chik KW，et al. Allogeneic peripheral blood stem cell transplant in children. Med Pediatr Oncol, 1998,30:147-151.
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3，Lucarelli G, Polchi P, Gallimberti M, et al. Marrow transplantation for thalassemia following busulphan and cyclophosphamide. Lancet, 1985,1:1355-1357.
4，Lucarelli G, Galimberti M, Polchi P, et al. Bone marrow transplantation in thalassemia. New Eng J Med,1990,322:417-421.
5，Issaragrisil S, Suratte V, Visnthisakchai S, et al. Bone marrow and cord blood stem cell transplantation for thalassemia in Thailand. BMT,1997,19 Suppl 2:54-56.
6，Lin HP, Clan LL, Lam SK, et al. Bone marrow transplantation for thalassacmia: the experience from Malaysia. BMT,1997,19 Suppl 2:74-77.
(收稿日期：1999-10-10), 百拇医药
单位：方建培(510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科)；陈纯(510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科)；黄绍良(510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科)；吴燕峰(510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科)；包蓉(510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科)
关键词：β地中海贫血经；造血干细胞移植
中华儿科杂志000909 【摘要】 目的 观察异基因外周血造血干细胞移植治疗重型β地中海贫血(简称β地贫)的疗效和副作用。方法 1例β地贫双重杂合子(β17/IVS-II-654突变点)患儿经总量马利兰20 mg/kg，环磷酰胺200 mg/kg、马法兰90 mg/m2和抗胸腺淋巴细胞球蛋白90 mg/kg组成的方案预处理后，输入人类白细胞抗原(HLA)相合的同胞供体外周血造血干细胞悬液56 ml。患儿获得的有核细胞数为14.4×108 /kg，粒单系祖细胞(CFU-GM) 9.5×105 /kg，CD+34CD-38细胞数为14.9×106/ kg。结果 患儿术后13 d时中性粒细胞绝对值(ANC)>0.5×109 /L，40 d 时血小板>20×109 /L；术后20 d聚合酶链反向点杂交法(PCR-RDB)检测患儿为供者型的β17杂合子，性染色体核型从46XX转变为46XY(供者型)。术后20 d起脱离红细胞输注，血红蛋白维持在110 g/L以上，100 d时复查骨髓细胞形态学正常，肝脾不大。16 d时出现急性移植物抗宿主病(aGVHD)I度，经使用甲基强的松龙和泼尼松治疗，于26 d 时aGVHD完全被控制。至今未发生慢性GVHD，现已术后无病存活475 d。结论 异基因外周血造血干细胞移植治疗重型β地贫患儿已获得成功。其出现的aGVHD 可被药物控制。
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Allogeneic peripheral blood stem cells transplantation for treating a patient with β-thalassemia major
FANG Jianpei，CHEN Chun，HUANG Shaoliang
(Department of Pediatrics, Sun Yatsen Memorial Hospital,Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120, China)
【Abstract】 Objective To observe the efficacy and side effects of allogeneic peripheral blood stem cells transplantation (Allo-PBSCT) for the treatment of a patient with β-thalassemia major. Methods After conditioning with chemotherapy consisting of busulfan 20 mg/kg, cyclophosphamide 200 mg/kg, melphalan 90 mg/m2 and antithymocyte globulin (ATG) 90 mg/kg, the patient with β-thalassemia of double heterozygosities (mutation sites at CD17 and IVS-II-654) received 56 ml of PBSC which included 14.4×108/kg nucleated cells (NC), 9.5×105/kg colony forming unit-granulocyte and macrophage (CFU-GM) and 14.9×106/kg CD+34CD-38 cells donated by the sibling with the identical HLA. Results The absolute nucleated cell (ANC) numbers reached 0.5×109/L 13 days post-PBSCT. The platelet reached 20×109/L 40 days post-PBSCT. The donor's heterozygosity of CD17 mutation site was only detected by the PCR-RDB at the 20th day. The karyotype changed to 46XY (donor type) from 46XX post transplantation. The hemoglobin of the patient was kept over 110g/L without red blood cells transfusion from the 20th day post transplantation. Normal bone marrow cell morphology presented at the 100th day post-PBSCT. The patient's liver and spleen did not enlarge. The acute graft-versus-host disease (aGVHD) of I° happened at the 16th day, and was controlled at the 26th day by treatments with methoprednisolone and prednisone. There was no chronic GVHD. The patient was free of the disease and survived for 475 days after Allo-PBSCT.Conclusion The results showed that Allo-PBSCT was successful in treating β-thalassemia major. This is the 1st report on treatment of β-thalassemia major with allo-PBSCT in China.
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【Key words】 beta-Thalassemia; Hemotopoietic stem cell transplantation
本研究组曾报道国内首例脐血移植(UCBT)成功治疗重型β地中海贫血(简称β地贫)[1]，但人类白细胞抗原(HLA)相合同胞脐血来源困难。为寻找新的造血干细胞来源，1999年4月，我们用HLA相合的血缘相关供者异基因外周血造血干细胞移植(allo-PBSCT)成功治疗β地贫1例。报告如下。
对象和方法
一、对象
患儿女，2岁5个月，确诊β地贫约2年，于1999年3月11日入院。体检：肝肋下3 cm，脾肋下1.5 cm，血红蛋白(Hb)57 g/L，血红蛋白A2(HbA2)为0.022，血红蛋白F(HbF) 0.759。β地贫基因分析为：β17(A→T)/IVS-II-654(C→T)双重杂合子。为维持Hb 90 g/L，共输注浓缩红细胞800 ml，未使用去铁胺(desferal)。移植前肝右肋下2 cm，质中、边锐，脾肋下未及。骨髓象符合溶血性贫血。肝、肾功能均正常，抗乙型肝炎病毒(HBV)、抗丙型肝炎病毒(HCV)、抗甲型肝炎病毒(HAV)抗体均阴性，巨细胞病毒(CMV)抗体IgG及聚合酶链反应检测CMV-DNA均阴性，血清铁蛋白为1 394 μg/L。
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二、方法
1.供者及HLA配型： 供者为患儿胞兄，14岁，体重52 kg，体检正常。抗HBV、HCV抗体均阴性，CMV抗体IgG(-)。Hb 132 g/L，HbA2 0.04，HbF 0.028，β地贫基因分析为β17杂合子。其HLA配型与受者全相合(表1)。供、受者ABO血型均为“B”。
表1 供者与受者HLA位点配型 供受者
HLA 位点
A
B
Bw
DR
DR(ssp)
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DQ(ssp)
供者
2,-
60(40),46
6,-
14(6),15(2)
14,15
05,-
受者
2,-
60(40),46
6,-
14(6),15(2)
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14,15
05,-
2. 供者外周血造血干细胞(PBSC)动员、收集和保存:1999年3月10日起给供者注射重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-cSF, 日本Kirin公司产品)300 μg/d [6 μg/(kg.d)]，第5天上午检查外周血WBC为 34.8×109 /L，中性粒细胞绝对值(ANC)为29.9×109/L用Baxter公司CS 3000 plus血细胞分离机经循环8 000 ml单次采集，终体积为56 ml。取样本作单个核细胞(MNC)、粒单系祖细胞 (CFU-GM)培养及流式细胞仪(FACS)测CD+34CD-38细胞数。收获MNCs 15.5×109，CFU-GM 6.88×105，CD+34CD-38 18.4×107，造血干细胞输注加防冻剂(由DMSO，人血白蛋白和1640组成)经程控降温后置于-196℃液氮中保存备用。
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三、移植过程
1.预处理方案： 马利兰(Busulfan, Bu)20 mg/kg每天分4次(术前第9天至第6天，即-9 d～-6 d，下同)口服；环磷酰胺200 mg/kg，分4 d，(-5 d～-2 d)；马法兰90 mg/m2，分2 d(-5 d～-4 d)口服；马抗胸腺淋巴细胞球蛋白90 mg/kg分3 d(-4 d～-2 d)静脉注射。
2.造血干细胞输注(PBSC)： 1999年4月3日(0 d)和4月4日(+1 d)将在液氮中保存20 d的PBSC分批于3 min内融冻后快速从右锁骨下静脉穿刺导管输入患儿体内，同时予碱化尿液、镇静、水化、利尿等综合治疗。复温后输入PBSC的有核细胞(NC)数为14.4×108 /kg(受者体重，下同)，CFU-GM 9.5×105 /kg ，CD+34CD-38 14.9×106 /kg，锥虫蓝拒染率为100%。
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3.治疗经过：患儿入住洁净室内，专人护理。预处理至植入期间予无菌饮食、肠道清洁、消毒，使用无环鸟苷、氟康唑和静脉用丙种球蛋白(IVIG)等防治感染。应用硫乙磺酸钠(美斯钠，mesna)预防出血性膀胱炎。用环孢菌素A(CsA)预防急性移植物抗宿主病(aGVHD)：-1 d起予以CsA 3 mg/(kg*d) 静脉滴注，至+33 d当aGVHD控制后改CsA口服并定期查血清CsA浓度，渐减量维持。为预防肝静脉阻塞综合征，于-9 d起至+21 d使用复方丹参注射液和前列腺素E1(PGE1)，后者按0.3 μg/(kg*h)维持。+3 d至+31 d，予rhG-CSF静脉 或皮下注射(Kirin公司和中外制药产品)。当Hb<60 g/L，血小板(PLT)<20×109 /L或患儿PLT减少而出血时，给予经γ-射线20 Gy～30 Gy照射的成分血输注(加血细胞过滤器)。总计输注红细胞400 ml，PLT 9 U (每U含PLT数为2.0×1011)。结果
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一、 移植后造血重建
外周血干细胞移植(PBSCT)后+3 d WBC数为0，持续3 d，+13 d ANC>0.5×109 /L，WBC达2.9×109 /L，+17 d WBC达高峰为14.2×109 /L，G-CSF减量后WBC下降，+19 d为3.0×109/L，停用G-CSF， +31 d WBC为4.6×109/L。此后，一直稳定在(4.4～7.6)×109/L之间。当+17 d WBC为 14.2×109/L时，患儿出洁净室，+20 d起停止RBC输注；+21 d后Hb为 94～122 g/L。PLT于+8 d下降为32×109/L，+40 d起>30×109/L，停止PLT的输注。因患儿PLT一直处于低水平，+36 d复查骨髓象为骨髓增生明显活跃，粒系0.64，红系0.23，粒、红系统正常。巨核细胞79个/片，其中分类27个，全片未见产板巨核细胞，血小板分布稀疏，偶见大型。故临床诊断为PBSCT合并免疫性血小板减少性紫癜。于+43 d予大剂量IVIG 1 g/(kg.次)冲击，+45 d PLT为31×109/L，+46 d予甲基强的松龙30 mg/(kg*d)静脉滴注3 d后减半，用半量2 d后改泼尼松口服，自+54 d后PLT上升并维持在(40～85)×109/L，+69 d为85×109 /L。+86 d后PLT>100×109/L，+71 d复查骨髓象示骨髓增生明显活跃，粒系0.48，红系0.46，巨核细胞27个/片，其中分类25个，产血小板巨核细胞1个。
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二、aGVHD的治疗
+16 d 患儿双足底、双掌心、胸腹部、臀部、面部出现散在暗红斑丘疹，面积<25%。肝脏右肋下及剑突下5 cm，脾肋下未及。肝功能：天冬氨酸转氨酶(AST) 1 334 nmol/(s*L) (80 U/L)，丙氨酸转氨酶(ALT) 1 234 nmol/(s*L) (74U/L)，胆红素阴性。皮肤活检示淋巴细胞浸润。诊断为轻度GVHD。于+16 d予泼尼松2 mg/(kg*d)口服，症状无改善；于+18 d改用甲基强的松龙20 mg/(kg*d)静脉滴注，+21 d剂量减半；+26 d皮疹完全消退，改为泼尼松0.75 mg/(kg*d)口服，逐渐减量，以小剂量维持治疗。+32 d肝右肋下2 cm，剑突下5.5 cm。
三、 植入证据
1.直接证据：(1)性染色体：术前查患儿性染色体为46，XX。+24 d当外周血WBC为22.3×109/L时作染色体核型分析：计数50个分裂相，染色体总数46条，证实为供者(男性)核型，达100%。+54 d和+470 d结果为100%呈供者型(全部为XY)。(2)地贫基因：于+20 d和+470 d经PCR-RDB法证实患儿β-珠蛋白基因已从β17/654双重杂合子转为β17杂合子。
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2.间接证据：(1)自+20 d起停止RBC输注，Hb一直保持在85～121 g/L之间，且随时间推移，至+40 d后Hb>110 g/L， +470 d Hb达128 g/L。(2) +40 d 时Hb电泳HbA2，HbF正常，+240 d HbA2 0.044，HbF 0.02。+100 d和+470 d骨髓象正常，肝脾均不大。(3) +16 d～+26 d，皮疹经病理证实为淋巴细胞浸润，符合aGVHD。
讨论
一、 关于移植后造血重建
本例采用allo-PBSCT治疗的重型β地贫患儿经性染色体检测证实为100%供者型46，XY，PCR-RDB法检测β地贫基因从CD17(C→A)/654(C→T)双重杂合子转为β17杂合子，临床上已纠正贫血15个月余，Hb维持在110 g/L以上，随访475 d表明：受者重型β地贫已获纠正，近期移植成功。
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本例ANC>0.5×109/L为+13 d，与香港 Li等[2]以allo-PBSCT治疗本病时植入的时间(9 ～18 d)一致。比骨髓移植(BMT)治疗本病的植入时间(7～55 d)平均减少18 d[3]，故在造血重建中优于BMT。快速重建造血可减轻患儿家属的经济负担，缩短平均住院时间，减少由于WBC低下继发性感染的发生机会，减少输血制品的次数和量，从而减少血源性疾病的感染机会。
本例植入具有以下有利因素：(1)患儿年龄小(仅2.5岁)，由于病程短，接受输血的次数少(仅4次，共800 ml)，血清铁蛋白<2 000 μg/L，无必要使用desferal除铁治疗等。按国际上的分类法属Ⅰ度患者[4]，其造血干细胞移植术的成功率达80%以上。(2)预处理方案更为合理。尽管该例患儿呈混合嵌合体(MC)状态，Hb>108 g/L已2年半。但文献报道BMT的MC状态患者排斥率高达20 %。为克服原发性、继发性排斥反应，争取移植长期成功，Issaragrisil 等[5]报道Bu加大至600 mg/m2，Lin 等[6]则为16～18 mg/kg，马法兰90 mg/m2，均收到了良好的植入效果。故我们加强了本例患儿的预处理方案：把Bu增加至20 mg/kg，加入马法兰90 mg/m2，初步结果表明本例植入呈供者型，达到了预期目的。(3)一般认为allo-PBSCT的重建造血MNCs阈值为(4～8)×108/kg，而β地贫患儿的重建造血阈值尚不清楚。香港学者报道allo-PBCST治疗的3例受者获得的NC数分别为13.42×108/kg、7.85×108/kg和13.76×108/kg，CD+34细胞则分别为17.04×106/kg、5.25×106/kg和5.66×106/kg，而后2例植入均因间质性肺炎等合并症死亡[2]。至今国内仍无allo-PBSCT成功治疗本病的长期无病存活的报道。本例的NC数为14.4×108/kg，CD+34细胞数14.9×106/kg，分为0 d和 +1 d输注，获得了成功。
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二、 关于aGVHD
国外采用造血干细胞移植(HSCT)成功治疗本病已达1 000余例，但以BMT为主，文献检索到的allo-PBSCT治疗本病只有5例。原因是多方面的，其中GVHD是令人关注的问题。基础研究表明：动员的外周血T细胞比骨髓高一个对数级，且以成熟淋巴细胞为主，后者参与了aGVHD的发生。以目前allo-PBSCT治疗各种疾病的资料分析，其GVHD的严重程度与BMT无明显差异[2]。本例于术后曾出现aGVHDⅠ度，经甲基强的松龙治疗很快被控制，并于2周内皮疹全部消失，现为475 d，仍无慢性GVHD (cGVHD)，初步表明小儿allo-PBSCT的aGVHD和cGVHD并不比BMT者严重。目前认为可能的原因：(1) aGVHD主要与供、受者间HLA相合程度有关而与T细胞数无关；(2) CD4/CD8比值高于成人，G-CSF动员的PBSC中T细胞不同于骨髓(PBSC中分泌IFN的细胞数少于骨髓)，而且具有抑制GVHD的作用。
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三、关于PLT延迟恢复
本例术后多次骨髓象结果表明，患儿的巨核细胞多而产血小板型巨核细胞缺如，表明巨核细胞系已植入并增殖，诊断为继发性血小板减少。推测可能与预处理时免疫系统被严重摧毁，而重建的免疫功能尚处于紊乱状态，引起免疫性血小板减少。经采用大剂量IVIG，甲基强的松龙“冲击”和肾上腺皮质激素口服等综合治疗，患儿的PLT于+69 d已恢复正常，也证实了免疫因素的存在和治疗的有效性。
志谢 本研究的部分工作承香港中文大学威尔斯亲王医院儿科李志光顾问医生、广州市中心血站田兆嵩教授、本校医学遗传室曾瑞萍教授等的帮助
参考文献
1，黄绍良，方建培，周敦华，等.脐血造血干细胞移植治疗重型β地中海贫血.中华儿科杂志，1998,36:671-673.
2，Li CK, Patrick M P Yuen, Chik KW，et al. Allogeneic peripheral blood stem cell transplant in children. Med Pediatr Oncol, 1998,30:147-151.
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3，Lucarelli G, Polchi P, Gallimberti M, et al. Marrow transplantation for thalassemia following busulphan and cyclophosphamide. Lancet, 1985,1:1355-1357.
4，Lucarelli G, Galimberti M, Polchi P, et al. Bone marrow transplantation in thalassemia. New Eng J Med,1990,322:417-421.
5，Issaragrisil S, Suratte V, Visnthisakchai S, et al. Bone marrow and cord blood stem cell transplantation for thalassemia in Thailand. BMT,1997,19 Suppl 2:54-56.
6，Lin HP, Clan LL, Lam SK, et al. Bone marrow transplantation for thalassacmia: the experience from Malaysia. BMT,1997,19 Suppl 2:74-77.
(收稿日期：1999-10-10), 百拇医药