脱氢异雄酮对高糖下视网膜毛细血管周细胞增殖的影响
http://www.100md.com
中国糖尿病杂志 2000年第5期第8卷 论 著
程丽霞(山东潍坊医学院内分泌研究室 邮政编码 261042)；董砚虎(山东潍坊医学院内分泌研究室 邮政编码 261042)；王家富(山东潍坊医学院内分泌研究室 邮政编码 261042) 程丽霞 董砚虎 王家富
关键词：视网膜；毛细血管周细胞；葡萄糖
摘要：中国糖尿病杂志000512 摘要 目的 研究脱氢异雄酮(DHEA)对高糖下视网膜毛细血管周细胞增殖的影响。方法 以新鲜牛眼球为材料，分离并培养周细胞；采用3H-TdR掺入法及液体闪烁技术，研究不同浓度的DHEA(10、50、100、500、1 000nmol/L)对周细胞增殖的影响。结果 高浓度葡萄糖(20mmol/L)培养液中加入DHEA(50、100、500、1 000nmol/L)培养周细胞48小时，周细胞的增殖与对照组比较均有显著性差异，其中DHEA为500nmol/L时对周细胞增殖的促进作用最大(增殖率为42.67%)。结论 DHEA可促进高糖下周细胞的增殖，这为筛选临床防治糖尿病视网膜病变的有效药物提供了可靠的依据。
, 百拇医药
The effect of dehydroepiandrostrone to retinal capillary pericytes under high glucose
Cheng Lixia,Dong Yanhu,Wang Jiafu
(Endocrinology Department of Weifang Medical College,Weifang 261042)
Abstract Objective To observe the effect of dehydroepiandrostrone (DHEA) on retinal capillary pericytes' proliferation under high glucose and research the prevention and treatment of diabetic retinopathy (DR).Methods Retinas were dissected from eyes of fresh killed cattle and retinal capillary pericytes were separated and cultured.The effect of DHEA (10、50、100、500、1 000nmol/L) on pericytes' proliferetion was evaluated by 3H-thymidine incorporation and li-quid scintillation techniques.Results There was significant difference between DHEA (50、100、500、1 000nmol/L) and control culturing for 48h.The increasing rate was 42.67% in DHEA of 500nmol/L.Conclusion DHEA could promote pericytes' proliferation under high glucose.This provided reliable evidence for selecting effective drugs for prevention and treatment of DR clinically.
, 百拇医药
Key words Retina Capillary pericytes Glucose
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常见而难治的微血管并发症，严重者可导致失明。因DR的早期症状不明显，多数患者往往在视力明显下降时才被发现，治疗效果一般很差。研究发现，周细胞的丧失是DR的早期病理改变，而且对DR的进展起关键性作用[1]。在DR早期，由于周细胞的丧失，毛细血管失去了正常的张力，继而毛细血管扩张，通透性增加，血-视网膜屏障作用遭到破坏。本研究在细胞培养的基础上，于培养液中加入不同浓度的脱氢异雄酮(DHEA)，旨为观察其在高糖环境中对周细胞增殖的影响，为临床早期预防及治疗DR提供实验依据。
材料与方法
一、材料
1.试剂和仪器：D-葡萄糖、I型胶原酶、DHEA及细胞培养试剂为美国Sigma公司产品；3 H-TdR为中国科学院原子能研究所产品；CO2恒温培养箱及倒置显微镜为日本Nikon公司产品；培养瓶为丹麦Nunclon公司产品；FJ-2102G型双道液体闪炼计数器为西安262厂产品。
, 百拇医药
2.牛眼球来源：牛眼球取自山东省潍坊市坊子区车留庄镇养殖中心，年龄约1岁，体重450kg左右。宰杀后在相对无菌条件下立刻取出眼球，送实验室。
二、方法
1.视网膜毛细血管周细胞的培养及鉴定[2，3]：相对无菌条件下，从屠宰场取新鲜牛眼球，常规处理及消毒眼球。以下的操作在无菌条件下进行：消毒眼球表面，眼前节在相应锯齿缘处被切除；游离神经视网膜，并在视神经乳头处剪下；将神经视网膜置于盛有D-Hank's液的培养皿中，匀浆后经过53μm尼龙网过滤，反复用D-Hank's液冲洗；轻刮尼龙网反面，获取滤过物并置于0.2%的I型胶原酶溶液中，37℃下消化45分钟；将胶原酶溶液移至离心管中，并加入含20%胎牛血清的DMEM培养液4ml，1 500转离心5～10分钟；弃上清液，加入4ml 20%胎牛血清的DMEM培养液，反复吹打；将悬液移至50ml培养瓶中，置37℃、5% CO2培养箱中培养。
, 百拇医药
传至第三代的周细胞用于本研究。
细胞鉴定采用光、电镜观察和培养液中血管性假血友病因子(VWF)含量的测定。
2.周细胞增殖情况的测定：将传至第三代的周细胞以4×104 cell/ml的密度接种于96孔培养板(100μl/孔)，置37℃、5% CO2培养箱中培养，24小时弃培养液，加入含下列不同浓度葡萄糖和DHEA的DMEM培养液：①生理浓度葡萄糖(5mmol/L)下分别加入10、100nmol/L的DHEA；②高浓度葡萄糖(20mmol/L)下分别加入10、50、100、500、1 000nmol/L DHEA[4]，以上每组均设6个孔。将培养板置培养箱中培养48小时，于培养终止前4小时加入3H-TdR 0.5μci/孔，继续培养至48小时，用0.25%的胰蛋白酶消化各孔细胞，用多头细胞收集器将各孔细胞吸至49型玻璃纤维滤纸上，滤纸80℃烘干。于闪烁杯中加闪烁液各5ml，分别将滤纸片放入闪烁液中，以液闪仪测定各孔CPM值，取每组平均值，按公式计算：
, 百拇医药
抑制率=(CPM对照-CPM实验)/CPM对照×100%；
增殖率=(CPM实验-CPM对照)/CPM对照×100%。
3.统计学处理：资料的离散度用
±s表示，统计学分析采用F检验和t检验。
结 果
一、形态学观察
光镜观察：纯化后的周细胞3～5天贴壁，贴壁后呈单层生长，呈多角形状态，伸出较多突起，2周左右达到融合(图1)。电镜观察：正常传代周细胞在透射电镜下观察，胞体较长，细胞之间无明显的紧密连接；胞浆内散在粗面内质网、线粒体、高尔基复合体及多聚核糖体等细胞器，微管微丝丰富，核膜清晰，常染色质呈粗颗粒状散在于核内(图2)。
, 百拇医药
二、血管性假血友病因子的测定结果
血管性假血友病因子(von willebrand factor，VWF)是由血管内皮细胞及骨髓巨核细胞合成的一种大分子糖蛋白。本研究测定培养传至第三代周细胞的旧培养液VWF值，不显示VWF活性。说明本研究培养物未掺杂血管内皮细胞。
三、3H-TdR掺入测定结果
生理浓度葡萄糖(5mmol/L)培养液中加入10、100nmol/L DHEA培养的周细胞，CPM值与对照组比较无显著性差异(表1)。高浓度葡萄糖(20mmol/L)加入DHEA(50、100、500、1 000nmol/L)培养48小时后，CPM值与对照组比较均有显著性差异(表2)。结果表明：DHEA对生理浓度葡萄糖下周细胞的增殖没有影响，而在高糖下对周细胞的增殖具有促进作用。
讨 论
, 百拇医药
正常周细胞位于毛细血管外周，切面呈细长形，有较多的胞浆分支包围血管壁，其功能是支持微血管，防止血管闭合，血液过多外流。当发生DR时，周细胞减少或消失，毛细血管失去正常张力，发生毛细血管扩张，微血管瘤形成，通透性增加。由于周细胞受损，继而内皮细胞受损，导致无细胞结构的毛细血管形成，失去控制血流调节的作用。毛细血管闭塞，幼静脉乃至新生血管形成，纤维增生，最终导致视力障碍，甚至失明[5，6]。因此，周细胞的破坏在DR发病过程中起重要作用，建立周细胞的体外实验模型显得尤为重要。
图1 光镜观察体外培养的正常视网膜毛细血管周细胞×200
图2 电镜观察体外培养的正常视网膜毛细血管周细胞×15K
, 百拇医药
表1 DHEA对生理浓度葡萄糖(5mmol/L)下
周细胞增殖的影响 组别
药物浓度
(nmol/L)
CPM值(±s)
抑制率(%)
P值
对照组
0
990.00±106.10
—
, http://www.100md.com
—
实验组
10
878.00± 62.81
11.31
>0.05
100
912.33± 42.99
7.85
>0.05
表2 DHEA对高糖(20mmol/L)下周细胞增殖的影响 组别
药物浓度
, 百拇医药
(nmol/L)
CPM值(±s)
增殖率(%)
P值
对照组
0
514.00±44.47
—
—
实验组
10
590.00±24.68
, 百拇医药
9.06
>0.05
50
615.50±30.52
13.78
<0.05
100
677.33±41.60
25.20
<0.01
500
771.83±50.71
, 百拇医药
42.67
<0.01
1 000
684.83±28.97
26.59
<0.01
本研究成功地建立了分离和培养视网膜毛细血管周细胞的有效方法。高血糖是造成血管功能紊乱和DR病理生理改变的主要因素之一，其确切的致病机理尚未明了。本研究采用3H-TdR掺入法，发现高糖对体外培养周细胞的增殖有抑制作用。高糖以剂量依赖性方式使体外培养的周细胞数量减少，这种毒性作用不是由细胞内渗透压升高所致，与葡萄糖浓度相同的甘露醇对周细胞的增殖无抑制作用[4，7]。周细胞的增殖需要分子中DNA的复制，应用3H标记的胸腺嘧啶核苷加入培养液中作为合成DNA的原料摄入周细胞分子中，然后掺入到新合成的DNA中，应用液闪仪测定CPM值，新合成的DNA量与周细胞的数量及代谢呈线性关系，从而获得周细胞存活率。因此，高糖对周细胞DNA的合成有抑制作用。
, 百拇医药
本研究在培养液中加入不同浓度的DHEA，采用3H-TdR掺入法，发现DHEA可促进高糖下周细胞的增殖。已有报道，DHEA对恶性肿瘤、动脉粥样硬化和糖尿病均有有益作用，可降低糖尿病鼠的血糖和水消耗，提高靶器官对胰岛素的敏感性，改善其胰岛素抵抗[8，9]。但是，DHEA是否对糖尿病慢性血管并发症起治疗作用尚不清楚。本研究应用体外周细胞培养方法，排除了由于胰岛素敏感性改变所起的作用，而是由于DHEA对周细胞的直接作用。并发现，DHEA对生理浓度葡萄糖下周细胞的增殖无影响，而在高糖下对周细胞的增殖具有促进作用，这与文献报道一致[4]。但其机制有待进一步探讨。
参考文献
1，Schonfelder U,Hofer A,Paul M,et al.In situ observation of living pericytes in rat retinal capillaries.Microvascular Research,1998,56:22.
, http://www.100md.com
2，Gillies MC,Tao S.High glucose inhibits retinal capillary pericyte contractility in vitro.Invest Ophthalmol Vis Sci,1993,34:3396.
3，Mandarino LJ,Finlayson J,Hassell JR.High glucose downregulates glucose transport activity in retinal capillary pericytes but not endothelial cells.Invest Ophthalmol Vis Sci,1994,35:964.
4，Brignardello E,Beltramo E,Molinatti PA,et al.Dehydroepiandro sterone protects bovine retinal capillary pericytes against glucose toxicity.Journal of Endocrinology,1998,158:21.
, 百拇医药
5，程丽霞，隋国良综述.糖尿病视网膜病变的研究进展.国外医学内分泌学分册，1999，3：73.
6，Masakazu M,Shigeru Y,Michiko P,et al.The effect of high glucose and aldose inhibitor (FK366) on myo-inositol uptake in caltured bovine pericytes.Diabetes,1998,47(Suppl 1):A379.
7，Li W,Liu X,Yanoff M,et al.Cultured retinal capillary pericytes die by apoptosis after an abrupt fluctuation from high to low glucose levels:a comparative study with retinal capillary endothelial cells.Diabetologia,1996,39:537.
, 百拇医药
8，Buffington CK,Givens JR,Kitabchi AE,et al.Opposing actions of dehydro epiandrosterone and testosterone on insulin sensitivity.Diabetes,1991,40:693.
9，Buffington CK,Pourmotabbed G,Kitabchi AE,et al.Case report:amelioration of insulin resistance in diabetes with dehydroepiandrosterone.Am J Med,1993,306:320.
(收稿：1999-08-16 修回：2000-04-18), http://www.100md.com
关键词：视网膜；毛细血管周细胞；葡萄糖
摘要：中国糖尿病杂志000512 摘要 目的 研究脱氢异雄酮(DHEA)对高糖下视网膜毛细血管周细胞增殖的影响。方法 以新鲜牛眼球为材料，分离并培养周细胞；采用3H-TdR掺入法及液体闪烁技术，研究不同浓度的DHEA(10、50、100、500、1 000nmol/L)对周细胞增殖的影响。结果 高浓度葡萄糖(20mmol/L)培养液中加入DHEA(50、100、500、1 000nmol/L)培养周细胞48小时，周细胞的增殖与对照组比较均有显著性差异，其中DHEA为500nmol/L时对周细胞增殖的促进作用最大(增殖率为42.67%)。结论 DHEA可促进高糖下周细胞的增殖，这为筛选临床防治糖尿病视网膜病变的有效药物提供了可靠的依据。
, 百拇医药
The effect of dehydroepiandrostrone to retinal capillary pericytes under high glucose
Cheng Lixia,Dong Yanhu,Wang Jiafu
(Endocrinology Department of Weifang Medical College,Weifang 261042)
Abstract Objective To observe the effect of dehydroepiandrostrone (DHEA) on retinal capillary pericytes' proliferation under high glucose and research the prevention and treatment of diabetic retinopathy (DR).Methods Retinas were dissected from eyes of fresh killed cattle and retinal capillary pericytes were separated and cultured.The effect of DHEA (10、50、100、500、1 000nmol/L) on pericytes' proliferetion was evaluated by 3H-thymidine incorporation and li-quid scintillation techniques.Results There was significant difference between DHEA (50、100、500、1 000nmol/L) and control culturing for 48h.The increasing rate was 42.67% in DHEA of 500nmol/L.Conclusion DHEA could promote pericytes' proliferation under high glucose.This provided reliable evidence for selecting effective drugs for prevention and treatment of DR clinically.
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Key words Retina Capillary pericytes Glucose
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常见而难治的微血管并发症，严重者可导致失明。因DR的早期症状不明显，多数患者往往在视力明显下降时才被发现，治疗效果一般很差。研究发现，周细胞的丧失是DR的早期病理改变，而且对DR的进展起关键性作用[1]。在DR早期，由于周细胞的丧失，毛细血管失去了正常的张力，继而毛细血管扩张，通透性增加，血-视网膜屏障作用遭到破坏。本研究在细胞培养的基础上，于培养液中加入不同浓度的脱氢异雄酮(DHEA)，旨为观察其在高糖环境中对周细胞增殖的影响，为临床早期预防及治疗DR提供实验依据。
材料与方法
一、材料
1.试剂和仪器：D-葡萄糖、I型胶原酶、DHEA及细胞培养试剂为美国Sigma公司产品；3 H-TdR为中国科学院原子能研究所产品；CO2恒温培养箱及倒置显微镜为日本Nikon公司产品；培养瓶为丹麦Nunclon公司产品；FJ-2102G型双道液体闪炼计数器为西安262厂产品。
, 百拇医药
2.牛眼球来源：牛眼球取自山东省潍坊市坊子区车留庄镇养殖中心，年龄约1岁，体重450kg左右。宰杀后在相对无菌条件下立刻取出眼球，送实验室。
二、方法
1.视网膜毛细血管周细胞的培养及鉴定[2，3]：相对无菌条件下，从屠宰场取新鲜牛眼球，常规处理及消毒眼球。以下的操作在无菌条件下进行：消毒眼球表面，眼前节在相应锯齿缘处被切除；游离神经视网膜，并在视神经乳头处剪下；将神经视网膜置于盛有D-Hank's液的培养皿中，匀浆后经过53μm尼龙网过滤，反复用D-Hank's液冲洗；轻刮尼龙网反面，获取滤过物并置于0.2%的I型胶原酶溶液中，37℃下消化45分钟；将胶原酶溶液移至离心管中，并加入含20%胎牛血清的DMEM培养液4ml，1 500转离心5～10分钟；弃上清液，加入4ml 20%胎牛血清的DMEM培养液，反复吹打；将悬液移至50ml培养瓶中，置37℃、5% CO2培养箱中培养。
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传至第三代的周细胞用于本研究。
细胞鉴定采用光、电镜观察和培养液中血管性假血友病因子(VWF)含量的测定。
2.周细胞增殖情况的测定：将传至第三代的周细胞以4×104 cell/ml的密度接种于96孔培养板(100μl/孔)，置37℃、5% CO2培养箱中培养，24小时弃培养液，加入含下列不同浓度葡萄糖和DHEA的DMEM培养液：①生理浓度葡萄糖(5mmol/L)下分别加入10、100nmol/L的DHEA；②高浓度葡萄糖(20mmol/L)下分别加入10、50、100、500、1 000nmol/L DHEA[4]，以上每组均设6个孔。将培养板置培养箱中培养48小时，于培养终止前4小时加入3H-TdR 0.5μci/孔，继续培养至48小时，用0.25%的胰蛋白酶消化各孔细胞，用多头细胞收集器将各孔细胞吸至49型玻璃纤维滤纸上，滤纸80℃烘干。于闪烁杯中加闪烁液各5ml，分别将滤纸片放入闪烁液中，以液闪仪测定各孔CPM值，取每组平均值，按公式计算：
, 百拇医药
抑制率=(CPM对照-CPM实验)/CPM对照×100%；
增殖率=(CPM实验-CPM对照)/CPM对照×100%。
3.统计学处理：资料的离散度用
±s表示，统计学分析采用F检验和t检验。结 果
一、形态学观察
光镜观察：纯化后的周细胞3～5天贴壁，贴壁后呈单层生长，呈多角形状态，伸出较多突起，2周左右达到融合(图1)。电镜观察：正常传代周细胞在透射电镜下观察，胞体较长，细胞之间无明显的紧密连接；胞浆内散在粗面内质网、线粒体、高尔基复合体及多聚核糖体等细胞器，微管微丝丰富，核膜清晰，常染色质呈粗颗粒状散在于核内(图2)。
, 百拇医药
二、血管性假血友病因子的测定结果
血管性假血友病因子(von willebrand factor，VWF)是由血管内皮细胞及骨髓巨核细胞合成的一种大分子糖蛋白。本研究测定培养传至第三代周细胞的旧培养液VWF值，不显示VWF活性。说明本研究培养物未掺杂血管内皮细胞。
三、3H-TdR掺入测定结果
生理浓度葡萄糖(5mmol/L)培养液中加入10、100nmol/L DHEA培养的周细胞，CPM值与对照组比较无显著性差异(表1)。高浓度葡萄糖(20mmol/L)加入DHEA(50、100、500、1 000nmol/L)培养48小时后，CPM值与对照组比较均有显著性差异(表2)。结果表明：DHEA对生理浓度葡萄糖下周细胞的增殖没有影响，而在高糖下对周细胞的增殖具有促进作用。
讨 论
, 百拇医药
正常周细胞位于毛细血管外周，切面呈细长形，有较多的胞浆分支包围血管壁，其功能是支持微血管，防止血管闭合，血液过多外流。当发生DR时，周细胞减少或消失，毛细血管失去正常张力，发生毛细血管扩张，微血管瘤形成，通透性增加。由于周细胞受损，继而内皮细胞受损，导致无细胞结构的毛细血管形成，失去控制血流调节的作用。毛细血管闭塞，幼静脉乃至新生血管形成，纤维增生，最终导致视力障碍，甚至失明[5，6]。因此，周细胞的破坏在DR发病过程中起重要作用，建立周细胞的体外实验模型显得尤为重要。
图1 光镜观察体外培养的正常视网膜毛细血管周细胞×200
图2 电镜观察体外培养的正常视网膜毛细血管周细胞×15K
, 百拇医药
表1 DHEA对生理浓度葡萄糖(5mmol/L)下
周细胞增殖的影响 组别
药物浓度
(nmol/L)
CPM值(
±s)抑制率(%)
P值
对照组
0
990.00±106.10
—
, http://www.100md.com
—
实验组
10
878.00± 62.81
11.31
>0.05
100
912.33± 42.99
7.85
>0.05
表2 DHEA对高糖(20mmol/L)下周细胞增殖的影响 组别
药物浓度
, 百拇医药
(nmol/L)
CPM值(
±s)增殖率(%)
P值
对照组
0
514.00±44.47
—
—
实验组
10
590.00±24.68
, 百拇医药
9.06
>0.05
50
615.50±30.52
13.78
<0.05
100
677.33±41.60
25.20
<0.01
500
771.83±50.71
, 百拇医药
42.67
<0.01
1 000
684.83±28.97
26.59
<0.01
本研究成功地建立了分离和培养视网膜毛细血管周细胞的有效方法。高血糖是造成血管功能紊乱和DR病理生理改变的主要因素之一，其确切的致病机理尚未明了。本研究采用3H-TdR掺入法，发现高糖对体外培养周细胞的增殖有抑制作用。高糖以剂量依赖性方式使体外培养的周细胞数量减少，这种毒性作用不是由细胞内渗透压升高所致，与葡萄糖浓度相同的甘露醇对周细胞的增殖无抑制作用[4，7]。周细胞的增殖需要分子中DNA的复制，应用3H标记的胸腺嘧啶核苷加入培养液中作为合成DNA的原料摄入周细胞分子中，然后掺入到新合成的DNA中，应用液闪仪测定CPM值，新合成的DNA量与周细胞的数量及代谢呈线性关系，从而获得周细胞存活率。因此，高糖对周细胞DNA的合成有抑制作用。
, 百拇医药
本研究在培养液中加入不同浓度的DHEA，采用3H-TdR掺入法，发现DHEA可促进高糖下周细胞的增殖。已有报道，DHEA对恶性肿瘤、动脉粥样硬化和糖尿病均有有益作用，可降低糖尿病鼠的血糖和水消耗，提高靶器官对胰岛素的敏感性，改善其胰岛素抵抗[8，9]。但是，DHEA是否对糖尿病慢性血管并发症起治疗作用尚不清楚。本研究应用体外周细胞培养方法，排除了由于胰岛素敏感性改变所起的作用，而是由于DHEA对周细胞的直接作用。并发现，DHEA对生理浓度葡萄糖下周细胞的增殖无影响，而在高糖下对周细胞的增殖具有促进作用，这与文献报道一致[4]。但其机制有待进一步探讨。
参考文献
1，Schonfelder U,Hofer A,Paul M,et al.In situ observation of living pericytes in rat retinal capillaries.Microvascular Research,1998,56:22.
, http://www.100md.com
2，Gillies MC,Tao S.High glucose inhibits retinal capillary pericyte contractility in vitro.Invest Ophthalmol Vis Sci,1993,34:3396.
3，Mandarino LJ,Finlayson J,Hassell JR.High glucose downregulates glucose transport activity in retinal capillary pericytes but not endothelial cells.Invest Ophthalmol Vis Sci,1994,35:964.
4，Brignardello E,Beltramo E,Molinatti PA,et al.Dehydroepiandro sterone protects bovine retinal capillary pericytes against glucose toxicity.Journal of Endocrinology,1998,158:21.
, 百拇医药
5，程丽霞，隋国良综述.糖尿病视网膜病变的研究进展.国外医学内分泌学分册，1999，3：73.
6，Masakazu M,Shigeru Y,Michiko P,et al.The effect of high glucose and aldose inhibitor (FK366) on myo-inositol uptake in caltured bovine pericytes.Diabetes,1998,47(Suppl 1):A379.
7，Li W,Liu X,Yanoff M,et al.Cultured retinal capillary pericytes die by apoptosis after an abrupt fluctuation from high to low glucose levels:a comparative study with retinal capillary endothelial cells.Diabetologia,1996,39:537.
, 百拇医药
8，Buffington CK,Givens JR,Kitabchi AE,et al.Opposing actions of dehydro epiandrosterone and testosterone on insulin sensitivity.Diabetes,1991,40:693.
9，Buffington CK,Pourmotabbed G,Kitabchi AE,et al.Case report:amelioration of insulin resistance in diabetes with dehydroepiandrosterone.Am J Med,1993,306:320.
(收稿：1999-08-16 修回：2000-04-18), http://www.100md.com