诊断超声与细胞凋亡
作者：杜联芳 张青萍 刘望彭
单位：杜联芳 张青萍(430030 武汉,同济医科大学同济医院超声科)；刘望彭(山西医科大学第一医院超声科)
关键词：超声学;细胞凋亡;睾丸
中华超声影像学杂志000618
【摘要】 目的 探讨诊断超声与细胞凋亡的关系。方法 应用HP 8500彩色多普勒超声诊断仪,持续照射42只大鼠幼仔睾丸30 min,依据照射后取标本时间不同,随机分为7组:对照组为空白照射组,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组分别为照射后即刻、4 h、12 h、24 h、48 h、96 h取材组。用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(TUNEL)技术检测上述各组凋亡细胞。结果 超声照射后即刻取材,睾丸组织凋亡细胞与对照组无差异,照射4 h后凋亡细胞开始增加,12 h继续增加,24 h凋亡细胞达高峰,48 h开始下降,96 h恢复至对照组水平。结论 诊断超声持续照射大鼠幼仔睾丸组织30 min可引起细胞凋亡。
, http://www.100md.com
Diagnostic ultrasound and cell apoptosis
DU Lianfang,ZHANG Qingping,LIU Wangpeng.
(Department of Ultrasound,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030,China)
【Abstract】 Objective To detect the relationship between diagnostic ultrasound and cell apoptosis.Methods Testes of 42 junior male rats were radiated continuously for 30 minutes by HP 8500 color Doppler imaging.Testes were examined at either instant,4,12,24,48 or 96 hours after radiation and control group by in situ terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL).Results The incidence of testicular germ cell apoptosis in the diagnostic ultrasound radiated all groups except the instant group were increased gradually and peaked at 24 hour,but then decreased gradually,and recovered control levels by 96 hour.Conclusions Radiation of continuously 30 minutes by diagnostic ultrasound may rsult in testicular germ cell apoptosis of junior male rats.
, 百拇医药
【Key words】 Ultrasonics;Cell apoptosis;Testis
随着高频探头的问世,超声对小器官疾病的检查和诊断越来越普及,对相应器官的安全性问题亦日益受到重视。但诊断剂量超声与细胞凋亡关系如何,国内外鲜见报道。本研究应用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(TUNEL)技术初步探讨了诊断超声对雄性大鼠幼仔睾丸组织照射后的影响。
材 料 与 方 法
一、实验对象
选用出生后30 d的健康雄性大白鼠42只,体重65～75 g,超声辐射时间均为30 min,根据超声照射后取标本时间不同随机分为7组:对照组为空白照射组,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组分别为超声照射后即刻、4 h、12 h、24 h、48 h、96 h取标本组。
二、实验方法
, http://www.100md.com
使用美国HP 8500型彩色多普勒超声诊断仪,探头频率 7.5 MHz,超声输出功率 6.8 mW,空间平均时间平均声强(Isata)为 3.4 mW/cm2(该声学参数由山西省计量测试研究所使用C-1型毫瓦级超声功率计测试)。探头置于会阴部,直接接触睾丸,采用特制的支架,固定持续照射。根据分组不同,分别于不同时间内用3%戊巴比妥钠30～50 mg/kg腹腔注射,麻醉后取出睾丸,置于福尔马林溶液中固定,常规石蜡包埋,切片,HE染色,光镜观察。经特殊处理的石蜡切片留待TUNEL使用。
三、TUNEL技术
对上述特殊处理的石蜡切片,二甲苯脱蜡,梯度酒精入水,PBS水化玻片,蛋白酶K透化组织,PBS漂洗5 min×3次,TUNEL试剂盒(由德国Boechringer Mannheim公司提供)的酶溶液与标记液以1∶9混合后滴于标本上,37 ℃水浴箱反应75 min,PBS漂洗5 min×3次,加Buffer Ⅱ 37 ℃水浴箱30 min,加Ap-POD 37 ℃水浴箱40 min,在荧光显微镜下观察凋亡细胞。PBS漂洗5 min×3次,加底物37 ℃水浴箱避光30 min,双蒸水终止反应,梯度酒精脱水,明胶树脂封片。阴性对照组标本上只加标记液,不加酶溶液,其余各步同上。光镜下观察凋亡细胞并计数,每张切片选10个高倍视野(1000×),计数正常细胞和凋亡细胞,求出凋亡细胞百分比。
, 百拇医药
四、统计分析
各辐照组间及辐照组与对照组间凋亡细胞比较采用χ2检验。
结 果
一、HE染色光镜结果
正常大鼠幼仔的睾丸组织,光镜下表现为整齐排列的曲细精管,其内各级生精细胞由基膜到管腔方向依次为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞,而精子细胞和精子在30 d幼鼠尚未见到。曲细精管之间排列紧密,间质组织稀少,而超声照射后曲细精管之间间隙增大,各级生精细胞排列紊乱,以精原细胞向管腔中央移位最明显。
二、TUNEL标记后荧光显微镜观察结果
通过TUNEL技术,凋亡细胞在荧光显微镜下表现为实性不均匀性绿色结构,细胞形态完整,多为圆形,周边染色较深,中心有淡染区。阴性对照组无上述阳性细胞,对照组偶见阳性细胞,而超声照射组依照射后取标本时间不同而阳性细胞有差异,以照射后24 h凋亡细胞最多。
, 百拇医药
三、底物复染后光镜观察结果
超声持续照射30 min后,不同时间取标本,各组凋亡细胞的计数结果见表1。照射后4 h凋亡细胞开始增加(图1),24 h达高峰(图2)。
表1 辐照组与对照组凋亡细胞比较(
±s) 组别
例数
凋亡细胞数(个/1000倍视野)
凋亡细胞百分比(%)
对照组
6
0.85±0.51
, 百拇医药
0.67±0.19
Ⅰ组
6
0.83±0.76
0.66±0.32
Ⅱ组
6
2.43±1.07*
1.64±0.72*
Ⅲ组
6
4.51±1.65*
, 百拇医药
2.68±1.14*
Ⅳ组
6
12.86±3.18*
7.64±3.85*
Ⅴ组
6
7.03±2.66*
4.18±1.97*
Ⅵ组
6
, 百拇医药
0.91±0.41△
0.52±0.23△
注:与对照组及各辐照组相比,*P<0.01;与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组相比,△P<0.01讨 论
在活体组织中,单个细胞受其内在基因编程的调节,通过主动的生化过程而自杀死亡的现象,称程序化细胞死亡(programmed cell death,PCD),病理学上又将其称为凋亡(apoptosis)。早在1972年Kerr等[1]从形态学上详细描述了细胞凋亡是一种不同于坏死的死亡方式。然而直到近年,发现它的发生机制由基因调控,并与细胞识别和信号传递有关,才引起了人们的高度重视。
早在70年代人们就开始了超声生物效应的研究[2]。但有关超声与细胞凋亡的关系迄今国内外鲜见报道。本研究应用诊断超声对出生后30 d大白鼠幼仔睾丸组织进行30 min持续照射,观察照射后不同时间睾丸曲细精管内各级生精细胞的凋亡情况。其结果为诊断超声对大白鼠幼仔睾丸组织固定持续照射30 min,可引起细胞凋亡。随照射后时间的不同,凋亡细胞数也有差异。正常对照组睾丸组织内偶见单个散在分布的凋亡细胞,其所占比例为(0.67±0.19)%,而照射后即刻处死动物取标本,其凋亡细胞与对照组无差异,说明细胞内合成死亡蛋白需要一定时间。照射后4 h曲细精管内凋亡细胞数增加,达(2.43±1.07)个/1000倍视野,12 h继续增加,24 h达高峰,凋亡率(7.64±3.85)%,48 h开始下降,96 h凋亡细胞恢复至对照组水平。
, 百拇医药
图1 超声照射后4 h睾丸曲细精管内凋亡细胞开始增加,为(2.43±1.07)个/1000倍视野
图2 超声照射后24 h凋亡细胞达高峰,为(12.86±3.18)个/1000倍视野
生殖系统是体现程序性细胞死亡的最好器官,细胞凋亡在调控精子数量方面起关键作用[3-5]。1998年Simsek F等[6]对24例因精索静脉曲张导致不孕症的患者进行精索静脉结扎术,同时取睾丸组织进行凋亡细胞检测,发现该组患者睾丸组织凋亡细胞明显增多,达14.7%,而对照组(前列腺癌患者切除的睾丸组织)凋亡细胞百分比为 2.0%。1997年Turner TT等[7]使大鼠睾丸人为缺血1～2 h制成睾丸扭转模型,用TUNEL技术观察扭转恢复后1、2、4、24、48 h睾丸组织细胞凋亡情况,发现扭转恢复后4 h出现凋亡细胞。而γ-射线诱导的细胞凋亡是在辐照后12 h达高峰,尔后逐渐减少[8],EDS导致睾丸间质细胞凋亡则是在用药24 h达高峰,72 h恢复正常[9],与本研究结果相似。
, 百拇医药
诊断剂量超声照射后,可诱导大鼠幼仔睾丸组织细胞凋亡,说明持续照射30 min,可引起生物体内一系列生物化学反应。普遍认为超声生物效应的产生机制包括热效应、机械效应和空化效应。但超声引起大白鼠睾丸组织细胞凋亡的确切机制、基因调控、蛋白表达目前尚不清楚,超声照射人体后是否诱导凋亡还有待研究。
参 考 文 献
1，Kerr JFR,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kineties.Br J Canecr,1972,26:239-257.
2，Macinlosh IJC,Darey DA.Chromosome aberrations induced by an ultrasonic fetal pulse detector.Br Med J,1970,4:92-96.
, 百拇医药
3，Hikim AP,Lue Y,Swerdloff RS.Separation of germ cell apoptosis from toxin-induced cell death by necrosis using in situ endlabeling.Tissue Cell,19977,29:487-493.
4，Gosden R,Spears N.Programmed cell death in the reproductive system.Br Med Bull,1997,53:644-661.
5，Royere D,Guerif F,Rochereau de Reviers MT,et al.Apoptosis in the male gonad.Contracept Fertil Sex,1998,26:517-521.
6，Simsek F,Turkeri L,Cevik I,et al.Role of apoptosis in testicular tissue damage caused by varicocele.Arch Esp Urol,1998,51:947-950.
, 百拇医药
7，Turner TT,Tung KS,Tomomasa H,et al.Acute testicular ischemia results in germ cell-specific apoptosis in the rat.Biol Report,1997,57:1267-1274.
8，Hasegawa M,Wilson G,Russell LD,et al.Radiation induced cell death in the mouse testis:relationship to apoptsis.Radiat Res,1997,14:457-467.
9，Taylor MF,Woolveridge I,Metcalfe AD,et al.Leydig cell apoptosis in the rat testes after administration of the cytotoxin ethane demethanesul-phonate:role of the bcl-family members.J Endocrinol,1998,157:317-326.
(收稿日期:1999-04-05), 百拇医药
单位：杜联芳 张青萍(430030 武汉,同济医科大学同济医院超声科)；刘望彭(山西医科大学第一医院超声科)
关键词：超声学;细胞凋亡;睾丸
中华超声影像学杂志000618
【摘要】 目的 探讨诊断超声与细胞凋亡的关系。方法 应用HP 8500彩色多普勒超声诊断仪,持续照射42只大鼠幼仔睾丸30 min,依据照射后取标本时间不同,随机分为7组:对照组为空白照射组,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组分别为照射后即刻、4 h、12 h、24 h、48 h、96 h取材组。用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(TUNEL)技术检测上述各组凋亡细胞。结果 超声照射后即刻取材,睾丸组织凋亡细胞与对照组无差异,照射4 h后凋亡细胞开始增加,12 h继续增加,24 h凋亡细胞达高峰,48 h开始下降,96 h恢复至对照组水平。结论 诊断超声持续照射大鼠幼仔睾丸组织30 min可引起细胞凋亡。
, http://www.100md.com
Diagnostic ultrasound and cell apoptosis
DU Lianfang,ZHANG Qingping,LIU Wangpeng.
(Department of Ultrasound,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030,China)
【Abstract】 Objective To detect the relationship between diagnostic ultrasound and cell apoptosis.Methods Testes of 42 junior male rats were radiated continuously for 30 minutes by HP 8500 color Doppler imaging.Testes were examined at either instant,4,12,24,48 or 96 hours after radiation and control group by in situ terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL).Results The incidence of testicular germ cell apoptosis in the diagnostic ultrasound radiated all groups except the instant group were increased gradually and peaked at 24 hour,but then decreased gradually,and recovered control levels by 96 hour.Conclusions Radiation of continuously 30 minutes by diagnostic ultrasound may rsult in testicular germ cell apoptosis of junior male rats.
, 百拇医药
【Key words】 Ultrasonics;Cell apoptosis;Testis
随着高频探头的问世,超声对小器官疾病的检查和诊断越来越普及,对相应器官的安全性问题亦日益受到重视。但诊断剂量超声与细胞凋亡关系如何,国内外鲜见报道。本研究应用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(TUNEL)技术初步探讨了诊断超声对雄性大鼠幼仔睾丸组织照射后的影响。
材 料 与 方 法
一、实验对象
选用出生后30 d的健康雄性大白鼠42只,体重65～75 g,超声辐射时间均为30 min,根据超声照射后取标本时间不同随机分为7组:对照组为空白照射组,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组分别为超声照射后即刻、4 h、12 h、24 h、48 h、96 h取标本组。
二、实验方法
, http://www.100md.com
使用美国HP 8500型彩色多普勒超声诊断仪,探头频率 7.5 MHz,超声输出功率 6.8 mW,空间平均时间平均声强(Isata)为 3.4 mW/cm2(该声学参数由山西省计量测试研究所使用C-1型毫瓦级超声功率计测试)。探头置于会阴部,直接接触睾丸,采用特制的支架,固定持续照射。根据分组不同,分别于不同时间内用3%戊巴比妥钠30～50 mg/kg腹腔注射,麻醉后取出睾丸,置于福尔马林溶液中固定,常规石蜡包埋,切片,HE染色,光镜观察。经特殊处理的石蜡切片留待TUNEL使用。
三、TUNEL技术
对上述特殊处理的石蜡切片,二甲苯脱蜡,梯度酒精入水,PBS水化玻片,蛋白酶K透化组织,PBS漂洗5 min×3次,TUNEL试剂盒(由德国Boechringer Mannheim公司提供)的酶溶液与标记液以1∶9混合后滴于标本上,37 ℃水浴箱反应75 min,PBS漂洗5 min×3次,加Buffer Ⅱ 37 ℃水浴箱30 min,加Ap-POD 37 ℃水浴箱40 min,在荧光显微镜下观察凋亡细胞。PBS漂洗5 min×3次,加底物37 ℃水浴箱避光30 min,双蒸水终止反应,梯度酒精脱水,明胶树脂封片。阴性对照组标本上只加标记液,不加酶溶液,其余各步同上。光镜下观察凋亡细胞并计数,每张切片选10个高倍视野(1000×),计数正常细胞和凋亡细胞,求出凋亡细胞百分比。
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四、统计分析
各辐照组间及辐照组与对照组间凋亡细胞比较采用χ2检验。
结 果
一、HE染色光镜结果
正常大鼠幼仔的睾丸组织,光镜下表现为整齐排列的曲细精管,其内各级生精细胞由基膜到管腔方向依次为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞,而精子细胞和精子在30 d幼鼠尚未见到。曲细精管之间排列紧密,间质组织稀少,而超声照射后曲细精管之间间隙增大,各级生精细胞排列紊乱,以精原细胞向管腔中央移位最明显。
二、TUNEL标记后荧光显微镜观察结果
通过TUNEL技术,凋亡细胞在荧光显微镜下表现为实性不均匀性绿色结构,细胞形态完整,多为圆形,周边染色较深,中心有淡染区。阴性对照组无上述阳性细胞,对照组偶见阳性细胞,而超声照射组依照射后取标本时间不同而阳性细胞有差异,以照射后24 h凋亡细胞最多。
, 百拇医药
三、底物复染后光镜观察结果
超声持续照射30 min后,不同时间取标本,各组凋亡细胞的计数结果见表1。照射后4 h凋亡细胞开始增加(图1),24 h达高峰(图2)。
表1 辐照组与对照组凋亡细胞比较(
±s) 组别例数
凋亡细胞数(个/1000倍视野)
凋亡细胞百分比(%)
对照组
6
0.85±0.51
, 百拇医药
0.67±0.19
Ⅰ组
6
0.83±0.76
0.66±0.32
Ⅱ组
6
2.43±1.07*
1.64±0.72*
Ⅲ组
6
4.51±1.65*
, 百拇医药
2.68±1.14*
Ⅳ组
6
12.86±3.18*
7.64±3.85*
Ⅴ组
6
7.03±2.66*
4.18±1.97*
Ⅵ组
6
, 百拇医药
0.91±0.41△
0.52±0.23△
注:与对照组及各辐照组相比,*P<0.01;与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组相比,△P<0.01讨 论
在活体组织中,单个细胞受其内在基因编程的调节,通过主动的生化过程而自杀死亡的现象,称程序化细胞死亡(programmed cell death,PCD),病理学上又将其称为凋亡(apoptosis)。早在1972年Kerr等[1]从形态学上详细描述了细胞凋亡是一种不同于坏死的死亡方式。然而直到近年,发现它的发生机制由基因调控,并与细胞识别和信号传递有关,才引起了人们的高度重视。
早在70年代人们就开始了超声生物效应的研究[2]。但有关超声与细胞凋亡的关系迄今国内外鲜见报道。本研究应用诊断超声对出生后30 d大白鼠幼仔睾丸组织进行30 min持续照射,观察照射后不同时间睾丸曲细精管内各级生精细胞的凋亡情况。其结果为诊断超声对大白鼠幼仔睾丸组织固定持续照射30 min,可引起细胞凋亡。随照射后时间的不同,凋亡细胞数也有差异。正常对照组睾丸组织内偶见单个散在分布的凋亡细胞,其所占比例为(0.67±0.19)%,而照射后即刻处死动物取标本,其凋亡细胞与对照组无差异,说明细胞内合成死亡蛋白需要一定时间。照射后4 h曲细精管内凋亡细胞数增加,达(2.43±1.07)个/1000倍视野,12 h继续增加,24 h达高峰,凋亡率(7.64±3.85)%,48 h开始下降,96 h凋亡细胞恢复至对照组水平。
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图1 超声照射后4 h睾丸曲细精管内凋亡细胞开始增加,为(2.43±1.07)个/1000倍视野
图2 超声照射后24 h凋亡细胞达高峰,为(12.86±3.18)个/1000倍视野
生殖系统是体现程序性细胞死亡的最好器官,细胞凋亡在调控精子数量方面起关键作用[3-5]。1998年Simsek F等[6]对24例因精索静脉曲张导致不孕症的患者进行精索静脉结扎术,同时取睾丸组织进行凋亡细胞检测,发现该组患者睾丸组织凋亡细胞明显增多,达14.7%,而对照组(前列腺癌患者切除的睾丸组织)凋亡细胞百分比为 2.0%。1997年Turner TT等[7]使大鼠睾丸人为缺血1～2 h制成睾丸扭转模型,用TUNEL技术观察扭转恢复后1、2、4、24、48 h睾丸组织细胞凋亡情况,发现扭转恢复后4 h出现凋亡细胞。而γ-射线诱导的细胞凋亡是在辐照后12 h达高峰,尔后逐渐减少[8],EDS导致睾丸间质细胞凋亡则是在用药24 h达高峰,72 h恢复正常[9],与本研究结果相似。
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诊断剂量超声照射后,可诱导大鼠幼仔睾丸组织细胞凋亡,说明持续照射30 min,可引起生物体内一系列生物化学反应。普遍认为超声生物效应的产生机制包括热效应、机械效应和空化效应。但超声引起大白鼠睾丸组织细胞凋亡的确切机制、基因调控、蛋白表达目前尚不清楚,超声照射人体后是否诱导凋亡还有待研究。
参 考 文 献
1，Kerr JFR,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kineties.Br J Canecr,1972,26:239-257.
2，Macinlosh IJC,Darey DA.Chromosome aberrations induced by an ultrasonic fetal pulse detector.Br Med J,1970,4:92-96.
, 百拇医药
3，Hikim AP,Lue Y,Swerdloff RS.Separation of germ cell apoptosis from toxin-induced cell death by necrosis using in situ endlabeling.Tissue Cell,19977,29:487-493.
4，Gosden R,Spears N.Programmed cell death in the reproductive system.Br Med Bull,1997,53:644-661.
5，Royere D,Guerif F,Rochereau de Reviers MT,et al.Apoptosis in the male gonad.Contracept Fertil Sex,1998,26:517-521.
6，Simsek F,Turkeri L,Cevik I,et al.Role of apoptosis in testicular tissue damage caused by varicocele.Arch Esp Urol,1998,51:947-950.
, 百拇医药
7，Turner TT,Tung KS,Tomomasa H,et al.Acute testicular ischemia results in germ cell-specific apoptosis in the rat.Biol Report,1997,57:1267-1274.
8，Hasegawa M,Wilson G,Russell LD,et al.Radiation induced cell death in the mouse testis:relationship to apoptsis.Radiat Res,1997,14:457-467.
9，Taylor MF,Woolveridge I,Metcalfe AD,et al.Leydig cell apoptosis in the rat testes after administration of the cytotoxin ethane demethanesul-phonate:role of the bcl-family members.J Endocrinol,1998,157:317-326.
(收稿日期:1999-04-05), 百拇医药