类风湿关节炎滑膜转化生长因子β1表达及与病理改变的关系
作者：戴冽 叶志强 汤美安 尹培达
单位：戴冽(广州，中山医科大学附属第三医院内科 510630)；汤美安(广州，中山医科大学附属第三医院内科 510630)；叶志强(广州，中山医科大学附属第三医院骨科 510630)；尹培达(中山医科大学附属第一医院肾内科)
关键词：关节炎，类风湿；转化生长因子β；滑膜炎
中华风湿病学杂志000609 【摘 要】 目的 了解转化生长因子β1(TGFβ1)在类风湿关节炎(RA)滑膜组织中的表达及与病理改变的关系，以探讨TGFβ1在RA发病中的作用。方法 采用免疫组织化学LSAB法检测了53例(其中26例RA，20例其他关节炎和7例正常人)滑膜组织中TGFβ1蛋白的表达情况，并用目镜网格测微尺和图像分析系统分别进行TGFβ1阳性细胞的半定量计数和TGFβ1染色强度及面积的定量分析。结果 RA滑膜衬里层TGFβ1阳性细胞数及阳性染色强度、衬里下层染色强度及阳性面积均较正常组和其他关节炎组明显增强(P<0.05)；RA滑膜衬里层细胞层数、衬里下层炎症细胞的浸润均较对照组明显增多；活动期RA滑膜衬里层和衬里下层TGFβ1染色均较静止期明显增强，并且活动期滑膜炎中，慢性活动期、肉芽组织增生期较新近活动期衬里下层染色强度及阳性面积明显升高(P<0.05)。结论 RA滑膜TGFβ1蛋白合成、分泌增多，并且增多的TGFβ1可能与RA滑膜病变活动有关，包括与衬里层滑膜细胞增生、炎症细胞浸润、衬里下层血管增生及肉芽组织形成有关。
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Expression of TGFβ1 in rheumatoid synovia and its relationship with synovial pathological changes
DAI Lie YE Zhiqiang TANG Meian
(Department of Internal Medicine,Third Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510630,China)
【Abstract】 Objective To know the expression of TGFβ1 in rheumatoid synovia and its relationship with synovial pathological changes for exploring the role of TGFβ1 in pathogenesis of RA.Methods TGFβ1 protein in 53 cases of RA synovia [including 26 cases of RA,20 cases of control non-RA (14 cases of OA and 6 cases of traumatic arthritis) and 7 cases of normal synovia] was detected by immunohistochemical LSAB method.The relationship between expression of TGFβ1 and pathological changes in RA synovia was further analysed.Results ① TGFβ1-positive lining cells and mean greym in intima, mean greym and positive area in sublining area were significantly enhanced in RA synovia than those in control non-RA synovia (P<0.05);② Lining layer and infiltrated inflammatory cells in sublining area were more in RA synovia than those in controls;③ TGFβ1 staining was stronger in active RA synovia especially in chronic active stage and granuloma stage,which showed significantly increased mean greym and positive area in sublining area than that in freshly active stage(P<0.05).Conclusion The results showed enhanced expression of TGFβ1 protein in RA synovia and it may be related with active pathological changes in RA synovia including synoviocyte hyperplasia, inflammatory cell infiltration,sublining angiogenesis and granuloma formation.
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【Key words】 Arthritis,rheumatoid; Transforming growth factor beta; Synovitis
转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGFβ1)是一种重要的调节细胞生长及分化的多肽因子，具有调控血管内皮细胞生长、炎症细胞趋化、成纤维细胞增生以及细胞外基质的合成与降解等作用。类风湿关节炎(RA)的基本病理改变为滑膜炎，表现为滑膜细胞增生、炎症细胞浸润、血管增生以及纤维化改变等。为了探讨RA滑膜上述病变与TGFβ1的关系，我们采用LSAB法检测了26例RA滑膜TGFβ1表达，并与非RA关节炎及正常滑膜对照，结果如下。
1 材料与方法
1.1 滑膜标本来源及处理：所有滑膜标本均取自中山医科大学第三及第一附属医院骨科住院行关节镜手术及关节置换术的患者，其中RA滑膜26例，诊断符合1987年美国风湿病学会(ARA)修订的诊断标准[1]，男8例，女18例，年龄21～72岁，平均年龄(46±13)岁，病程0.5～26年，平均病程(9±7)年，其中临床活动期23例，缓解期3例(X线Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期各1例)；其他关节炎组的骨关节炎(OA)滑膜14例，男6例，女8例，年龄39～75岁，平均年龄(51±14)岁，病程8个月～20年，平均病程(13±8)年，外伤性关节炎滑膜6例；正常滑膜7例，取自半月板损伤患者。
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所有滑膜组织离体后立即用10%甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、连续切片，切片厚度为4 μm，分别作HE染色和TGFβ1免疫组织化学染色。
1.2 免疫组织化学染色方法：采用标记的链霉亲合素生物素(LSAB)法[2]，LSAB试剂盒购于DAKO公司(K0681)。一抗为鼠抗人抗TGFβ1单克隆抗体(TB21，购自中国科学院上海细胞所)，二抗为生物素标记的羊抗鼠抗兔免疫球蛋白。检测工作液浓度为1∶600，1 ℃过夜，DAB显色，苏木素复染。以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定及统计指标：TGFβ1阳性细胞为细胞质内出现棕黄或棕褐色颗粒。结果观察阳性细胞的分布与强度，并采用目镜网格测微尺进行半定量计数，即10×10方格中TGFβ1阳性细胞占该种细胞总数的百分数，计算5个视野阳性细胞百分数的平均值。另外采用图像分析系统(物镜20倍)进行TGFβ1染色强度及面积的定量分析[3]。用平均辉度反映阳性强度，总阳性面积及阳性面积百分率反映阳性分布范围。每一切片分别测量3个随机选择的滑膜衬里层和衬里下层视野的平均辉度和总阳性面积(单位：μm2)，取其平均值。由于不同病变滑膜衬里层细胞层数及厚度不同，因此滑膜衬里层仅统计平均辉度。衬里下层统计相同面积(均为全屏面积43 157.37 μm2)下的平均辉度和总阳性面积，并计算阳性面积百分率(总阳性面积/全屏面积×100)。
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1.4 统计学处理：两组计量资料的均数比较采用t检验，两组等级资料的比较采用非参数检验(Mann-Whitney U检验)，多组计量资料的均数比较采用方差分析，并用Student-Newman-Keuls法进行多个样本均数间的两两比较。若方差不齐，采用t′检验或秩和检验。P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 滑膜TGFβ1蛋白表达
2.1.1 滑膜TGFβ1阳性分布：26例RA滑膜TGFβ1染色均为阳性，阳性主要分布在衬里层细胞和衬里下层浸润的炎症细胞及血管内皮细胞，并且衬里下层细胞外间质处也见阳性染色。衬里层细胞阳性染色在近关节腔侧明显，甚至可见细胞膜染色(见图1)。7例正常滑膜TGFβ1染色阳性主要分布在衬里层，偶见衬里下层血管内皮细胞阳性。其他关节炎组14例OA及6例外伤性关节炎滑膜TGFβ1染色阳性分布与RA类似，但TGFβ1阳性细胞数及染色强度较RA明显减弱(见图2、3)。
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2.1.2 滑膜衬里层TGFβ1阳性细胞数的比较：RA组、其他关节炎组和正常组滑膜衬里层TGFβ1阳性细胞百分数分别为87±9、45±9和24±5。经方差分析，F＝21.7，P<0.01，其中RA组与其他关节炎组、正常组之间差异均有显著性，P<0.05。
2.1.3 滑膜TGFβ1染色强度及面积的比较：见表1。
2.2 RA滑膜组织的病理学改变
23例临床活动期RA滑膜均有不同程度的滑膜乳头样增生，衬里细胞层数明显增多，最多可达10层以上，衬里下层炎症细胞浸润及纤维素样变性坏死，部分伴血管扩张、充血、间质水肿，表面纤维素渗出，部分伴衬里下层血管增生，肉芽组织形成。浸润的炎症细胞大多为淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，少数可见中性粒细胞，可形成淋巴滤泡和浆细胞灶，部分还可见生发中心、多核巨细胞、泡沫细胞。1例X线Ⅳ期的临床缓解期RA滑膜主要表现为衬里下层大量增生的纤维结缔组织，另2例X线Ⅱ、Ⅲ期的临床缓解期滑膜表现为衬里细胞轻度增生至3～4层，衬里下层有少量散在的淋巴细胞浸润。与其他关节炎滑膜相比，临床活动期RA滑膜衬里细胞层数明显增多，衬里下层炎症细胞浸润更明显，P<0.01，见表2。
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表1 滑膜TGF-β1染色强度及面积的比较(
±s) 组别
例数
衬里层平均辉度
衬里下层平均辉度
衬里下层总阳性面积
μm2
衬里下层阳性面积百分率
%
RA组
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26
91±18
98±18
15 028±3 111
35±7
其他关节炎组
20
113±11
128±13
11 598±1 852
27±4
注：P<0.01表2 两组滑膜衬里细胞层数和
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衬里下层炎症细胞浸润程度的比较 组别
例数
衬里细胞
层数
衬里下层炎症
细胞浸润程度
临床活动期RA组
23
24.37
20.65
其他关节炎组
20
9.36
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13.20
注：衬里层细胞层数评分为：①1～2层；②3～4层；③5～7层；④≥8层。衬里下层炎症细胞浸润程度分为：①少量散在；②中等量；③弥漫浸润；④弥漫浸润伴淋巴滤泡形成。表内数值为平均秩(Mean Rank) 根据滑膜衬里下层的结构特点，参照Taketazu等[4]和Klimiuk等[5]的分类方法，将RA滑膜从病理上分为滑膜炎活动期和静止期，活动性滑膜炎期又分为新近活动期(freshly active stage)、慢性活动期(chronic active stage)和肉芽组织增生期(granuloma stage)。滑膜炎静止期又分为慢性纤维化期(chronic fibrotic stage)和慢性缓解期(chronic regressive stage)。各期滑膜病理特征为：新近活动期：衬里下层轻～中度炎症细胞浸润，血管扩张充血，可伴纤维素渗出或纤维素样坏死；慢性活动期：衬里下层明显的炎症细胞浸润，伴血管增生，形成肉芽组织，可伴纤维素样变性或坏死；肉芽组织增生期：衬里下层炎症细胞明显减少，主要是增生的肉芽组织；慢性缓解期：衬里下层少量炎症细胞浸润；慢性纤维化期：衬里下层大量的纤维细胞和胶原纤维形成，而炎症细胞、血管相对较少。根据上述标准，本组26例RA滑膜分为新近活动期7例、慢性活动期9例、肉芽组织增生期7例、慢性纤维化期1例和慢性缓解期2例，并且临床分期与病理分期基本一致。
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2.3 RA滑膜TGFβ1蛋白表达与病理改变的关系
26例RA滑膜TGFβ1染色结果显示，23例活动性滑膜炎期滑膜衬里层和衬里下层均可见明显的阳性染色(见图4～6)，而3例静止期滑膜衬里层和衬里下层TGFβ1染色较活动期明显减弱，尤其是慢性纤维化期滑膜衬里下层TGFβ1染色几乎阴性。23例活动性滑膜炎期滑膜衬里层和衬里下层TGFβ1染色比较见表3。
3 讨 论
本文结果显示RA滑膜衬里层TGFβ1阳性细胞数及染色强度、衬里下层染色强度及阳性面积均较正常及其他关节炎滑膜明显增强，提示RA滑膜衬里层和衬里下层TGFβ1蛋白表达增多，这与国内外文献[6，7]报道结果基本一致。RA滑膜衬里层滑膜细胞胞质内出现阳性染色，并且染色强度以近关节腔侧明显，甚至可见细胞膜染色，提示RA滑膜细胞可在细胞质内合成TGFβ1，并可通过胞膜分泌至关节腔中。
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表2结果显示RA滑膜衬里细胞层数较对照组明显增多，这些增多的滑膜衬里细胞可能与RA滑膜表达增强的TGFβ1有关。RA时增生的滑膜衬里细胞来源于血液中的单核细胞的转移(A型滑膜细胞)以及B型成纤维样滑膜细胞的原位增生[8]。TGFβ1是已知的单核细胞趋化因子中作用最强的一种。它可能通过促进单核细胞表达黏附分子(integrin)以及产生基质降解酶而对单核细胞起较强的趋化、激活作用。因此RA时关节局部表达增多的TGFβ1可能通过趋化作用使血液中的单核细胞向关节滑膜转移、聚集，并转化为A型滑膜细胞导致滑膜衬里细胞增多。另外，体外实验结果[9]显示TGFβ1能促进体外培养的RA滑膜成纤维细胞的增生，并且还可以通过在转录水平上抑制Fas抗原表达、促进bc1-2表达来抑制Fas介导的RA滑膜成纤维细胞的凋亡。提示RA滑膜表达增多的TGFβ1还可能通过促进B型滑膜细胞增生及抑制其凋亡导致滑膜细胞的持续性增生。也就是说，RA时滑膜表达增多的TGFβ1可能通过不同的机制分别引起A型和B型滑膜细胞的增多从而导致滑膜衬里层增厚。RA滑膜衬里细胞TGFβ1Ⅱ型受体[4]以及受体endoglin[6]的表达增高，提示RA衬里层滑膜细胞合成与分泌增多的TGFβ1可通过自分泌的方式与细胞表面受体结合而上调衬里层滑膜细胞的增生。而增生的滑膜细胞通过分泌多种细胞因子、炎症介质(如PGE2)以及基质金属蛋白酶(MMP)等在RA滑膜炎及关节破坏中起作用。
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表3 活动期RA滑膜TGF-β1染色强度及面积的比较(±s) 分期
例数
衬里层平均辉度
衬里下层平均辉度
衬里下层总阳性面积
μm2
衬里下层阳性面积***
%
新近活动期
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7
98±23
119±14
11 880±2 014
28±5
慢性活动期
9
92±17
97±6
15 772±2 585
37±6
肉芽组织增生期
7
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84±11
80±7
17 220±2 130
40±5
注：F＝1.08，P>0.05；**方差不齐，采用秩和检验，P<0.01；***F＝10.3，P<0.01，其中新近活动期与慢性活动期、肉芽组织增生期之间差异具有显著性，P<0.05
表2结果还显示RA滑膜衬里下层浸润的炎症细胞也较其他关节炎组明显增多，这些浸润的炎症细胞可能也与RA滑膜表达增多的TGFβ1的趋化作用有关。正常大鼠关节腔内注射TGFβ1后很快出现滑膜单核/巨噬细胞浸润，并引起滑膜炎；而给链球菌细胞壁节段(SCW)所致的关节炎大鼠关节腔内注射抗TGFβ1抗体则可明显减轻关节肿胀、单核/巨噬细胞浸润、血管翳形成、骨质侵蚀及软骨破坏[10]。提示RA时滑膜局部表达增强的TGFβ1对单核细胞的趋化作用不仅引起A型滑膜细胞的增多，而且还可引起衬里下层单核/巨噬细胞的浸润与激活，从而导致滑膜炎症反应。
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本文结果还显示不同病理分期的RA滑膜TGFβ1表达也有区别。活动性滑膜炎期滑膜衬里层和衬里下层TGFβ1染色均较静止期明显增强，提示TGFβ1表达可能与滑膜炎活动有关。活动性滑膜炎中，衬里层TGFβ1染色强度差异不明显，衬里下层染色强度及阳性面积则有明显差异，并且慢性活动期、肉芽组织增生期较新近活动期明显升高(P<0.05)(表3)，即慢性活动期、肉芽组织增生期RA滑膜衬里下层TGFβ1表达明显增强，提示RA滑膜TGFβ1表达增多可能与衬里下层血管及肉芽组织增生之间有一定的关系。体外实验表明TGFβ1可促进血管形成。给新生鼠皮下注射TGFβ1可导致滑膜血管翳形成。因此RA滑膜大量表达的TGFβ1可能通过促进血管增生、炎症细胞的浸润以及肉芽组织形成在RA关节破坏中起一定的作用。临床上也发现这些慢性活动期、肉芽组织增生期RA患者病情尽管活动度低，但持续缓慢进展，最终往往出现明显的关节破坏，因此预后较差。
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Mussener等[11]曾动态观察CIA大鼠滑膜组织TGFβ1及受体的表达情况，发现病程进展，TGFβ1及受体表达增加，呈现一个动态过程。本研究结果也显示不同分期的RA滑膜TGFβ1表达不同，并且TGFβ1的表达水平可能与不同的临床及病理转归有关。活动期RA滑膜TGFβ1表达增高，并随血管及肉芽组织的增生表达增强，缓解期滑膜TGFβ1表达下降，尤其是慢性纤维化期TGFβ1表达明显下降。滑膜TGFβ1表达的检测可能对RA关节病变的预后判断有一定的帮助。由于本组RA滑膜大多数取自临床上关节症状比较明显或病情持续活动，需行关节镜下滑膜切除术治疗的患者，因此滑膜病变多以活动期为主，而滑膜炎静止期、尤其是慢性纤维化期的患者例数较少。有关滑膜TGFβ1表达与RA滑膜病变性质及转归的关系尚有待进一步的研究。
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图1 RA滑膜衬里层TGFβ1免疫组织化学染色LSAB×100
图2 正常滑膜组织TGFβ1免疫组绢化学染色LSAB×100
图3 OA滑膜TGFβ1免疫学染以LSAB×100
图4 新近活动期TGFβ1免疫组织化学染色LSAB×100
图5 慢性活动期RA滑膜TGFβ1免疫组织化学染色LSAB×100
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图6 肉芽组织增生期RA滑膜TGFβ1免疫组织化学染色LSAB×100
参 考 文 献
1，Arnett FC,Edworthy SM,Bloch DA,et al.The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,1988,31:315-324.
2，梁英杰，凌启波.一种快速高敏感的免疫组织化学染色法LSAB法.中华病理学杂志，1993，22：369.
3，申洪.免疫组织化学染色定量方法研究.中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4：89-91.
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4，Taketazu F,Kato M,Gobl A,et al.Enhanced expression of transforming growth factor-β1 and transforming growth factor-β type Ⅱ receptor in the synovial tissues of patients with rheumatoid arthritis.Lab Invest,1994,70:620-630.
5，Klimiuk PA,Goronzy JJ,Bjornsson J,et al.Tissue cytokine patterns distinguish variants of rheumatoid synovitis.Am J Pathol,997,151:1311-1319.
6，Szekaneez Z,Haines GK,Harlow LA,et al.Increased synovial expression of transforming growth factor (TGF)-receptor endoglin and TGFβ1 in rheumatoid arthritis:possible interactions in the pathogenesis of the disease.Clin Immunol Immunopath,1995,76:187-194.
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7，郑毅，任建，施海燕，等.类风湿关节炎中转化生长因子β1和细胞间粘附分子的变化.中华风湿病学杂志，1998，1：21-24.
8，Firesten GS.Invasive fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,1996,39:1978-1790.
9，Kawakami A,Eguchi K,Matsuoka N,et al.Inhibition of Fas antigen-mediated apoptosis of rheumatoid synovial cells in vitro by transforming growth factor β1.Arthritis Rheum,1996,39:1267-1276.
10，Wahl SM,Allen JB,Costa GL,et al.Reversal of acute and chronic synovial inflammation by anti-transforming growth factor β.J Exp Med,1993,177:225-230.
11，Mussener A,Funa K,Kleinan S.Dynamic expression of TGFβ1 and the type Ⅰ and Ⅱ receptors in the synovial tissue of arthritis rats.Clin Exp Immunol,1997,107:112-119.
收稿日期：2000-01-18, http://www.100md.com
单位：戴冽(广州，中山医科大学附属第三医院内科 510630)；汤美安(广州，中山医科大学附属第三医院内科 510630)；叶志强(广州，中山医科大学附属第三医院骨科 510630)；尹培达(中山医科大学附属第一医院肾内科)
关键词：关节炎，类风湿；转化生长因子β；滑膜炎
中华风湿病学杂志000609 【摘 要】 目的 了解转化生长因子β1(TGFβ1)在类风湿关节炎(RA)滑膜组织中的表达及与病理改变的关系，以探讨TGFβ1在RA发病中的作用。方法 采用免疫组织化学LSAB法检测了53例(其中26例RA，20例其他关节炎和7例正常人)滑膜组织中TGFβ1蛋白的表达情况，并用目镜网格测微尺和图像分析系统分别进行TGFβ1阳性细胞的半定量计数和TGFβ1染色强度及面积的定量分析。结果 RA滑膜衬里层TGFβ1阳性细胞数及阳性染色强度、衬里下层染色强度及阳性面积均较正常组和其他关节炎组明显增强(P<0.05)；RA滑膜衬里层细胞层数、衬里下层炎症细胞的浸润均较对照组明显增多；活动期RA滑膜衬里层和衬里下层TGFβ1染色均较静止期明显增强，并且活动期滑膜炎中，慢性活动期、肉芽组织增生期较新近活动期衬里下层染色强度及阳性面积明显升高(P<0.05)。结论 RA滑膜TGFβ1蛋白合成、分泌增多，并且增多的TGFβ1可能与RA滑膜病变活动有关，包括与衬里层滑膜细胞增生、炎症细胞浸润、衬里下层血管增生及肉芽组织形成有关。
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【Abstract】 Objective To know the expression of TGFβ1 in rheumatoid synovia and its relationship with synovial pathological changes for exploring the role of TGFβ1 in pathogenesis of RA.Methods TGFβ1 protein in 53 cases of RA synovia [including 26 cases of RA,20 cases of control non-RA (14 cases of OA and 6 cases of traumatic arthritis) and 7 cases of normal synovia] was detected by immunohistochemical LSAB method.The relationship between expression of TGFβ1 and pathological changes in RA synovia was further analysed.Results ① TGFβ1-positive lining cells and mean greym in intima, mean greym and positive area in sublining area were significantly enhanced in RA synovia than those in control non-RA synovia (P<0.05);② Lining layer and infiltrated inflammatory cells in sublining area were more in RA synovia than those in controls;③ TGFβ1 staining was stronger in active RA synovia especially in chronic active stage and granuloma stage,which showed significantly increased mean greym and positive area in sublining area than that in freshly active stage(P<0.05).Conclusion The results showed enhanced expression of TGFβ1 protein in RA synovia and it may be related with active pathological changes in RA synovia including synoviocyte hyperplasia, inflammatory cell infiltration,sublining angiogenesis and granuloma formation.
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【Key words】 Arthritis,rheumatoid; Transforming growth factor beta; Synovitis
转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGFβ1)是一种重要的调节细胞生长及分化的多肽因子，具有调控血管内皮细胞生长、炎症细胞趋化、成纤维细胞增生以及细胞外基质的合成与降解等作用。类风湿关节炎(RA)的基本病理改变为滑膜炎，表现为滑膜细胞增生、炎症细胞浸润、血管增生以及纤维化改变等。为了探讨RA滑膜上述病变与TGFβ1的关系，我们采用LSAB法检测了26例RA滑膜TGFβ1表达，并与非RA关节炎及正常滑膜对照，结果如下。
1 材料与方法
1.1 滑膜标本来源及处理：所有滑膜标本均取自中山医科大学第三及第一附属医院骨科住院行关节镜手术及关节置换术的患者，其中RA滑膜26例，诊断符合1987年美国风湿病学会(ARA)修订的诊断标准[1]，男8例，女18例，年龄21～72岁，平均年龄(46±13)岁，病程0.5～26年，平均病程(9±7)年，其中临床活动期23例，缓解期3例(X线Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期各1例)；其他关节炎组的骨关节炎(OA)滑膜14例，男6例，女8例，年龄39～75岁，平均年龄(51±14)岁，病程8个月～20年，平均病程(13±8)年，外伤性关节炎滑膜6例；正常滑膜7例，取自半月板损伤患者。
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所有滑膜组织离体后立即用10%甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、连续切片，切片厚度为4 μm，分别作HE染色和TGFβ1免疫组织化学染色。
1.2 免疫组织化学染色方法：采用标记的链霉亲合素生物素(LSAB)法[2]，LSAB试剂盒购于DAKO公司(K0681)。一抗为鼠抗人抗TGFβ1单克隆抗体(TB21，购自中国科学院上海细胞所)，二抗为生物素标记的羊抗鼠抗兔免疫球蛋白。检测工作液浓度为1∶600，1 ℃过夜，DAB显色，苏木素复染。以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定及统计指标：TGFβ1阳性细胞为细胞质内出现棕黄或棕褐色颗粒。结果观察阳性细胞的分布与强度，并采用目镜网格测微尺进行半定量计数，即10×10方格中TGFβ1阳性细胞占该种细胞总数的百分数，计算5个视野阳性细胞百分数的平均值。另外采用图像分析系统(物镜20倍)进行TGFβ1染色强度及面积的定量分析[3]。用平均辉度反映阳性强度，总阳性面积及阳性面积百分率反映阳性分布范围。每一切片分别测量3个随机选择的滑膜衬里层和衬里下层视野的平均辉度和总阳性面积(单位：μm2)，取其平均值。由于不同病变滑膜衬里层细胞层数及厚度不同，因此滑膜衬里层仅统计平均辉度。衬里下层统计相同面积(均为全屏面积43 157.37 μm2)下的平均辉度和总阳性面积，并计算阳性面积百分率(总阳性面积/全屏面积×100)。
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1.4 统计学处理：两组计量资料的均数比较采用t检验，两组等级资料的比较采用非参数检验(Mann-Whitney U检验)，多组计量资料的均数比较采用方差分析，并用Student-Newman-Keuls法进行多个样本均数间的两两比较。若方差不齐，采用t′检验或秩和检验。P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 滑膜TGFβ1蛋白表达
2.1.1 滑膜TGFβ1阳性分布：26例RA滑膜TGFβ1染色均为阳性，阳性主要分布在衬里层细胞和衬里下层浸润的炎症细胞及血管内皮细胞，并且衬里下层细胞外间质处也见阳性染色。衬里层细胞阳性染色在近关节腔侧明显，甚至可见细胞膜染色(见图1)。7例正常滑膜TGFβ1染色阳性主要分布在衬里层，偶见衬里下层血管内皮细胞阳性。其他关节炎组14例OA及6例外伤性关节炎滑膜TGFβ1染色阳性分布与RA类似，但TGFβ1阳性细胞数及染色强度较RA明显减弱(见图2、3)。
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2.1.2 滑膜衬里层TGFβ1阳性细胞数的比较：RA组、其他关节炎组和正常组滑膜衬里层TGFβ1阳性细胞百分数分别为87±9、45±9和24±5。经方差分析，F＝21.7，P<0.01，其中RA组与其他关节炎组、正常组之间差异均有显著性，P<0.05。
2.1.3 滑膜TGFβ1染色强度及面积的比较：见表1。
2.2 RA滑膜组织的病理学改变
23例临床活动期RA滑膜均有不同程度的滑膜乳头样增生，衬里细胞层数明显增多，最多可达10层以上，衬里下层炎症细胞浸润及纤维素样变性坏死，部分伴血管扩张、充血、间质水肿，表面纤维素渗出，部分伴衬里下层血管增生，肉芽组织形成。浸润的炎症细胞大多为淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，少数可见中性粒细胞，可形成淋巴滤泡和浆细胞灶，部分还可见生发中心、多核巨细胞、泡沫细胞。1例X线Ⅳ期的临床缓解期RA滑膜主要表现为衬里下层大量增生的纤维结缔组织，另2例X线Ⅱ、Ⅲ期的临床缓解期滑膜表现为衬里细胞轻度增生至3～4层，衬里下层有少量散在的淋巴细胞浸润。与其他关节炎滑膜相比，临床活动期RA滑膜衬里细胞层数明显增多，衬里下层炎症细胞浸润更明显，P<0.01，见表2。
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表1 滑膜TGF-β1染色强度及面积的比较(
±s) 组别例数
衬里层平均辉度
衬里下层平均辉度
衬里下层总阳性面积
μm2
衬里下层阳性面积百分率
%
RA组
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26
91±18
98±18
15 028±3 111
35±7
其他关节炎组
20
113±11
128±13
11 598±1 852
27±4
注：P<0.01表2 两组滑膜衬里细胞层数和
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衬里下层炎症细胞浸润程度的比较 组别
例数
衬里细胞
层数
衬里下层炎症
细胞浸润程度
临床活动期RA组
23
24.37
20.65
其他关节炎组
20
9.36
, 百拇医药
13.20
注：衬里层细胞层数评分为：①1～2层；②3～4层；③5～7层；④≥8层。衬里下层炎症细胞浸润程度分为：①少量散在；②中等量；③弥漫浸润；④弥漫浸润伴淋巴滤泡形成。表内数值为平均秩(Mean Rank) 根据滑膜衬里下层的结构特点，参照Taketazu等[4]和Klimiuk等[5]的分类方法，将RA滑膜从病理上分为滑膜炎活动期和静止期，活动性滑膜炎期又分为新近活动期(freshly active stage)、慢性活动期(chronic active stage)和肉芽组织增生期(granuloma stage)。滑膜炎静止期又分为慢性纤维化期(chronic fibrotic stage)和慢性缓解期(chronic regressive stage)。各期滑膜病理特征为：新近活动期：衬里下层轻～中度炎症细胞浸润，血管扩张充血，可伴纤维素渗出或纤维素样坏死；慢性活动期：衬里下层明显的炎症细胞浸润，伴血管增生，形成肉芽组织，可伴纤维素样变性或坏死；肉芽组织增生期：衬里下层炎症细胞明显减少，主要是增生的肉芽组织；慢性缓解期：衬里下层少量炎症细胞浸润；慢性纤维化期：衬里下层大量的纤维细胞和胶原纤维形成，而炎症细胞、血管相对较少。根据上述标准，本组26例RA滑膜分为新近活动期7例、慢性活动期9例、肉芽组织增生期7例、慢性纤维化期1例和慢性缓解期2例，并且临床分期与病理分期基本一致。
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2.3 RA滑膜TGFβ1蛋白表达与病理改变的关系
26例RA滑膜TGFβ1染色结果显示，23例活动性滑膜炎期滑膜衬里层和衬里下层均可见明显的阳性染色(见图4～6)，而3例静止期滑膜衬里层和衬里下层TGFβ1染色较活动期明显减弱，尤其是慢性纤维化期滑膜衬里下层TGFβ1染色几乎阴性。23例活动性滑膜炎期滑膜衬里层和衬里下层TGFβ1染色比较见表3。
3 讨 论
本文结果显示RA滑膜衬里层TGFβ1阳性细胞数及染色强度、衬里下层染色强度及阳性面积均较正常及其他关节炎滑膜明显增强，提示RA滑膜衬里层和衬里下层TGFβ1蛋白表达增多，这与国内外文献[6，7]报道结果基本一致。RA滑膜衬里层滑膜细胞胞质内出现阳性染色，并且染色强度以近关节腔侧明显，甚至可见细胞膜染色，提示RA滑膜细胞可在细胞质内合成TGFβ1，并可通过胞膜分泌至关节腔中。
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表2结果显示RA滑膜衬里细胞层数较对照组明显增多，这些增多的滑膜衬里细胞可能与RA滑膜表达增强的TGFβ1有关。RA时增生的滑膜衬里细胞来源于血液中的单核细胞的转移(A型滑膜细胞)以及B型成纤维样滑膜细胞的原位增生[8]。TGFβ1是已知的单核细胞趋化因子中作用最强的一种。它可能通过促进单核细胞表达黏附分子(integrin)以及产生基质降解酶而对单核细胞起较强的趋化、激活作用。因此RA时关节局部表达增多的TGFβ1可能通过趋化作用使血液中的单核细胞向关节滑膜转移、聚集，并转化为A型滑膜细胞导致滑膜衬里细胞增多。另外，体外实验结果[9]显示TGFβ1能促进体外培养的RA滑膜成纤维细胞的增生，并且还可以通过在转录水平上抑制Fas抗原表达、促进bc1-2表达来抑制Fas介导的RA滑膜成纤维细胞的凋亡。提示RA滑膜表达增多的TGFβ1还可能通过促进B型滑膜细胞增生及抑制其凋亡导致滑膜细胞的持续性增生。也就是说，RA时滑膜表达增多的TGFβ1可能通过不同的机制分别引起A型和B型滑膜细胞的增多从而导致滑膜衬里层增厚。RA滑膜衬里细胞TGFβ1Ⅱ型受体[4]以及受体endoglin[6]的表达增高，提示RA衬里层滑膜细胞合成与分泌增多的TGFβ1可通过自分泌的方式与细胞表面受体结合而上调衬里层滑膜细胞的增生。而增生的滑膜细胞通过分泌多种细胞因子、炎症介质(如PGE2)以及基质金属蛋白酶(MMP)等在RA滑膜炎及关节破坏中起作用。
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表3 活动期RA滑膜TGF-β1染色强度及面积的比较(
±s) 分期例数
衬里层平均辉度
衬里下层平均辉度
衬里下层总阳性面积
μm2
衬里下层阳性面积***
%
新近活动期
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7
98±23
119±14
11 880±2 014
28±5
慢性活动期
9
92±17
97±6
15 772±2 585
37±6
肉芽组织增生期
7
, 百拇医药
84±11
80±7
17 220±2 130
40±5
注：F＝1.08，P>0.05；**方差不齐，采用秩和检验，P<0.01；***F＝10.3，P<0.01，其中新近活动期与慢性活动期、肉芽组织增生期之间差异具有显著性，P<0.05
表2结果还显示RA滑膜衬里下层浸润的炎症细胞也较其他关节炎组明显增多，这些浸润的炎症细胞可能也与RA滑膜表达增多的TGFβ1的趋化作用有关。正常大鼠关节腔内注射TGFβ1后很快出现滑膜单核/巨噬细胞浸润，并引起滑膜炎；而给链球菌细胞壁节段(SCW)所致的关节炎大鼠关节腔内注射抗TGFβ1抗体则可明显减轻关节肿胀、单核/巨噬细胞浸润、血管翳形成、骨质侵蚀及软骨破坏[10]。提示RA时滑膜局部表达增强的TGFβ1对单核细胞的趋化作用不仅引起A型滑膜细胞的增多，而且还可引起衬里下层单核/巨噬细胞的浸润与激活，从而导致滑膜炎症反应。
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本文结果还显示不同病理分期的RA滑膜TGFβ1表达也有区别。活动性滑膜炎期滑膜衬里层和衬里下层TGFβ1染色均较静止期明显增强，提示TGFβ1表达可能与滑膜炎活动有关。活动性滑膜炎中，衬里层TGFβ1染色强度差异不明显，衬里下层染色强度及阳性面积则有明显差异，并且慢性活动期、肉芽组织增生期较新近活动期明显升高(P<0.05)(表3)，即慢性活动期、肉芽组织增生期RA滑膜衬里下层TGFβ1表达明显增强，提示RA滑膜TGFβ1表达增多可能与衬里下层血管及肉芽组织增生之间有一定的关系。体外实验表明TGFβ1可促进血管形成。给新生鼠皮下注射TGFβ1可导致滑膜血管翳形成。因此RA滑膜大量表达的TGFβ1可能通过促进血管增生、炎症细胞的浸润以及肉芽组织形成在RA关节破坏中起一定的作用。临床上也发现这些慢性活动期、肉芽组织增生期RA患者病情尽管活动度低，但持续缓慢进展，最终往往出现明显的关节破坏，因此预后较差。
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Mussener等[11]曾动态观察CIA大鼠滑膜组织TGFβ1及受体的表达情况，发现病程进展，TGFβ1及受体表达增加，呈现一个动态过程。本研究结果也显示不同分期的RA滑膜TGFβ1表达不同，并且TGFβ1的表达水平可能与不同的临床及病理转归有关。活动期RA滑膜TGFβ1表达增高，并随血管及肉芽组织的增生表达增强，缓解期滑膜TGFβ1表达下降，尤其是慢性纤维化期TGFβ1表达明显下降。滑膜TGFβ1表达的检测可能对RA关节病变的预后判断有一定的帮助。由于本组RA滑膜大多数取自临床上关节症状比较明显或病情持续活动，需行关节镜下滑膜切除术治疗的患者，因此滑膜病变多以活动期为主，而滑膜炎静止期、尤其是慢性纤维化期的患者例数较少。有关滑膜TGFβ1表达与RA滑膜病变性质及转归的关系尚有待进一步的研究。
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图1 RA滑膜衬里层TGFβ1免疫组织化学染色LSAB×100
图2 正常滑膜组织TGFβ1免疫组绢化学染色LSAB×100
图3 OA滑膜TGFβ1免疫学染以LSAB×100
图4 新近活动期TGFβ1免疫组织化学染色LSAB×100
图5 慢性活动期RA滑膜TGFβ1免疫组织化学染色LSAB×100
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图6 肉芽组织增生期RA滑膜TGFβ1免疫组织化学染色LSAB×100
参 考 文 献
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2，梁英杰，凌启波.一种快速高敏感的免疫组织化学染色法LSAB法.中华病理学杂志，1993，22：369.
3，申洪.免疫组织化学染色定量方法研究.中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4：89-91.
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4，Taketazu F,Kato M,Gobl A,et al.Enhanced expression of transforming growth factor-β1 and transforming growth factor-β type Ⅱ receptor in the synovial tissues of patients with rheumatoid arthritis.Lab Invest,1994,70:620-630.
5，Klimiuk PA,Goronzy JJ,Bjornsson J,et al.Tissue cytokine patterns distinguish variants of rheumatoid synovitis.Am J Pathol,997,151:1311-1319.
6，Szekaneez Z,Haines GK,Harlow LA,et al.Increased synovial expression of transforming growth factor (TGF)-receptor endoglin and TGFβ1 in rheumatoid arthritis:possible interactions in the pathogenesis of the disease.Clin Immunol Immunopath,1995,76:187-194.
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7，郑毅，任建，施海燕，等.类风湿关节炎中转化生长因子β1和细胞间粘附分子的变化.中华风湿病学杂志，1998，1：21-24.
8，Firesten GS.Invasive fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,1996,39:1978-1790.
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10，Wahl SM,Allen JB,Costa GL,et al.Reversal of acute and chronic synovial inflammation by anti-transforming growth factor β.J Exp Med,1993,177:225-230.
11，Mussener A,Funa K,Kleinan S.Dynamic expression of TGFβ1 and the type Ⅰ and Ⅱ receptors in the synovial tissue of arthritis rats.Clin Exp Immunol,1997,107:112-119.
收稿日期：2000-01-18, http://www.100md.com