糖尿病大鼠肾脏一氧化氮变化与肾小球硬化及非酶糖化的关系
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中国糖尿病杂志 2000年第5期第8卷 短篇报告
吴静(湖南医科大学湘雅医院内分泌科 邮政编码 410008)；韩秀云(湖南医科大学湘雅医院内分泌科 邮政编码 410008)；吴晓英(湖南医科大学电镜教研室)；周建华(湖南医科大学病理教研室) 吴静 韩秀云 吴晓英 周建华
关键词：
摘要：
中国糖尿病杂志000524 肾小球硬化为糖尿病肾病(DN)的病理改变，其基本病变为肾小球基底膜增厚和系膜基质的增生。糖尿病(DM)肾组织胶原蛋白非酶糖化是DM肾小球硬化重要的原因之一[1,2]。有研究表明一氧化氮(NO)具有抑制肾小球系膜细胞外基质积聚的作用，而蛋白非酶糖化致糖基化终产物(AGE)的大量形成则阻碍了NO的抗细胞增殖作用[3]。本实验通过观察链脲佐菌素(STZ) 诱导的DM大鼠在不同病程肾组织NO含量和一氧化氮合酶(NOS)活性、AGE、胶原含量及肾组织形态学变化，探讨DN发病的相关机制。
, 百拇医药
材料和方法
1.材料：选择体重150～200g的雄性SD大鼠60只，随机分为DM组和正常对照组(NC)。DM 组一次性腹腔注射STZ 65mg/kg(美国Sigma公司生产, 用0.1mol/L pH4.5的柠檬酸缓冲液配成2%的溶液)，3天后测血糖，选择血糖≥16.7mmol/L者为DM大鼠。对照组注射相同体积柠檬酸缓冲液。于DM形成后2、8、16周，两组各取相同例数动物，麻醉后采静脉血备测血糖，然后取双肾，右肾于液氮中速冻保存，备测肾组织NO含量和NOS活性、AGE和胶原含量；左肾一半置于Carnoy液中，另一半置于2.5%戊二醛中浸泡固定，做组织学检查。
2.实验室方法：
(1)血糖测定用葡萄糖氧化酶法。
(2)肾组织NO含量和 NOS活性：前者用Griess重氮化反应法测定，后者用分光光度法测定，药盒均由北京军事医学科学研究所提供。
, 百拇医药
(3)肾组织AGE、胶原含量测定：用Monnier方法[4]制备胶原提取液，提取液中羟脯氨酸含量用氯胺 T法测得，再乘以因子7.14即为胶原含量；用荧光分光光度计在370/440 nm处测定消化液的荧光强度，AGE含量以每毫克羟脯氨酸所含荧光强度为一个任意单位(AU)。
(4)肾组织形态学分析：将在Carnoy液中固定后的肾组织石蜡包埋、切片后HE及PAS染色，光镜下观察肾小球病理形态学改变。另取在戊二醛缓冲液中固定的肾组织再切成小组织块，2%锇酸固定、环氧树脂包埋后超薄切片，铅铀双重染色，H-600型电镜下观察。
3.统计学分析：各项指标以均数±标准差(
±s)表示，组间比较用t检验或方差分析。
结 果
, 百拇医药
1.各病程DM大鼠血糖均显著高于NC组(P<0.01)，DM大鼠于2周病程时肾脏NO水平、NOS活性均明显高于NC组(P<0.01)，8、16周病程时则低于同批NC组(P<0.01) (表1)。
2.2周病程时DM大鼠肾组织AGE与对照组无显著性差异，胶原含量则低于NC组(P<0.05)，8、16周病程时DM大鼠上述指标均显著高于同批NC组(P<0.01)(表2)。
表1 各组大鼠肾组织血糖、NO含量及
NOS活性变化(±s) 组别
例
数
病程
, http://www.100md.com
(周)
FBS
(mmol/L)
NO
(μmol/L)
NOS
(nmol/g.min)
DM组
8
2
20.56±6.24*
6.38±0.48*
, 百拇医药
1.190±0.190
NC组
8
4.27±0.48〓
4.99±0.23
0.826±0.172
DM组
7
8
21.06±0.48*
3.71±0.31*
, 百拇医药
0.639±0.090*
NC组
7
6.11±0.92〓
5.03±0.23
0.833±0.147
DM组
7
16
17.19±2.90*
3.17±0.25*
, 百拇医药
0.486±0.098*
NC组
7
4.30±0.77〓
5.07±0.21
0.805±0.175
与同批对照组比较*P<0.01表2 各组大鼠肾组织AGE、胶原
含量变化(±s) 组别
例数
病程
, 百拇医药
(周)
AGE
(AU/mg)
胶原含量
(μg/ml)
DM组
8
2
9.99±1.60
42.52±8.13*
NC组
8
10.85±1.50
, 百拇医药
51.48±4.34
DM组
7
8
19.99±3.50**
60.67±6.04**
NC组
7
13.66±1.80
50.13±4.13
DM组
7
, 百拇医药
16
28.27±3.79**
72.24±10.98**
NC组
7
14.64±2.57
56.56±5.84
与对照组比较*P<0.05,**P<0.01
3.肾组织形态学分析：光镜下显示8、16周DM大鼠存在肾小球系膜区增宽、肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚、系膜及基膜PAS阳性物质增多等变化，2周DM组上述变化不明显。电镜下显示DM大鼠于2周病程时足突融合不明显，基底膜变薄；8周时肾小球足突部分融合，系膜细胞轻度增生，基底膜稍增厚，16周时足突融合，系膜基质增生，基底膜明显增厚。 讨 论
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NO是一种重要的生物调节剂，其合成的关键酶NOS广泛分布于肾组织细胞中。研究发现糖尿病NO表现为由早期的升高到晚期的下降过程[5]。本实验DM大鼠肾组织NO含量及NOS活性在2周时高于对照组，8、16周时则低于对照组，且呈不断下降趋势，与文献报道一致。NO的这种动态变化对DN的发生发展具有重要意义。DN的基本病理改变是肾小球基底膜增厚和系膜基质增生。研究表明，NO具有抗细胞增生作用，其可使细胞外基质合成减少、分解增加而抑止肾小球基质中胶原纤维的积聚[2，6]。本实验DM大鼠于8、16周病程时可见肾小球系膜增生、基底膜增厚、足突融合，并随病程进展而加剧，而2周时上述变化不明显，且基底膜还变薄。病程初期的这种改变可能与此时NO水平增高对肾小球基质胶原聚积的抑制有关；随着病程延长，NO水平下降，NO抗细胞增生作用削弱，则可加剧DM肾小球硬化的病理改变。
病程后期NO下降的机制可能与多种因素有关，而AGE增多对NO的抑制作用是DM后期NO下降的重要原因之一。已知非酶糖化致AGE的形成参与了DN的发病机制，AGE可与肾小球基膜和系膜基质中的胶原蛋白呈不可逆联结，使胶原增多，基底膜增厚[7]；还可通过与NO相作用而使其失活，从而抑止了NO的抗增生作用，加剧胶原的积聚[3]。本实验DM大鼠肾脏AGE于2周病程变化不显著，胶原含量则低于对照组，而8、16周AGE、胶原含量均明显升高，考虑2周时肾脏NOS活性增高、NO产生增多使胶原合成受到抑制，且此时肾脏AGE形成尚不足以与胶原形成广泛共价交联而使其积聚增多。然而，随着病程延长，AGE大量形成，一方面与临近的基质蛋白形成广泛共价交联，增加了胶原稳定性，刺激胶原形成和细胞增生[7]；另一方面又可通过与NO直接反应而使其失活，从而抑止了NO的抗增生作用，加剧了DN的发展。至于NO与AGE相互作用的机制，可能是NO直接与糖基化化学的共同结构未饱和吡咯基反应而使NO作用终止有关[3]。
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参考文献
1，Trachtman H,Futterweit S，Singhal PC.Nitric oxide modulates the synthesis of extracellular matrix protein in cultured rat mesangial cells.Biochem Biophys Res Commun,1995,270:120.
2，Studer RK,Graven PA,Derubertis FR.Thromboxane stimulation of mesangial cell fibronectin synthesis is signaled by activation of protein kinase C and is modulated by cGMP.J Am Soc Nephrol,1993,4:458.
3，Hogan M,Cerami A,Bucala R.Advanced glycosylation endproduts block the antiproliferative effect of nitric oxide:role in the vascular and renal complications of diabetes mellitus.J Clin Invest,1992,90:1110.
, 百拇医药
4，Monnier VM,Vishwanath V,Frank KE,et al.Relation between complications of type I diabetes mellitus and collagen-linked fluorescence.N Engl J Med,1986,314:403.
5，Washer TC,Graier WF,Bahadori B,et al.Time course of endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circulation,1994,90:1109.
6，Trachtman H,Futterweit S,Garg P,et al.Nitric oxide stimulates the activity of a 72-kDa neutral matrix metalloproteinase in cultured rat mesangial cells.Biochem Biophys Res Commun,1996，218:704.
7，钱荣立.蛋白非酶糖化与糖尿病血管合并症,中华内分泌代谢杂志,1993,9:109.
(收稿：2000-02-12 修回：2000-07-03)
, 百拇医药
关键词：
摘要：
中国糖尿病杂志000524 肾小球硬化为糖尿病肾病(DN)的病理改变，其基本病变为肾小球基底膜增厚和系膜基质的增生。糖尿病(DM)肾组织胶原蛋白非酶糖化是DM肾小球硬化重要的原因之一[1,2]。有研究表明一氧化氮(NO)具有抑制肾小球系膜细胞外基质积聚的作用，而蛋白非酶糖化致糖基化终产物(AGE)的大量形成则阻碍了NO的抗细胞增殖作用[3]。本实验通过观察链脲佐菌素(STZ) 诱导的DM大鼠在不同病程肾组织NO含量和一氧化氮合酶(NOS)活性、AGE、胶原含量及肾组织形态学变化，探讨DN发病的相关机制。
, 百拇医药
材料和方法
1.材料：选择体重150～200g的雄性SD大鼠60只，随机分为DM组和正常对照组(NC)。DM 组一次性腹腔注射STZ 65mg/kg(美国Sigma公司生产, 用0.1mol/L pH4.5的柠檬酸缓冲液配成2%的溶液)，3天后测血糖，选择血糖≥16.7mmol/L者为DM大鼠。对照组注射相同体积柠檬酸缓冲液。于DM形成后2、8、16周，两组各取相同例数动物，麻醉后采静脉血备测血糖，然后取双肾，右肾于液氮中速冻保存，备测肾组织NO含量和NOS活性、AGE和胶原含量；左肾一半置于Carnoy液中，另一半置于2.5%戊二醛中浸泡固定，做组织学检查。
2.实验室方法：
(1)血糖测定用葡萄糖氧化酶法。
(2)肾组织NO含量和 NOS活性：前者用Griess重氮化反应法测定，后者用分光光度法测定，药盒均由北京军事医学科学研究所提供。
, 百拇医药
(3)肾组织AGE、胶原含量测定：用Monnier方法[4]制备胶原提取液，提取液中羟脯氨酸含量用氯胺 T法测得，再乘以因子7.14即为胶原含量；用荧光分光光度计在370/440 nm处测定消化液的荧光强度，AGE含量以每毫克羟脯氨酸所含荧光强度为一个任意单位(AU)。
(4)肾组织形态学分析：将在Carnoy液中固定后的肾组织石蜡包埋、切片后HE及PAS染色，光镜下观察肾小球病理形态学改变。另取在戊二醛缓冲液中固定的肾组织再切成小组织块，2%锇酸固定、环氧树脂包埋后超薄切片，铅铀双重染色，H-600型电镜下观察。
3.统计学分析：各项指标以均数±标准差(
±s)表示，组间比较用t检验或方差分析。结 果
, 百拇医药
1.各病程DM大鼠血糖均显著高于NC组(P<0.01)，DM大鼠于2周病程时肾脏NO水平、NOS活性均明显高于NC组(P<0.01)，8、16周病程时则低于同批NC组(P<0.01) (表1)。
2.2周病程时DM大鼠肾组织AGE与对照组无显著性差异，胶原含量则低于NC组(P<0.05)，8、16周病程时DM大鼠上述指标均显著高于同批NC组(P<0.01)(表2)。
表1 各组大鼠肾组织血糖、NO含量及
NOS活性变化(
±s) 组别例
数
病程
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(周)
FBS
(mmol/L)
NO
(μmol/L)
NOS
(nmol/g.min)
DM组
8
2
20.56±6.24*
6.38±0.48*
, 百拇医药
1.190±0.190
NC组
8
4.27±0.48〓
4.99±0.23
0.826±0.172
DM组
7
8
21.06±0.48*
3.71±0.31*
, 百拇医药
0.639±0.090*
NC组
7
6.11±0.92〓
5.03±0.23
0.833±0.147
DM组
7
16
17.19±2.90*
3.17±0.25*
, 百拇医药
0.486±0.098*
NC组
7
4.30±0.77〓
5.07±0.21
0.805±0.175
与同批对照组比较*P<0.01表2 各组大鼠肾组织AGE、胶原
含量变化(
±s) 组别例数
病程
, 百拇医药
(周)
AGE
(AU/mg)
胶原含量
(μg/ml)
DM组
8
2
9.99±1.60
42.52±8.13*
NC组
8
10.85±1.50
, 百拇医药
51.48±4.34
DM组
7
8
19.99±3.50**
60.67±6.04**
NC组
7
13.66±1.80
50.13±4.13
DM组
7
, 百拇医药
16
28.27±3.79**
72.24±10.98**
NC组
7
14.64±2.57
56.56±5.84
与对照组比较*P<0.05,**P<0.01
3.肾组织形态学分析：光镜下显示8、16周DM大鼠存在肾小球系膜区增宽、肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚、系膜及基膜PAS阳性物质增多等变化，2周DM组上述变化不明显。电镜下显示DM大鼠于2周病程时足突融合不明显，基底膜变薄；8周时肾小球足突部分融合，系膜细胞轻度增生，基底膜稍增厚，16周时足突融合，系膜基质增生，基底膜明显增厚。 讨 论
, http://www.100md.com
NO是一种重要的生物调节剂，其合成的关键酶NOS广泛分布于肾组织细胞中。研究发现糖尿病NO表现为由早期的升高到晚期的下降过程[5]。本实验DM大鼠肾组织NO含量及NOS活性在2周时高于对照组，8、16周时则低于对照组，且呈不断下降趋势，与文献报道一致。NO的这种动态变化对DN的发生发展具有重要意义。DN的基本病理改变是肾小球基底膜增厚和系膜基质增生。研究表明，NO具有抗细胞增生作用，其可使细胞外基质合成减少、分解增加而抑止肾小球基质中胶原纤维的积聚[2，6]。本实验DM大鼠于8、16周病程时可见肾小球系膜增生、基底膜增厚、足突融合，并随病程进展而加剧，而2周时上述变化不明显，且基底膜还变薄。病程初期的这种改变可能与此时NO水平增高对肾小球基质胶原聚积的抑制有关；随着病程延长，NO水平下降，NO抗细胞增生作用削弱，则可加剧DM肾小球硬化的病理改变。
病程后期NO下降的机制可能与多种因素有关，而AGE增多对NO的抑制作用是DM后期NO下降的重要原因之一。已知非酶糖化致AGE的形成参与了DN的发病机制，AGE可与肾小球基膜和系膜基质中的胶原蛋白呈不可逆联结，使胶原增多，基底膜增厚[7]；还可通过与NO相作用而使其失活，从而抑止了NO的抗增生作用，加剧胶原的积聚[3]。本实验DM大鼠肾脏AGE于2周病程变化不显著，胶原含量则低于对照组，而8、16周AGE、胶原含量均明显升高，考虑2周时肾脏NOS活性增高、NO产生增多使胶原合成受到抑制，且此时肾脏AGE形成尚不足以与胶原形成广泛共价交联而使其积聚增多。然而，随着病程延长，AGE大量形成，一方面与临近的基质蛋白形成广泛共价交联，增加了胶原稳定性，刺激胶原形成和细胞增生[7]；另一方面又可通过与NO直接反应而使其失活，从而抑止了NO的抗增生作用，加剧了DN的发展。至于NO与AGE相互作用的机制，可能是NO直接与糖基化化学的共同结构未饱和吡咯基反应而使NO作用终止有关[3]。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Trachtman H,Futterweit S，Singhal PC.Nitric oxide modulates the synthesis of extracellular matrix protein in cultured rat mesangial cells.Biochem Biophys Res Commun,1995,270:120.
2，Studer RK,Graven PA,Derubertis FR.Thromboxane stimulation of mesangial cell fibronectin synthesis is signaled by activation of protein kinase C and is modulated by cGMP.J Am Soc Nephrol,1993,4:458.
3，Hogan M,Cerami A,Bucala R.Advanced glycosylation endproduts block the antiproliferative effect of nitric oxide:role in the vascular and renal complications of diabetes mellitus.J Clin Invest,1992,90:1110.
, 百拇医药
4，Monnier VM,Vishwanath V,Frank KE,et al.Relation between complications of type I diabetes mellitus and collagen-linked fluorescence.N Engl J Med,1986,314:403.
5，Washer TC,Graier WF,Bahadori B,et al.Time course of endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circulation,1994,90:1109.
6，Trachtman H,Futterweit S,Garg P,et al.Nitric oxide stimulates the activity of a 72-kDa neutral matrix metalloproteinase in cultured rat mesangial cells.Biochem Biophys Res Commun,1996，218:704.
7，钱荣立.蛋白非酶糖化与糖尿病血管合并症,中华内分泌代谢杂志,1993,9:109.
(收稿：2000-02-12 修回：2000-07-03)
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