抗中性粒细胞胞浆抗体相关抗原诱导人胎肾内皮细胞凋亡的研究
作者：马宏 王翠玲 刘源
单位：马宏(太原，山西医科大学第一医院儿科 030001)；王翠玲(太原，山西医科大学第一医院儿科 030001)；刘源(太原，山西医科大学第一医院儿科 030001)
关键词：抗中性粒细胞胞浆抗体；肽肽水解酶类；红斑狼疮，系统性；肾小球；细胞凋亡
中华风湿病学杂志000606 【摘 要】 目的 探讨抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关抗原蛋白酶-3(PR-3)对体外培养人胎儿肾小球内皮细胞凋亡的影响及诱导机制。方法 采用ANCA阳性系统性红斑狼疮(SLE)患儿外周血中性粒细胞分离纯化其细胞质中PR-3，并用该蛋白酶诱导培养人胎肾内皮细胞发生凋亡。观察不同剂量PR-3于不同时间点对内皮细胞存活情况及其形态学变化的影响。用碘化丙啶染色DNA以评价凋亡的发生率，观察核染色质固缩及DNA片段的形成。用琼脂糖凝胶电泳确定凋亡小体的形成和凋亡梯形。结果 ANCA阳性SLE患儿中性粒细胞胞浆蛋白酶PR-3以剂量、时间依赖性形式诱导人胎肾内皮细胞发生凋亡[PR-3 10 μg.ml-1.24h-1细胞凋亡率为(75.5±26.5)%]，与阴性对照组[(1.8±1.2)%]比较差异有显著性(P<0.01)。凋亡的内皮细胞与培养基分离、悬浮、呈碘化丙啶强染的大小不等的碎片，核染色体固缩。DNA电泳提示凋亡核小体形成，出现凋亡梯形。结论 中性粒细胞胞浆蛋白酶PR-3可诱导胎肾内皮细胞凋亡，在ANCA相关性血管炎性疾病的发生发展中可能具有重要的病理生理意义。
, 百拇医药
Apoptosis of human fetal glomerular endothelial cell induced by neutrophil proteinase-3 from ANCA positive children with SLE
MA Hong WANG Cuiling LIU Yuan
(Department of Pediatrics,First Hospital,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)
【Abstract】 Objective To investigate whether the neutrophil serine proteinase-3 (PR-3),a specific autoantigen of C-ANCA,could induce human fetal glomerular endothelial cell apoptosis in vitro.Methods PR-3 was isolated from polymorphonuclear leukocytes obtained from C-ANCA-positive children with SLE.The cultured glomerular endothelial cells from human fetal kidneys were treated with PR-3 and apoptosis was assessed by different methods including the propidium iodide staining,DNA fragmentation analysis,and morphology observation.Results Percentage of apoptotic cells significantly increased (P<0.01) with 10 μg/ml PR-3 at hour 24 after treatment.Values at this time point were (75.5±26.5)% for PR-3 group and (1.8±1.2)% for negative control,demonstrating an increase of apoptosis in a dose- and time-dependent manner with the highest values achieved at hour 24.The apoptosis features appeared as nuclei condensation and DNA fragmentation,and typical DNA laddering was apparent in cells treated with PR-3 and in positive control cells treated with TNF-α.Conclusion The results suggest that PR-3 may directly induce glomerular endothelial cell apoptosis in vitro.This pathogenic role of PR-3 may be an important machanism of injury in anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated vasculitic diseases in children.
, 百拇医药
【Key words】 Antineutrophil cytoplasmic antibody; Peptide peptidohydrolases; Lupus erythematosus,systemic; Kidney glomerulus; Apoptosis
抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)已被作为血管炎相关疾病标记抗体用于临床诊断和疗效评价[1，2]。研究证实，在ANCA相关性血管炎病损过程中，被活化的中性粒细胞胞浆蛋白酶可致血管内皮损伤和细胞溶解[1，2]，但有关机制尚不完全清楚。本文探讨ANCA阳性系统性红斑狼疮(SLE)患儿中性粒细胞胞浆蛋白酶-3(PR-3)对体外培养的人胎儿肾小球内皮细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 PR-3的分离制备
采集16例ANCA阳性的SLE患儿外周血，分离多核白细胞，-70 ℃保存。按Ewert等[3]方法从多核白细胞中空化沉淀中性粒细胞胞浆蛋白酶。参照Jia-Jin等[1]方法分离中性粒细胞胞浆蛋白酶-3，用抗PR-3 ELISA法识别。用SDS-PAGE分离纯化PR-3，并用ELISA法使PR-3与小鼠抗人单抗和兔抗人多抗发生反应，并识别酶活性[1]。
, 百拇医药
1.2 人胎儿肾小球内皮细胞分离及培养
5个月引产人胎儿，分离摘取肾脏，剪切肾皮质成小碎块，于250、106 μm不锈钢筛网中轻研肾皮质，于75 μm筛网收集纯净肾小球，离心，用Ⅴ型胶原酶消化离散细胞，用10%FCS及RPMI 1640液终止。将上清液再离心，收集沉淀物并加入内皮细胞培养液[4]，于25 cm2培养瓶中，37 ℃，5% CO2孵育箱中孵育72 h，观察细胞生长情况，于10 d时传代，用第4～5代培养内皮细胞进行实验，每瓶加8 ml基质，2×106细胞量，分别移入48孔细胞培养盘中，每孔细胞密度为2×104、基质0.5 ml，并孵育使细胞融合24 h，用无血清RPMI 1640使细胞同步12 h[1，2，4]。培养内皮细胞随机分组，分别用1、5、10 μg/ml的PR-3处理并与 细胞共同培养6、12、24 h，同时设阳性对照组：用20 ng/ml重组TNF-α(处理6、12、24 h)，阴性对照组用PBS处理。并于各时间点观察各组细胞生存情况，比较各组凋亡的百分率。
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1.3 人胎肾小球内皮细胞凋亡的测定
1.3.1 用琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段：参照文献[1-3]方法，裂解内皮细胞，用酚∶氯仿(1∶1)及氯仿分别抽提DNA溶液，用酒精沉淀，双蒸水溶解，用10 μg/ml DNA酶消化6 h。加样DNA为6 μg/每泳道于1.5%琼脂糖凝胶中，于含1 μg/ml溴化乙啶的TBE缓冲液中，100 V电泳40 min分离DNA片段。紫外线显影DNA片段，用单克隆抗DNA-过氧化酶作偶联液与DNA片段样品液反应，在405 nm处读出光密度值。
1.3.2 用碘化丙啶染色评价肾小球内皮细胞凋亡：收集经PR-3、TNF-α及PBS处理的培养内皮细胞，甲醇固定，用碘化丙啶(50 μg/ml)加入RNase-A(10 mg/ml)，于37 ℃孵育1 h，取样并于荧光镜下观察[1-3]，从细胞形态学上识别凋亡细胞。
1.4 统计学处理
, 百拇医药
采用SDAS，Sigma-plot统计程序检验数据。
2 结 果
2.1 PR-3诱导人胎儿肾小球内皮细胞凋亡率：经PR-3处理的胎儿肾小球内皮细胞经DNA特异性染色，显示有明显的细胞凋亡，凋亡细胞特征为核染色体固缩、核碎裂和核酸片段形成(见图1a)。TNF-α处理组有类似现象，而PBS组凋亡不明显(见图1b)。且PR-3以剂量、时间依赖性形式引起内皮细胞发生凋亡。在剂量达10 μg/ml于24 h后凋亡细胞的百分率为(75.5±5.6)%；TNF-α处理组细胞凋亡率为(54.6±23.3)%；PBS处理组则为(1.8±1.2)%，PR-3处理组与PBS组比较差异具有显著性(P<0.01)(见图2)。
图2a PR-3不同剂量处理6 h内皮细胞凋亡
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呈剂量依赖性
图2b PR-3 (10 μg/ml) 24 h内皮细胞凋亡
呈时间依赖性
2.2 核酸片段凝胶电泳观察凋亡梯形：经琼脂糖凝胶电泳分析提示，PR-3所引起的凋亡细胞其DNA片段约为220 bp的整倍数片段，于电泳条带上呈现出典型的凋亡梯形。TNF-α组有类似特征，而PBS组则无凋亡梯形出现(见图3)。
图3 凋亡内皮细胞DNA电泳呈现凋亡梯形
2.3 PR-3处理组胎肾内皮细胞光镜下细胞形态变化：分别于实验0、6、12、24 h在相差显微镜下对比观察各处理组细胞形态学变化，提示PR-3处理组于实验6 h，即有细胞与培养基分离脱壁、细胞裂解、悬浮而使折光度增强，随酶的剂量增加和时间的延长，这种形态学的变化趋于明显。而PBS组未见类似的变化。
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3 讨 论
在ANCA相关性血管炎中，中性粒细胞可介导血管内皮细胞损伤[1-3]。其一为ANCA可激活中性粒细胞，使其释放细胞质中的蛋白酶造成内皮损伤，另可介导自由基产生而损伤血管内皮[1，5]。再者中性粒细胞胞浆中蛋白酶均具有直接的细胞毒性作用，可诱使多种细胞损伤、坏死或凋亡[1，2，6，7]。在ANCA相关性肾小球肾炎病人，中性粒细胞胞浆蛋白酶-3可直接损伤肾血管内皮细胞而导致严重蛋白尿和进行性肾功能损害[1，3，8]。本文采用ANCA阳性的SLE患儿外周血，分离纯化中性粒细胞胞浆蛋白酶PR-3，对培养人胎肾小球内皮细胞进行处理，发现PR-3对胎肾内皮细胞有直接的细胞毒性作用，可诱导肾小球内皮细胞发生凋亡[1，9]，即：①用PR-3处理的内皮细胞DNA片段明显增加；②PR-3处理组内皮细胞死亡趋势与蛋白酶呈剂量和时间依赖性关系；③DNA特异性染色提示，PR-3处理组内皮细胞所含固缩染色体和碎裂核酸片段显著高于对照组(P<0.01)；④凝胶电泳提示，PR-3处理组出现凋亡梯形带。上述变化与阴性对照组比较差异有显著性(P<0.01)。有关PR-3介导内皮细胞凋亡的机制尚不完全清楚，有学者认为丝氨酸蛋白酶在细胞凋亡过程中具有核酸内切酶的作用，可降解细胞外基质成分，增加细胞的通透性，影响细胞的有丝分裂，激活受体或刺激靶细胞摄取细胞因子，或促使细胞凋亡抑制因子降解，从而引起细胞凋亡的发生[1-3，6-8]。本研究发现，PR-3诱导肾小球内皮细胞一旦发生凋亡，这些凋亡细胞将从培养瓶壁脱落悬浮于培养液中，故观察细胞与瓶壁分离的百分率可间接反映凋亡细胞的百分比。并观察到细胞凋亡与PR-3间呈时间、剂量依赖性关系[1，7]。培养内皮细胞的存活、增生和分裂的必要条件之一是细胞与细胞外基质蛋白黏附[9，10]，否则将影响细胞代谢、DNA转录与合成、激活膜离子通道、发生Ca2+内流增加等，从而启动细胞的程序性死亡过程[9，10]，出现具有凋亡形态学和生化特征的细胞死亡[1，9，10]。PR-3能降解细胞外基质成分，从而可致肾小球与基质分离出现细胞结构和功能损伤[1，7，9]。并提示ANCA阳性结缔组织病急性期肾损害可能与ANCA激活中性粒细胞，使胞浆蛋白酶释放而介导肾小球细胞外基质降解导致基底膜、内皮细胞损伤的机制有关[1，3]。本文提示，ANCA相关特异性靶抗原PR-3诱导培养的胎肾内皮细胞发生凋亡，此类作用在有中性粒细胞被激活的急性炎症、急性血管炎性疾病的发生发展过程中具有重要的病理生理学意义[2，3，5-10]。但有关ANCA阴性者粒细胞PR-3在肾小球内皮损伤中的作用尚待进一步研究。
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图1a PR3诱导人胎肾小球内皮细胞凋亡 碘化丙啶×400
图1b PBS诱志人胎肾小球内皮细胞凋亡 碘化丙啶×400
基金项目：山西省科委基金资助项目(9821)
参 考 文 献
1，Jia-Jin Y,Kettriez R,Falk RJ,et al.Apoptosis of endothelial cells induced by the neutrophil serine proteinase 3 and elastase.Am J Pathol,1996,149:1617-1626.
2，Jennette JC,Wilkman AS,Falk RJ,et al.Antineutrophil ctyoplasmic autoantibody associated glomerulonephritis and vasculitis.Am J Pathol,1989,135:921-930.
, 百拇医药
3，Ewert BH,Jennette JC,Falk RJ,et al.Anti-myeloperoxidase antibodies stimulate neutrophils to damage human endothelial cells.Kidney Int,1992,41:375-383.
4，陈香美，于力方，陈中华，等.肾小球内皮细胞培养及产生细胞外基质的实验研究.中华医学杂志，1995，75：25-27.
5，Kallenberg CGM,Brouwer E,Mulder AHL,et al.ANCA-pathophysiology revisited.Clin Exp Immunol,1995,100:1-3.
6，Smyth MJ,Trapani JA.Exogenous proteinases that induce target cell apoptosis.Immunol Today,1995,16:202-208.
, http://www.100md.com
7，Marthinuss J,Andrade GP,Seiberg M,et al.A secreted serine protease can induce apoptosis in pam 212 keratinocytes.Cell Growth Differ,1995,6:807-816.
8，Westlin WF,Ryan US,Ward PA,et al.Neutrophil mediated damage to human vascular endothelium:role of cytokinr activation.Am J Pathol,1993,142:117-128.
9，Meredith JE,Fazeli BJ,Shwarty MA,et al.The extrocellular matrix as a cell survival factor.Mol Biol Cell,1993,4:953-961.
10，Re F,Zahetti A,Sironi M,et al.Inhibition of anchorage dependent cell spreaging triggers apoptosis in cultured human Ecs.J Cell Biol,1994,127:537-546.
收稿日期：1999-10-28, http://www.100md.com
单位：马宏(太原，山西医科大学第一医院儿科 030001)；王翠玲(太原，山西医科大学第一医院儿科 030001)；刘源(太原，山西医科大学第一医院儿科 030001)
关键词：抗中性粒细胞胞浆抗体；肽肽水解酶类；红斑狼疮，系统性；肾小球；细胞凋亡
中华风湿病学杂志000606 【摘 要】 目的 探讨抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关抗原蛋白酶-3(PR-3)对体外培养人胎儿肾小球内皮细胞凋亡的影响及诱导机制。方法 采用ANCA阳性系统性红斑狼疮(SLE)患儿外周血中性粒细胞分离纯化其细胞质中PR-3，并用该蛋白酶诱导培养人胎肾内皮细胞发生凋亡。观察不同剂量PR-3于不同时间点对内皮细胞存活情况及其形态学变化的影响。用碘化丙啶染色DNA以评价凋亡的发生率，观察核染色质固缩及DNA片段的形成。用琼脂糖凝胶电泳确定凋亡小体的形成和凋亡梯形。结果 ANCA阳性SLE患儿中性粒细胞胞浆蛋白酶PR-3以剂量、时间依赖性形式诱导人胎肾内皮细胞发生凋亡[PR-3 10 μg.ml-1.24h-1细胞凋亡率为(75.5±26.5)%]，与阴性对照组[(1.8±1.2)%]比较差异有显著性(P<0.01)。凋亡的内皮细胞与培养基分离、悬浮、呈碘化丙啶强染的大小不等的碎片，核染色体固缩。DNA电泳提示凋亡核小体形成，出现凋亡梯形。结论 中性粒细胞胞浆蛋白酶PR-3可诱导胎肾内皮细胞凋亡，在ANCA相关性血管炎性疾病的发生发展中可能具有重要的病理生理意义。
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Apoptosis of human fetal glomerular endothelial cell induced by neutrophil proteinase-3 from ANCA positive children with SLE
MA Hong WANG Cuiling LIU Yuan
(Department of Pediatrics,First Hospital,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)
【Abstract】 Objective To investigate whether the neutrophil serine proteinase-3 (PR-3),a specific autoantigen of C-ANCA,could induce human fetal glomerular endothelial cell apoptosis in vitro.Methods PR-3 was isolated from polymorphonuclear leukocytes obtained from C-ANCA-positive children with SLE.The cultured glomerular endothelial cells from human fetal kidneys were treated with PR-3 and apoptosis was assessed by different methods including the propidium iodide staining,DNA fragmentation analysis,and morphology observation.Results Percentage of apoptotic cells significantly increased (P<0.01) with 10 μg/ml PR-3 at hour 24 after treatment.Values at this time point were (75.5±26.5)% for PR-3 group and (1.8±1.2)% for negative control,demonstrating an increase of apoptosis in a dose- and time-dependent manner with the highest values achieved at hour 24.The apoptosis features appeared as nuclei condensation and DNA fragmentation,and typical DNA laddering was apparent in cells treated with PR-3 and in positive control cells treated with TNF-α.Conclusion The results suggest that PR-3 may directly induce glomerular endothelial cell apoptosis in vitro.This pathogenic role of PR-3 may be an important machanism of injury in anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated vasculitic diseases in children.
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【Key words】 Antineutrophil cytoplasmic antibody; Peptide peptidohydrolases; Lupus erythematosus,systemic; Kidney glomerulus; Apoptosis
抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)已被作为血管炎相关疾病标记抗体用于临床诊断和疗效评价[1，2]。研究证实，在ANCA相关性血管炎病损过程中，被活化的中性粒细胞胞浆蛋白酶可致血管内皮损伤和细胞溶解[1，2]，但有关机制尚不完全清楚。本文探讨ANCA阳性系统性红斑狼疮(SLE)患儿中性粒细胞胞浆蛋白酶-3(PR-3)对体外培养的人胎儿肾小球内皮细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 PR-3的分离制备
采集16例ANCA阳性的SLE患儿外周血，分离多核白细胞，-70 ℃保存。按Ewert等[3]方法从多核白细胞中空化沉淀中性粒细胞胞浆蛋白酶。参照Jia-Jin等[1]方法分离中性粒细胞胞浆蛋白酶-3，用抗PR-3 ELISA法识别。用SDS-PAGE分离纯化PR-3，并用ELISA法使PR-3与小鼠抗人单抗和兔抗人多抗发生反应，并识别酶活性[1]。
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1.2 人胎儿肾小球内皮细胞分离及培养
5个月引产人胎儿，分离摘取肾脏，剪切肾皮质成小碎块，于250、106 μm不锈钢筛网中轻研肾皮质，于75 μm筛网收集纯净肾小球，离心，用Ⅴ型胶原酶消化离散细胞，用10%FCS及RPMI 1640液终止。将上清液再离心，收集沉淀物并加入内皮细胞培养液[4]，于25 cm2培养瓶中，37 ℃，5% CO2孵育箱中孵育72 h，观察细胞生长情况，于10 d时传代，用第4～5代培养内皮细胞进行实验，每瓶加8 ml基质，2×106细胞量，分别移入48孔细胞培养盘中，每孔细胞密度为2×104、基质0.5 ml，并孵育使细胞融合24 h，用无血清RPMI 1640使细胞同步12 h[1，2，4]。培养内皮细胞随机分组，分别用1、5、10 μg/ml的PR-3处理并与 细胞共同培养6、12、24 h，同时设阳性对照组：用20 ng/ml重组TNF-α(处理6、12、24 h)，阴性对照组用PBS处理。并于各时间点观察各组细胞生存情况，比较各组凋亡的百分率。
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1.3 人胎肾小球内皮细胞凋亡的测定
1.3.1 用琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段：参照文献[1-3]方法，裂解内皮细胞，用酚∶氯仿(1∶1)及氯仿分别抽提DNA溶液，用酒精沉淀，双蒸水溶解，用10 μg/ml DNA酶消化6 h。加样DNA为6 μg/每泳道于1.5%琼脂糖凝胶中，于含1 μg/ml溴化乙啶的TBE缓冲液中，100 V电泳40 min分离DNA片段。紫外线显影DNA片段，用单克隆抗DNA-过氧化酶作偶联液与DNA片段样品液反应，在405 nm处读出光密度值。
1.3.2 用碘化丙啶染色评价肾小球内皮细胞凋亡：收集经PR-3、TNF-α及PBS处理的培养内皮细胞，甲醇固定，用碘化丙啶(50 μg/ml)加入RNase-A(10 mg/ml)，于37 ℃孵育1 h，取样并于荧光镜下观察[1-3]，从细胞形态学上识别凋亡细胞。
1.4 统计学处理
, 百拇医药
采用SDAS，Sigma-plot统计程序检验数据。
2 结 果
2.1 PR-3诱导人胎儿肾小球内皮细胞凋亡率：经PR-3处理的胎儿肾小球内皮细胞经DNA特异性染色，显示有明显的细胞凋亡，凋亡细胞特征为核染色体固缩、核碎裂和核酸片段形成(见图1a)。TNF-α处理组有类似现象，而PBS组凋亡不明显(见图1b)。且PR-3以剂量、时间依赖性形式引起内皮细胞发生凋亡。在剂量达10 μg/ml于24 h后凋亡细胞的百分率为(75.5±5.6)%；TNF-α处理组细胞凋亡率为(54.6±23.3)%；PBS处理组则为(1.8±1.2)%，PR-3处理组与PBS组比较差异具有显著性(P<0.01)(见图2)。
图2a PR-3不同剂量处理6 h内皮细胞凋亡
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呈剂量依赖性
图2b PR-3 (10 μg/ml) 24 h内皮细胞凋亡
呈时间依赖性
2.2 核酸片段凝胶电泳观察凋亡梯形：经琼脂糖凝胶电泳分析提示，PR-3所引起的凋亡细胞其DNA片段约为220 bp的整倍数片段，于电泳条带上呈现出典型的凋亡梯形。TNF-α组有类似特征，而PBS组则无凋亡梯形出现(见图3)。
图3 凋亡内皮细胞DNA电泳呈现凋亡梯形
2.3 PR-3处理组胎肾内皮细胞光镜下细胞形态变化：分别于实验0、6、12、24 h在相差显微镜下对比观察各处理组细胞形态学变化，提示PR-3处理组于实验6 h，即有细胞与培养基分离脱壁、细胞裂解、悬浮而使折光度增强，随酶的剂量增加和时间的延长，这种形态学的变化趋于明显。而PBS组未见类似的变化。
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3 讨 论
在ANCA相关性血管炎中，中性粒细胞可介导血管内皮细胞损伤[1-3]。其一为ANCA可激活中性粒细胞，使其释放细胞质中的蛋白酶造成内皮损伤，另可介导自由基产生而损伤血管内皮[1，5]。再者中性粒细胞胞浆中蛋白酶均具有直接的细胞毒性作用，可诱使多种细胞损伤、坏死或凋亡[1，2，6，7]。在ANCA相关性肾小球肾炎病人，中性粒细胞胞浆蛋白酶-3可直接损伤肾血管内皮细胞而导致严重蛋白尿和进行性肾功能损害[1，3，8]。本文采用ANCA阳性的SLE患儿外周血，分离纯化中性粒细胞胞浆蛋白酶PR-3，对培养人胎肾小球内皮细胞进行处理，发现PR-3对胎肾内皮细胞有直接的细胞毒性作用，可诱导肾小球内皮细胞发生凋亡[1，9]，即：①用PR-3处理的内皮细胞DNA片段明显增加；②PR-3处理组内皮细胞死亡趋势与蛋白酶呈剂量和时间依赖性关系；③DNA特异性染色提示，PR-3处理组内皮细胞所含固缩染色体和碎裂核酸片段显著高于对照组(P<0.01)；④凝胶电泳提示，PR-3处理组出现凋亡梯形带。上述变化与阴性对照组比较差异有显著性(P<0.01)。有关PR-3介导内皮细胞凋亡的机制尚不完全清楚，有学者认为丝氨酸蛋白酶在细胞凋亡过程中具有核酸内切酶的作用，可降解细胞外基质成分，增加细胞的通透性，影响细胞的有丝分裂，激活受体或刺激靶细胞摄取细胞因子，或促使细胞凋亡抑制因子降解，从而引起细胞凋亡的发生[1-3，6-8]。本研究发现，PR-3诱导肾小球内皮细胞一旦发生凋亡，这些凋亡细胞将从培养瓶壁脱落悬浮于培养液中，故观察细胞与瓶壁分离的百分率可间接反映凋亡细胞的百分比。并观察到细胞凋亡与PR-3间呈时间、剂量依赖性关系[1，7]。培养内皮细胞的存活、增生和分裂的必要条件之一是细胞与细胞外基质蛋白黏附[9，10]，否则将影响细胞代谢、DNA转录与合成、激活膜离子通道、发生Ca2+内流增加等，从而启动细胞的程序性死亡过程[9，10]，出现具有凋亡形态学和生化特征的细胞死亡[1，9，10]。PR-3能降解细胞外基质成分，从而可致肾小球与基质分离出现细胞结构和功能损伤[1，7，9]。并提示ANCA阳性结缔组织病急性期肾损害可能与ANCA激活中性粒细胞，使胞浆蛋白酶释放而介导肾小球细胞外基质降解导致基底膜、内皮细胞损伤的机制有关[1，3]。本文提示，ANCA相关特异性靶抗原PR-3诱导培养的胎肾内皮细胞发生凋亡，此类作用在有中性粒细胞被激活的急性炎症、急性血管炎性疾病的发生发展过程中具有重要的病理生理学意义[2，3，5-10]。但有关ANCA阴性者粒细胞PR-3在肾小球内皮损伤中的作用尚待进一步研究。
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图1a PR3诱导人胎肾小球内皮细胞凋亡 碘化丙啶×400
图1b PBS诱志人胎肾小球内皮细胞凋亡 碘化丙啶×400
基金项目：山西省科委基金资助项目(9821)
参 考 文 献
1，Jia-Jin Y,Kettriez R,Falk RJ,et al.Apoptosis of endothelial cells induced by the neutrophil serine proteinase 3 and elastase.Am J Pathol,1996,149:1617-1626.
2，Jennette JC,Wilkman AS,Falk RJ,et al.Antineutrophil ctyoplasmic autoantibody associated glomerulonephritis and vasculitis.Am J Pathol,1989,135:921-930.
, 百拇医药
3，Ewert BH,Jennette JC,Falk RJ,et al.Anti-myeloperoxidase antibodies stimulate neutrophils to damage human endothelial cells.Kidney Int,1992,41:375-383.
4，陈香美，于力方，陈中华，等.肾小球内皮细胞培养及产生细胞外基质的实验研究.中华医学杂志，1995，75：25-27.
5，Kallenberg CGM,Brouwer E,Mulder AHL,et al.ANCA-pathophysiology revisited.Clin Exp Immunol,1995,100:1-3.
6，Smyth MJ,Trapani JA.Exogenous proteinases that induce target cell apoptosis.Immunol Today,1995,16:202-208.
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7，Marthinuss J,Andrade GP,Seiberg M,et al.A secreted serine protease can induce apoptosis in pam 212 keratinocytes.Cell Growth Differ,1995,6:807-816.
8，Westlin WF,Ryan US,Ward PA,et al.Neutrophil mediated damage to human vascular endothelium:role of cytokinr activation.Am J Pathol,1993,142:117-128.
9，Meredith JE,Fazeli BJ,Shwarty MA,et al.The extrocellular matrix as a cell survival factor.Mol Biol Cell,1993,4:953-961.
10，Re F,Zahetti A,Sironi M,et al.Inhibition of anchorage dependent cell spreaging triggers apoptosis in cultured human Ecs.J Cell Biol,1994,127:537-546.
收稿日期：1999-10-28, http://www.100md.com