淫羊藿对成骨细胞增殖分化的影响
作者：李芳芳 宋士军 李建平 李 恩
单位：(李芳芳、李恩)050017 河北医科大学生化教研室；(宋士军)生理教研室；(李建平)邯钢医院内科
关键词：
中国骨质疏松杂志990223 骨质疏松症是由于衰老或绝经而引起的骨骼退行性病变，属中医“骨痹”范畴。依据“肾主骨”理论，用补肾法治疗骨质疏松取得较好的临床效果。淫羊藿作为传统的补肾壮阳中药，在中医临床治疗骨质疏松症所用的众多有效方药中出现频率较高[1]。其单味药水提液对去睾丸大鼠[2]和复方制剂对去卵巢大鼠[3]有预防骨量丢失的作用。
本研究观察淫羊藿水提液对离体培养成骨细胞增殖和分化的影响。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 药物 淫羊藿(心叶淫羊藿.Epimedium brevicornum Maxim)(购自河北省药材公司)，浸泡1小时，水煮2次，各30分钟，合并提取液并加热浓缩，终浓度1.25g/ml，过滤膜除菌。
1.2 试剂
MTT溶于PBS，浓度5mg/ml，过滤除菌，置棕色瓶，4℃贮存。甲
溶解液，为20%SDS(40gSDS溶于50%二甲基甲酰胺-20%冰醋酸200ml)。
1.3 成骨细胞培养[4] 取新生(24小时以内)大鼠，无菌取颅盖骨，剔除粘附的结缔组织和血管，切碎，经0.25%胰蛋白酶消化15分钟，每3分钟振荡一次，弃去消化液，以0.1%Ⅱ型胶原酶在37℃消化60分钟，每5分钟振荡一次，消化液离心1000转/分钟,8分钟，收集细胞，接种于含15%小牛血清DMEM培养液的培养瓶中，培养瓶置37℃培养箱，24小时换液，2～3天待细胞铺满培养瓶时，经0.25%胰蛋白酶消化，并传代培养，所用实验细胞均为第3代细胞。
, 百拇医药
1.4 细胞增殖检测[5] 细胞按1×104细胞/m1接种于96孔培养板，每孔0.2ml，在含15%小牛血清的DMEM培养液中生长24小时(37℃，5%CO2)，换含有中药(5mg/ml)的培养液，继续培养72小时。吸去培养液，换无血清DMEM液每孔0.1ml，加入10μlMTT溶液，继续培养4小时，停止培养，加入0.1ml甲溶解液。放37℃温箱2小时以后放置于室温。在波长570nm测光吸收度值(OD570)
1.5 细胞碱性磷酸酶活性检测 细胞以1.6×104细胞/cm2接种于50ml培养瓶中，24小时后换含有中药(5mg/ml)的培养液，继续培养72小时，中止培养，用生理盐水洗涤数次后，每瓶加2ml生理盐水，冻融细胞。置-20℃待测。AKP活性测定用氨基氨替比林测酚法，细胞冻融液离心取上清液1ml，加入1ml基质液，温育15分钟，加1ml显色剂，在520nm比色测定。蛋白质测定采用UV吸收法。
, 百拇医药
1.6 统计学处理 组间均值比较的t检验。
2 结果
淫羊藿5mg/ml可促进成骨细胞的增殖(P<0.01)，但对成骨细胞碱性磷酸酶活性无影响(P>0.05)，见附表。
附表 淫羊藿对成骨细胞增殖分化的影响(
)
OD570
AKP活性(u/g蛋白质)
对照组
0.26±0.02(16)
10.92±2.19(8)
, 百拇医药
中药组
0.29±0.03(16)*
11.84±1.98(8)**
注：①()中为例数 ②与对照组比较，*P<0.01 ③与对照组比较，**P>0.053 讨论
中药治疗骨质疏松症，以其含有多种成分可能通过多个环节而起作用。或者通过促激素或类激素作用调整紊乱的内分泌系统，或者直接作用于破骨细胞和成骨细胞。成骨细胞在骨再建中起重要作用，用离体成骨细胞培养可观察到药物对成骨细胞的直接作用。这一方法简便易行，结果可靠，可作为筛选抗骨质疏松活性植物成分的方法。本实验结果表明，淫羊藿可促进成骨细胞的增殖，这表明淫羊藿的抗骨质疏松作用部分是通过刺激成骨细胞增殖而实现。植物性雌激素有黄酮(flavones)、异黄酮(isoflavones)、库玛斯坦(coumestans)，抗骨质疏松药物依普拉芬(ipriflavone)属异黄酮，在小鼠骨源性肉瘤细胞、小鼠骨髓基质细胞、小鼠颅盖骨成骨细胞等细胞模型中，依普拉芬能刺激这些细胞增殖和细胞内AKP的活性和表达，认为依普拉芬有刺激骨形成的作用[6]。淫羊藿主要含总黄酮和多糖两种成分[7]，因此推测总黄酮可能为活性成分，需进一步实验证实。
, 百拇医药
参考文献
1 张荣华，丘和明.中医防治退行性骨质疏松症用药分析.中医药学报，1997，4：30.
2 李青南，吴铁，谢华.淫羊藿提取液对去睾丸大鼠骨代谢的影响.中草药，1993，24(12)：637.
3 李朝阳，吴铁，林柏云，等.芪藿肾宝与乙烯雌酚对去卵巢大鼠骨代谢的影响.中国骨质疏松杂志，1997，3(1)：67.
4 王洪复，关本博，林光义.由胎鼠头盖骨培养骨细胞的实验技术和细胞形态观察.上海医科大学学报，1991，18(6)：475.
5 朱文菁，金慰芳，张丽丽，等.MTT法分析培养成骨细胞的存活和增殖能力.上海医科大学学报，1995，22(4)：254.
6 裴春改，赵燕玲，刘忠厚.依普拉芬治疗骨质疏松的基础研究.中国骨质疏松杂志，1997，3(4)：87.
7 徐美珍，和志铭.淫羊藿属植物的化学研究进展.中国中药杂志，1997，22(10)：631., 百拇医药
单位：(李芳芳、李恩)050017 河北医科大学生化教研室；(宋士军)生理教研室；(李建平)邯钢医院内科
关键词：
中国骨质疏松杂志990223 骨质疏松症是由于衰老或绝经而引起的骨骼退行性病变，属中医“骨痹”范畴。依据“肾主骨”理论，用补肾法治疗骨质疏松取得较好的临床效果。淫羊藿作为传统的补肾壮阳中药，在中医临床治疗骨质疏松症所用的众多有效方药中出现频率较高[1]。其单味药水提液对去睾丸大鼠[2]和复方制剂对去卵巢大鼠[3]有预防骨量丢失的作用。
本研究观察淫羊藿水提液对离体培养成骨细胞增殖和分化的影响。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 药物 淫羊藿(心叶淫羊藿.Epimedium brevicornum Maxim)(购自河北省药材公司)，浸泡1小时，水煮2次，各30分钟，合并提取液并加热浓缩，终浓度1.25g/ml，过滤膜除菌。
1.2 试剂
MTT溶于PBS，浓度5mg/ml，过滤除菌，置棕色瓶，4℃贮存。甲
溶解液，为20%SDS(40gSDS溶于50%二甲基甲酰胺-20%冰醋酸200ml)。1.3 成骨细胞培养[4] 取新生(24小时以内)大鼠，无菌取颅盖骨，剔除粘附的结缔组织和血管，切碎，经0.25%胰蛋白酶消化15分钟，每3分钟振荡一次，弃去消化液，以0.1%Ⅱ型胶原酶在37℃消化60分钟，每5分钟振荡一次，消化液离心1000转/分钟,8分钟，收集细胞，接种于含15%小牛血清DMEM培养液的培养瓶中，培养瓶置37℃培养箱，24小时换液，2～3天待细胞铺满培养瓶时，经0.25%胰蛋白酶消化，并传代培养，所用实验细胞均为第3代细胞。
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1.4 细胞增殖检测[5] 细胞按1×104细胞/m1接种于96孔培养板，每孔0.2ml，在含15%小牛血清的DMEM培养液中生长24小时(37℃，5%CO2)，换含有中药(5mg/ml)的培养液，继续培养72小时。吸去培养液，换无血清DMEM液每孔0.1ml，加入10μlMTT溶液，继续培养4小时，停止培养，加入0.1ml甲
溶解液。放37℃温箱2小时以后放置于室温。在波长570nm测光吸收度值(OD570)1.5 细胞碱性磷酸酶活性检测 细胞以1.6×104细胞/cm2接种于50ml培养瓶中，24小时后换含有中药(5mg/ml)的培养液，继续培养72小时，中止培养，用生理盐水洗涤数次后，每瓶加2ml生理盐水，冻融细胞。置-20℃待测。AKP活性测定用氨基氨替比林测酚法，细胞冻融液离心取上清液1ml，加入1ml基质液，温育15分钟，加1ml显色剂，在520nm比色测定。蛋白质测定采用UV吸收法。
, 百拇医药
1.6 统计学处理 组间均值比较的t检验。
2 结果
淫羊藿5mg/ml可促进成骨细胞的增殖(P<0.01)，但对成骨细胞碱性磷酸酶活性无影响(P>0.05)，见附表。
附表 淫羊藿对成骨细胞增殖分化的影响(
)OD570
AKP活性(u/g蛋白质)
对照组
0.26±0.02(16)
10.92±2.19(8)
, 百拇医药
中药组
0.29±0.03(16)*
11.84±1.98(8)**
注：①()中为例数 ②与对照组比较，*P<0.01 ③与对照组比较，**P>0.053 讨论
中药治疗骨质疏松症，以其含有多种成分可能通过多个环节而起作用。或者通过促激素或类激素作用调整紊乱的内分泌系统，或者直接作用于破骨细胞和成骨细胞。成骨细胞在骨再建中起重要作用，用离体成骨细胞培养可观察到药物对成骨细胞的直接作用。这一方法简便易行，结果可靠，可作为筛选抗骨质疏松活性植物成分的方法。本实验结果表明，淫羊藿可促进成骨细胞的增殖，这表明淫羊藿的抗骨质疏松作用部分是通过刺激成骨细胞增殖而实现。植物性雌激素有黄酮(flavones)、异黄酮(isoflavones)、库玛斯坦(coumestans)，抗骨质疏松药物依普拉芬(ipriflavone)属异黄酮，在小鼠骨源性肉瘤细胞、小鼠骨髓基质细胞、小鼠颅盖骨成骨细胞等细胞模型中，依普拉芬能刺激这些细胞增殖和细胞内AKP的活性和表达，认为依普拉芬有刺激骨形成的作用[6]。淫羊藿主要含总黄酮和多糖两种成分[7]，因此推测总黄酮可能为活性成分，需进一步实验证实。
, 百拇医药
参考文献
1 张荣华，丘和明.中医防治退行性骨质疏松症用药分析.中医药学报，1997，4：30.
2 李青南，吴铁，谢华.淫羊藿提取液对去睾丸大鼠骨代谢的影响.中草药，1993，24(12)：637.
3 李朝阳，吴铁，林柏云，等.芪藿肾宝与乙烯雌酚对去卵巢大鼠骨代谢的影响.中国骨质疏松杂志，1997，3(1)：67.
4 王洪复，关本博，林光义.由胎鼠头盖骨培养骨细胞的实验技术和细胞形态观察.上海医科大学学报，1991，18(6)：475.
5 朱文菁，金慰芳，张丽丽，等.MTT法分析培养成骨细胞的存活和增殖能力.上海医科大学学报，1995，22(4)：254.
6 裴春改，赵燕玲，刘忠厚.依普拉芬治疗骨质疏松的基础研究.中国骨质疏松杂志，1997，3(4)：87.
7 徐美珍，和志铭.淫羊藿属植物的化学研究进展.中国中药杂志，1997，22(10)：631., 百拇医药