中国人语前非综合征性耳聋患者GJB2基因的突变分析
作者：郑文波 罗建红 郦云 余应年 钱羽力
单位：郑文波(310031 杭州 浙江大学医学院医学分子生物学实验室)；罗建红(310031 杭州 浙江大学医学院医学分子生物学实验室)；郦云(310031 杭州 浙江大学医学院医学分子生物学实验室)；余应年(310031 杭州 浙江大学医学院医学分子生物学实验室)；钱羽力(310031 杭州 浙江大学医学院医学分子生物学实验室)
关键词：聋；基因；突变；多态现象，单链构象
中华儿科杂志001005 【摘要】 目的 分析中国人语前非综合征性耳聋 (NSHI) 患者 GJB2基因编码区的突变。方法采取来自浙江地区43个独立家系的43例语前NSHI患者(包括隐性遗传和散发性)血样，用3对引物经聚合酶链反应(PCR)扩增GJB2基因，产物依次部分重叠覆盖全部编码区1～681 bp片段；用单链构象多态性(SSCP)分析法进行突变筛选,部分异常带型的PCR产物经T克隆、DNA测序以明确突变方式；对有GJB2基因突变的部分患者，做家系分析明确患者纯/杂合子情况。 结果 43例语前NSHI患者中,PCR-SSCP呈明显异常带型者有11例；测序发现3种突变方式和2种多态性改变，最常见的突变方式为235delC。结论 中国人语前NSHI患者存在相当比例的GJB2基因的突变，且有数种不同的突变方式；中国人语前NSHI患者最常见的突变方式为235delC。
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Mutations in the GJB2 gene in Chinese patients with prelingual non-syndromic hearing impairment
ZHENG Wenbo LUO Jianhong LI Yun
(Laboratory of Medical Molecular Biology, Zhejiang University Medical School，Hangzhou 310031，China)
【Abstract】 Objective GJB2 gene is the first gene identified to be responsible for recessive non-syndromic hearing impairment (NSHI). The mutations of this gene were found in 50% of the recessive NSHI cases and in 10%～37% of the sporadic in Caucasoid population. To date, there has been no any report on GJB2 gene mutations in Chinese cases with NSHI. The purpose of this study was to examine mutations in the coding region of GJB2 gene in Chinese patients who have prelingual NSHI, including both recessively inherited and sporadic cases. Methods The authors enrolled 25 cases with recessive and 18 cases with sporadic prelingual NSHI. All the 43 cases (25 males and 18 females) came from unrelated families from the cities of Hangzhou and Ningbo, Zhejiang province, with the age ranged from 9 to 20 years. Samples from 15 persons who have normal hearing were taken and used as control. GJB2 gene sequences of genomic DNAs from the 43 cases were amplified by PCR with three pairs of primers respectively. The products overlapped partially in turn and covered the whole coding region of the gene. They were subjected to single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis. Some of positive samples were T cloned and sequenced to determine their mutation patterns. According to the results of SSCP and DNA sequence, SSCP has been done as well for the samples from family members of some cases in order to further ascertain their mutated GJB2 gene being either homozygous or heterozygous. Results Twenty-six percent (11/43) of the cases examined were found to have apparently abnormal shift of bands on SSCP gels. There were three different patterns of mutation and 2 polymorphisms found in all mutations. The mutation 235delC was the dominant pattern of GJB2 gene mutations in Chinese prelingual NSHI patients，which was present in 19% (16/86 chromosomes). Conclusions Among Chinese prelingual NSHI patients GJB2 gene mutations may exist in considerable proportion with several different patterns of mutations. The most common mutation of GJB2 gene in the studied Chinese cases with prelingual NSHI was 235delC.
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【Key words】 Deafness;genes;Mutation;Polymorphism, single-stranded conformational
语前聋是指出生时或3岁前就出现听力丧失，群体发病率为1/1 000，其中至少一半的患者是由遗传缺陷引起的。70%的遗传性耳聋不伴有其他症状，称为非综合征性耳聋(nonsyndromic hearing impairment，NSHI)。NSHI可以呈常染色体显性、常染色体隐性、X连锁及线粒体遗传，其中以常染色体隐性遗传最为常见，占75%～80%，且症状严重[1] 。目前已定位的NSHI候选基因为49个，10个已被克隆，其中编码连接蛋白26(CX26)的GJB2基因位于人染色体13q11-12上，编码区为681 bp[2] 。研究发现：50% 的白种人常染色体隐性遗传性NSHI与GJB2基因突变有关，即使是散发病例该基因突变也达10%～37%。 目前常染色体隐性遗传性NSHI中，GJB2基因的突变方式有42种，以30delG/ 35delG为多，占70%[3，4]。至今尚无有关中国人遗传性耳聋患者GJB2基因突变的研究报告。本研究旨在分析中国人语前NSHI患者GJB2基因编码区的突变。
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对象和方法
一、 对象
所选的43例患者分别来自43个独立家系，来自浙江省杭州、宁波及附近县市，年龄9～20岁， 其中儿童23例(年龄<15岁)，成人20 例。男性25 例，女性18 例。语前NSHI的病例特点是语前有中、重度感音神经性耳聋，以此为单一症状，多为隐性遗传。挑选的患者均为3岁前发现耳聋，听力检测证实为一级耳聋，排除药物致聋等原因，无智力低下等其他症状，父母听力均正常。 其中隐性遗传性NSHI 25例,标准为患者同代人(仅指兄弟姐妹，包括患者)中至少有两人为耳聋患者(22例)或父母为近亲结婚(3例)；散发性NSHI18例，标准为只有患者一人患耳聋。病例由浙江省杭州市聋哑学校和宁波市鄞县特殊教育学校提供，病史通过家系调查获得，临床测听结果由校医务室提供。
正常对照15人，来自浙江省各县市，入选标准为听力正常，无其他重大疾病，其中男性9 例，女性6 例，年龄19～50岁。
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二、方法
1.基因组DNA的抽提： 采取外周血,盐提取法提取基因组DNA[5]。
2. 聚合酶链式反应(PCR)： GJB2基因编码区用3对引物进行PCR扩增。引物由德国人类遗传研究所合成并提供。引物a序列为：上游 5′-TCTTTT-CCAGAGCAAACCGC- 3′,下游 5′-GACACGAAGATCA-GCTGCAG-3′。上游引物位于mRNA 5′非编码区,距离翻译起始密码子有31 bp,因而突变检测范围相当于起始密码子上游31bp至5′端78个密码子，正确的PCR片段大小应为285 bp。引物b序列为：上游 5′-CCAGGCTGCAAGAACGTGTG-3′,下游 5′-AGCCGTCGTACATGACATAG-3′,扩增范围为172～481 bp, 正确的PCR片段大小应为310 bp。引物c序列为：上游 5′-CTTCTTCCGGGTCATCTTCG-3′，下游 5′-TGAGCACGGGTTGCCTCATC-3′， 扩增范围为420～746 bp，正确的PCR片段大小应为327 bp。反应条件为 94℃变性2 min, 经94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min循环35个周期。用低熔点大范围琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物。
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3.PCR产物的单链构象多态(SSCP)-银染分析： 取3 μl PCR产物，加入加样缓冲液10 μl和7 μl H2O，混匀。100℃变性5 min后立即置于冰浴中5 min。电泳条件为：8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，凝胶大小为80 cm×100 cm×0.75 mm, 缓冲液为0.5×TBE，室温下170V电泳约3 h。将凝胶经常规银染法显示条带，并干燥、拍照。
4.PCR产物的T克隆及测序： 用EcoRV酶切、T4连接酶加T 处理pBluescript SK(+)载体，通过T克隆将部分病例SSCP结果为异常带型的PCR产物亚克隆进pBluescript SK(+)载体，其中一例的PCR产物用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离出两条带，两条带分别切胶纯化、亚克隆进载体。扩增后用自动DNA测序仪(PE310)测序。
5.GJB2基因突变的患者纯/杂合子判定： 根据SSCP和DNA测序结果，对2例有GJB2基因突变的患者，分别采父母血样，行PCR-SSCP-银染分析，明确患者纯/杂合子情况。
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结果
一、PCR产物的凝胶电泳情况
所有样本经引物b、c扩增均获得大小正确的单一条带，分别为310 bp、330 bp。绝大多数样本经引物a扩增获得片段大小正确的单一条带(约285 bp)，但有2例存在较大片段的缺失，一个为纯合子(例10)，另一个为杂合子(例11)(图1)。
二、SSCP-银染结果
15例正常人对照的引物a 扩增产物有3种方式的带型 (图2A)， 与泳道1、2、3带型式样相同的分别有10人、3人、2人。43例患者中，与泳道1、2、3带型式样相同的分别有21例、3例、9例。患者中引物a的PCR产物呈异常带型者有10例，至少有4种不同的异常条带式样,其中7例有相同的式样(图2)。 引物b的PCR产物有2种异常条带式样：明显异常者仅1例；有7例式样一致，但改变不明显，这7例与图2中提到的带型式样一致的7例为相同患者(图3)。引物c的PCR产物未发现明显异常者。
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泳道1～8为引物a扩增产物，9和10分别为引物b和c扩增产物。泳道1和2为正常人对照，泳道3～10为患者。2例存在大片段缺失：泳道6 (例10)为纯合子，泳道7(例11)为杂合子
图1 部分样本GJB2基因PCR扩增片段凝胶电泳结果
(A) 泳道1～3为正常人对照；泳道4～11为患者，分别记为例4～11。正常人对照有3种带型式样：泳道1、2和3。患者中，异常带型有3种：例6、9带型相同，该带型共有7例；例10、11带型各1例。
(B) 泳道1、2为正常人对照，泳道3～7为患者。泳道3、6分别为例6、例9。泳道5(例12)为第4种异常带型式样，仅此一例。
图2 GJB2基因引物a扩增产物的PCR-SSCP分析
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三、T克隆及测序结果
例4和例5各测序一个克隆，突变方式为79GtoA(经查证为多态性)。与例6和例9的引物a扩增产物带型相同的有7例，其中3例测序，突变方式均为235delC (指233 bp～235 bp连续的3个C中缺失1个C)；例10的突变方式为176-191del16(指缺失176 bp～191 bp处的16个碱基)；例11琼脂糖凝胶电泳提示大片段缺失的条带，突变方式为176-191del16，片段大小正确的条带，突变方式235delC；例12测序1个克隆，突变方式为235delC ；例13测序2个克隆，序列相同，均含2种突变：299-300delAT(指缺失299 bp～300 bp处的AT)和257-258GCtoCG(指257 bp～258 bp处的GC置换为CG)。
泳道1、2为正常人对照，3～9为患者。有两种异常带型：泳道9(例13)带型1例；泳道4(例6)、泳道6 (例9)的带型相同，共7例。
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图3 GJB2基因引物b扩增产物的PCR-SSCP分析
引物b扩增产物有7例异常条带式样相同，未测序。相应的，该7例患者引物a的PCR-SSCP的异常式样也相同，突变为235delC。235 bp正好位于引物a、b的共同检测区，故该7例引物b的 PCR产物测序也应为235delC突变。
四、GJB2基因突变的患者纯/杂合子判定
例4和例5的突变方式为79GtoA，这是国际上已报道的多态性。15例正常人对照中，3人为存在79GtoA多态性的纯合子(如例2)，2人为存在79GtoA多态性的杂合子(如例3)，43例患者中，该多态性也普遍存在。
根据建立在PCR-SSCP基础上的家系分析(图4)可知： 例12父亲的GJB2基因被检区无突变，患者的母亲为235delC突变的携带者，同时有79GtoA多态性；例6的父母为235delC 突变的携带者，患者为235delC 突变的纯合子。
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五、43例耳聋患者GJB2基因突变的总结
25例隐性遗传NSHI患者中，7例有GJB2基因突变，检出率为28%(7/25)。其中4例为235delC 突变的纯合子(例6等)，1例为176-191del16突变的纯合子(例10)，1例为299-300delAT突变的纯合子(例13)，1 例为235delC/176-191del16突变的杂合子(例11)。18例散发性语前NSHI患者中， GJB2基因突变检出率为22%(4/18)，其中3例为235delC 突变的纯合子， 1例(例12)为235delC 突变的杂合子，另一个等位基因相应片段上未检测到突变。
43例语前NSHI(隐性遗传性和散发性)患者中， GJB2基因突变的检出率为26%(11/43)。突变方式以235delC为主，存在235delC 突变的病例占总病例的19%(16/86条染色体)， 占总突变的76% (16/21条染色体)。
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泳道1和泳道2为正常人对照。泳道4为患者(例12)，泳道3、5为患者父母。泳道8为患者(例6)，泳道7、9为患者父母。泳道6为以测序证实为235delC突变的克隆为模板的 PCR扩增产物。
图4 患者的 GJB2基因突变的纯/杂合子判定(GJB2基因引
物a扩增产物的PCR-SSCP分析)
讨论
GJB2基因编码连接蛋白26(CX26)，于耳蜗处高水平表达，在细胞缝隙连接通讯中有重要作用。尽管该基因突变导致耳聋的机理尚不清楚，但已确定为耳聋致病基因。GJB2基因定位在人染色体13q11-12上，与Ⅰ型隐性遗传性NSHI有关，GJB2基因的某些特定突变也与Ⅲ型显性遗传性NSHI有关。本研究用PCR-SSCP及DNA测序首次证实中国人语前NSHI(隐性遗传及散发性)患者也存在相当比例的GJB2基因的突变，有数种不同的突变方式。目前国外发现隐性遗传性NSHI中，GJB2基因有42种突变方式，包括本研究检出的3种：235delC、176-191del16和299-300delAT。但例13既存在前述299-300delAT 的突变，同一个等位基因上还有257-258GCtoCG(Ser86Thr)改变，该方式 OMIM无记载，且其他已测样本该位置均为GC。最近从该领域的权威人士Raquel Rabionet 处获悉(个人咨询)，在英国、意大利和西班牙人群中发现257-258GCtoCG为多态性，故我们认为该患者耳聋的主要致病因素是299-300delAT一种突变，257-258GCtoCG与致聋无关。此外79GtoA为国际上已报道的多态性，本研究发现中国人中79GtoA多态性较普遍。
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白种人常染色体隐性遗传性NSHI家系中， GJB2基因突变的检出率为50%。经PCR-SSCP 突变筛选，43例中国人语前NSHI患者中PCR产物呈明显异常带型者有11例，其中隐性遗传性NSHI患者的GJB2编码区的突变检出率为28%(7/25)，散发性患者 为22%(4/18)，表明中国人语前NSHI患者的GJB2基因编码区突变也有相当高的比例，考虑到SSCP方法筛选突变有假阴性，估计该比例应更高些。本研究已测序的样本中，以235delC突变为多，占总患者的19 %(16/86条染色体)，占总突变的76 %(16/21条染色体)，提示中国人最常见的突变方式可能为235delC，与白种人的主要突变方式30/35delG不同。新近Fuse等[6]也报道日本地区20个隐性遗传性NSHI家系中，GJB2基因最常见的突变方式为235delC, 存在235delC突变病例占总病例的18 %(7/40条染色体)，占总突变的64 %(7/11条染色体)，这与我们的报道基本一致。故我们推测东亚地区隐性遗传性耳聋的GJB2基因最常见的突变方式为235delC。
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43例患者中，10例已明确其两个GJB2等位基因均有突变，这符合隐性遗传的特征。此外例12为235delC突变的杂合子，但尚未检出另一突变，其可能位于GJB2基因的调控序列。
本研究通过对43例中国人语前NSHI患者的GJB2基因突变检测，不同程度地明确了部分耳聋患者发病的分子遗传学基础。我们可以逐渐建立起这些患者的基因分析档案，为他们在今后的婚配和生育方面提供遗传学咨询。 鉴于遗传性耳聋多与GJB2基因突变有关，因而该基因突变分析将是耳聋的基因诊断方法的优先组成部分。
参考文献
1，Camp GV, Willems PJ, Smith RJH. Nonsyndromic hearing impairment: unparalleled heterogeneity. Am J Hum Genet, 1997,60:758-764.
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2，Mignon C, Formaget C, Mattei MG,et al. Assignment of connexin 26(GJB2) and 46(GJA3) genes to human chromosome 13q11-q12 and mouse chromosome 14D1-E1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet, 1996,72: 185-186.
3，Estivill X, Fortina P, Surrey S, et al. Connexin-26 mutations in sporadic and inherited sensorineural deafness. Lancet , 1998,351: 394-398.
4，Estivill X, Gasparini P. Mutations in GJB2 in patients with non-syndromic deafness. The connexin-deafness homepage. 2000,2；Available from:URL:http://www. iro.es/cx26mut.htm .
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5，Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res, 1988,16:1215 .
6，Fuse Y, Doi K, Hasegawa T, et al. Three novel connexin26 gene mutations in autosomal recessive non-syndromic deafness. Neuro Report, 1999，10: 1853-1857.
收稿日期：1999-07-19, 百拇医药
单位：郑文波(310031 杭州 浙江大学医学院医学分子生物学实验室)；罗建红(310031 杭州 浙江大学医学院医学分子生物学实验室)；郦云(310031 杭州 浙江大学医学院医学分子生物学实验室)；余应年(310031 杭州 浙江大学医学院医学分子生物学实验室)；钱羽力(310031 杭州 浙江大学医学院医学分子生物学实验室)
关键词：聋；基因；突变；多态现象，单链构象
中华儿科杂志001005 【摘要】 目的 分析中国人语前非综合征性耳聋 (NSHI) 患者 GJB2基因编码区的突变。方法采取来自浙江地区43个独立家系的43例语前NSHI患者(包括隐性遗传和散发性)血样，用3对引物经聚合酶链反应(PCR)扩增GJB2基因，产物依次部分重叠覆盖全部编码区1～681 bp片段；用单链构象多态性(SSCP)分析法进行突变筛选,部分异常带型的PCR产物经T克隆、DNA测序以明确突变方式；对有GJB2基因突变的部分患者，做家系分析明确患者纯/杂合子情况。 结果 43例语前NSHI患者中,PCR-SSCP呈明显异常带型者有11例；测序发现3种突变方式和2种多态性改变，最常见的突变方式为235delC。结论 中国人语前NSHI患者存在相当比例的GJB2基因的突变，且有数种不同的突变方式；中国人语前NSHI患者最常见的突变方式为235delC。
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Mutations in the GJB2 gene in Chinese patients with prelingual non-syndromic hearing impairment
ZHENG Wenbo LUO Jianhong LI Yun
(Laboratory of Medical Molecular Biology, Zhejiang University Medical School，Hangzhou 310031，China)
【Abstract】 Objective GJB2 gene is the first gene identified to be responsible for recessive non-syndromic hearing impairment (NSHI). The mutations of this gene were found in 50% of the recessive NSHI cases and in 10%～37% of the sporadic in Caucasoid population. To date, there has been no any report on GJB2 gene mutations in Chinese cases with NSHI. The purpose of this study was to examine mutations in the coding region of GJB2 gene in Chinese patients who have prelingual NSHI, including both recessively inherited and sporadic cases. Methods The authors enrolled 25 cases with recessive and 18 cases with sporadic prelingual NSHI. All the 43 cases (25 males and 18 females) came from unrelated families from the cities of Hangzhou and Ningbo, Zhejiang province, with the age ranged from 9 to 20 years. Samples from 15 persons who have normal hearing were taken and used as control. GJB2 gene sequences of genomic DNAs from the 43 cases were amplified by PCR with three pairs of primers respectively. The products overlapped partially in turn and covered the whole coding region of the gene. They were subjected to single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis. Some of positive samples were T cloned and sequenced to determine their mutation patterns. According to the results of SSCP and DNA sequence, SSCP has been done as well for the samples from family members of some cases in order to further ascertain their mutated GJB2 gene being either homozygous or heterozygous. Results Twenty-six percent (11/43) of the cases examined were found to have apparently abnormal shift of bands on SSCP gels. There were three different patterns of mutation and 2 polymorphisms found in all mutations. The mutation 235delC was the dominant pattern of GJB2 gene mutations in Chinese prelingual NSHI patients，which was present in 19% (16/86 chromosomes). Conclusions Among Chinese prelingual NSHI patients GJB2 gene mutations may exist in considerable proportion with several different patterns of mutations. The most common mutation of GJB2 gene in the studied Chinese cases with prelingual NSHI was 235delC.
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【Key words】 Deafness;genes;Mutation;Polymorphism, single-stranded conformational
语前聋是指出生时或3岁前就出现听力丧失，群体发病率为1/1 000，其中至少一半的患者是由遗传缺陷引起的。70%的遗传性耳聋不伴有其他症状，称为非综合征性耳聋(nonsyndromic hearing impairment，NSHI)。NSHI可以呈常染色体显性、常染色体隐性、X连锁及线粒体遗传，其中以常染色体隐性遗传最为常见，占75%～80%，且症状严重[1] 。目前已定位的NSHI候选基因为49个，10个已被克隆，其中编码连接蛋白26(CX26)的GJB2基因位于人染色体13q11-12上，编码区为681 bp[2] 。研究发现：50% 的白种人常染色体隐性遗传性NSHI与GJB2基因突变有关，即使是散发病例该基因突变也达10%～37%。 目前常染色体隐性遗传性NSHI中，GJB2基因的突变方式有42种，以30delG/ 35delG为多，占70%[3，4]。至今尚无有关中国人遗传性耳聋患者GJB2基因突变的研究报告。本研究旨在分析中国人语前NSHI患者GJB2基因编码区的突变。
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对象和方法
一、 对象
所选的43例患者分别来自43个独立家系，来自浙江省杭州、宁波及附近县市，年龄9～20岁， 其中儿童23例(年龄<15岁)，成人20 例。男性25 例，女性18 例。语前NSHI的病例特点是语前有中、重度感音神经性耳聋，以此为单一症状，多为隐性遗传。挑选的患者均为3岁前发现耳聋，听力检测证实为一级耳聋，排除药物致聋等原因，无智力低下等其他症状，父母听力均正常。 其中隐性遗传性NSHI 25例,标准为患者同代人(仅指兄弟姐妹，包括患者)中至少有两人为耳聋患者(22例)或父母为近亲结婚(3例)；散发性NSHI18例，标准为只有患者一人患耳聋。病例由浙江省杭州市聋哑学校和宁波市鄞县特殊教育学校提供，病史通过家系调查获得，临床测听结果由校医务室提供。
正常对照15人，来自浙江省各县市，入选标准为听力正常，无其他重大疾病，其中男性9 例，女性6 例，年龄19～50岁。
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二、方法
1.基因组DNA的抽提： 采取外周血,盐提取法提取基因组DNA[5]。
2. 聚合酶链式反应(PCR)： GJB2基因编码区用3对引物进行PCR扩增。引物由德国人类遗传研究所合成并提供。引物a序列为：上游 5′-TCTTTT-CCAGAGCAAACCGC- 3′,下游 5′-GACACGAAGATCA-GCTGCAG-3′。上游引物位于mRNA 5′非编码区,距离翻译起始密码子有31 bp,因而突变检测范围相当于起始密码子上游31bp至5′端78个密码子，正确的PCR片段大小应为285 bp。引物b序列为：上游 5′-CCAGGCTGCAAGAACGTGTG-3′,下游 5′-AGCCGTCGTACATGACATAG-3′,扩增范围为172～481 bp, 正确的PCR片段大小应为310 bp。引物c序列为：上游 5′-CTTCTTCCGGGTCATCTTCG-3′，下游 5′-TGAGCACGGGTTGCCTCATC-3′， 扩增范围为420～746 bp，正确的PCR片段大小应为327 bp。反应条件为 94℃变性2 min, 经94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min循环35个周期。用低熔点大范围琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物。
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3.PCR产物的单链构象多态(SSCP)-银染分析： 取3 μl PCR产物，加入加样缓冲液10 μl和7 μl H2O，混匀。100℃变性5 min后立即置于冰浴中5 min。电泳条件为：8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，凝胶大小为80 cm×100 cm×0.75 mm, 缓冲液为0.5×TBE，室温下170V电泳约3 h。将凝胶经常规银染法显示条带，并干燥、拍照。
4.PCR产物的T克隆及测序： 用EcoRV酶切、T4连接酶加T 处理pBluescript SK(+)载体，通过T克隆将部分病例SSCP结果为异常带型的PCR产物亚克隆进pBluescript SK(+)载体，其中一例的PCR产物用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离出两条带，两条带分别切胶纯化、亚克隆进载体。扩增后用自动DNA测序仪(PE310)测序。
5.GJB2基因突变的患者纯/杂合子判定： 根据SSCP和DNA测序结果，对2例有GJB2基因突变的患者，分别采父母血样，行PCR-SSCP-银染分析，明确患者纯/杂合子情况。
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结果
一、PCR产物的凝胶电泳情况
所有样本经引物b、c扩增均获得大小正确的单一条带，分别为310 bp、330 bp。绝大多数样本经引物a扩增获得片段大小正确的单一条带(约285 bp)，但有2例存在较大片段的缺失，一个为纯合子(例10)，另一个为杂合子(例11)(图1)。
二、SSCP-银染结果
15例正常人对照的引物a 扩增产物有3种方式的带型 (图2A)， 与泳道1、2、3带型式样相同的分别有10人、3人、2人。43例患者中，与泳道1、2、3带型式样相同的分别有21例、3例、9例。患者中引物a的PCR产物呈异常带型者有10例，至少有4种不同的异常条带式样,其中7例有相同的式样(图2)。 引物b的PCR产物有2种异常条带式样：明显异常者仅1例；有7例式样一致，但改变不明显，这7例与图2中提到的带型式样一致的7例为相同患者(图3)。引物c的PCR产物未发现明显异常者。
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泳道1～8为引物a扩增产物，9和10分别为引物b和c扩增产物。泳道1和2为正常人对照，泳道3～10为患者。2例存在大片段缺失：泳道6 (例10)为纯合子，泳道7(例11)为杂合子
图1 部分样本GJB2基因PCR扩增片段凝胶电泳结果
(A) 泳道1～3为正常人对照；泳道4～11为患者，分别记为例4～11。正常人对照有3种带型式样：泳道1、2和3。患者中，异常带型有3种：例6、9带型相同，该带型共有7例；例10、11带型各1例。
(B) 泳道1、2为正常人对照，泳道3～7为患者。泳道3、6分别为例6、例9。泳道5(例12)为第4种异常带型式样，仅此一例。
图2 GJB2基因引物a扩增产物的PCR-SSCP分析
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三、T克隆及测序结果
例4和例5各测序一个克隆，突变方式为79GtoA(经查证为多态性)。与例6和例9的引物a扩增产物带型相同的有7例，其中3例测序，突变方式均为235delC (指233 bp～235 bp连续的3个C中缺失1个C)；例10的突变方式为176-191del16(指缺失176 bp～191 bp处的16个碱基)；例11琼脂糖凝胶电泳提示大片段缺失的条带，突变方式为176-191del16，片段大小正确的条带，突变方式235delC；例12测序1个克隆，突变方式为235delC ；例13测序2个克隆，序列相同，均含2种突变：299-300delAT(指缺失299 bp～300 bp处的AT)和257-258GCtoCG(指257 bp～258 bp处的GC置换为CG)。
泳道1、2为正常人对照，3～9为患者。有两种异常带型：泳道9(例13)带型1例；泳道4(例6)、泳道6 (例9)的带型相同，共7例。
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图3 GJB2基因引物b扩增产物的PCR-SSCP分析
引物b扩增产物有7例异常条带式样相同，未测序。相应的，该7例患者引物a的PCR-SSCP的异常式样也相同，突变为235delC。235 bp正好位于引物a、b的共同检测区，故该7例引物b的 PCR产物测序也应为235delC突变。
四、GJB2基因突变的患者纯/杂合子判定
例4和例5的突变方式为79GtoA，这是国际上已报道的多态性。15例正常人对照中，3人为存在79GtoA多态性的纯合子(如例2)，2人为存在79GtoA多态性的杂合子(如例3)，43例患者中，该多态性也普遍存在。
根据建立在PCR-SSCP基础上的家系分析(图4)可知： 例12父亲的GJB2基因被检区无突变，患者的母亲为235delC突变的携带者，同时有79GtoA多态性；例6的父母为235delC 突变的携带者，患者为235delC 突变的纯合子。
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五、43例耳聋患者GJB2基因突变的总结
25例隐性遗传NSHI患者中，7例有GJB2基因突变，检出率为28%(7/25)。其中4例为235delC 突变的纯合子(例6等)，1例为176-191del16突变的纯合子(例10)，1例为299-300delAT突变的纯合子(例13)，1 例为235delC/176-191del16突变的杂合子(例11)。18例散发性语前NSHI患者中， GJB2基因突变检出率为22%(4/18)，其中3例为235delC 突变的纯合子， 1例(例12)为235delC 突变的杂合子，另一个等位基因相应片段上未检测到突变。
43例语前NSHI(隐性遗传性和散发性)患者中， GJB2基因突变的检出率为26%(11/43)。突变方式以235delC为主，存在235delC 突变的病例占总病例的19%(16/86条染色体)， 占总突变的76% (16/21条染色体)。
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泳道1和泳道2为正常人对照。泳道4为患者(例12)，泳道3、5为患者父母。泳道8为患者(例6)，泳道7、9为患者父母。泳道6为以测序证实为235delC突变的克隆为模板的 PCR扩增产物。
图4 患者的 GJB2基因突变的纯/杂合子判定(GJB2基因引
物a扩增产物的PCR-SSCP分析)
讨论
GJB2基因编码连接蛋白26(CX26)，于耳蜗处高水平表达，在细胞缝隙连接通讯中有重要作用。尽管该基因突变导致耳聋的机理尚不清楚，但已确定为耳聋致病基因。GJB2基因定位在人染色体13q11-12上，与Ⅰ型隐性遗传性NSHI有关，GJB2基因的某些特定突变也与Ⅲ型显性遗传性NSHI有关。本研究用PCR-SSCP及DNA测序首次证实中国人语前NSHI(隐性遗传及散发性)患者也存在相当比例的GJB2基因的突变，有数种不同的突变方式。目前国外发现隐性遗传性NSHI中，GJB2基因有42种突变方式，包括本研究检出的3种：235delC、176-191del16和299-300delAT。但例13既存在前述299-300delAT 的突变，同一个等位基因上还有257-258GCtoCG(Ser86Thr)改变，该方式 OMIM无记载，且其他已测样本该位置均为GC。最近从该领域的权威人士Raquel Rabionet 处获悉(个人咨询)，在英国、意大利和西班牙人群中发现257-258GCtoCG为多态性，故我们认为该患者耳聋的主要致病因素是299-300delAT一种突变，257-258GCtoCG与致聋无关。此外79GtoA为国际上已报道的多态性，本研究发现中国人中79GtoA多态性较普遍。
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白种人常染色体隐性遗传性NSHI家系中， GJB2基因突变的检出率为50%。经PCR-SSCP 突变筛选，43例中国人语前NSHI患者中PCR产物呈明显异常带型者有11例，其中隐性遗传性NSHI患者的GJB2编码区的突变检出率为28%(7/25)，散发性患者 为22%(4/18)，表明中国人语前NSHI患者的GJB2基因编码区突变也有相当高的比例，考虑到SSCP方法筛选突变有假阴性，估计该比例应更高些。本研究已测序的样本中，以235delC突变为多，占总患者的19 %(16/86条染色体)，占总突变的76 %(16/21条染色体)，提示中国人最常见的突变方式可能为235delC，与白种人的主要突变方式30/35delG不同。新近Fuse等[6]也报道日本地区20个隐性遗传性NSHI家系中，GJB2基因最常见的突变方式为235delC, 存在235delC突变病例占总病例的18 %(7/40条染色体)，占总突变的64 %(7/11条染色体)，这与我们的报道基本一致。故我们推测东亚地区隐性遗传性耳聋的GJB2基因最常见的突变方式为235delC。
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43例患者中，10例已明确其两个GJB2等位基因均有突变，这符合隐性遗传的特征。此外例12为235delC突变的杂合子，但尚未检出另一突变，其可能位于GJB2基因的调控序列。
本研究通过对43例中国人语前NSHI患者的GJB2基因突变检测，不同程度地明确了部分耳聋患者发病的分子遗传学基础。我们可以逐渐建立起这些患者的基因分析档案，为他们在今后的婚配和生育方面提供遗传学咨询。 鉴于遗传性耳聋多与GJB2基因突变有关，因而该基因突变分析将是耳聋的基因诊断方法的优先组成部分。
参考文献
1，Camp GV, Willems PJ, Smith RJH. Nonsyndromic hearing impairment: unparalleled heterogeneity. Am J Hum Genet, 1997,60:758-764.
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2，Mignon C, Formaget C, Mattei MG,et al. Assignment of connexin 26(GJB2) and 46(GJA3) genes to human chromosome 13q11-q12 and mouse chromosome 14D1-E1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet, 1996,72: 185-186.
3，Estivill X, Fortina P, Surrey S, et al. Connexin-26 mutations in sporadic and inherited sensorineural deafness. Lancet , 1998,351: 394-398.
4，Estivill X, Gasparini P. Mutations in GJB2 in patients with non-syndromic deafness. The connexin-deafness homepage. 2000,2；Available from:URL:http://www. iro.es/cx26mut.htm .
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5，Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res, 1988,16:1215 .
6，Fuse Y, Doi K, Hasegawa T, et al. Three novel connexin26 gene mutations in autosomal recessive non-syndromic deafness. Neuro Report, 1999，10: 1853-1857.
收稿日期：1999-07-19, 百拇医药