钙蛋白酶及钙蛋白酶抑制蛋白mRNA在类风湿关节炎发病机制中的作用
作者：徐建华 张仁利 孙桂华 杨明功 帅宗文 张锐
单位：徐建华(合肥，安徽医科大学第一附属医院风湿科 230022)；孙桂华(合肥，安徽医科大学第一附属医院风湿科 230022)；杨明功(合肥，安徽医科大学第一附属医院风湿科 230022)；帅宗文(合肥，安徽医科大学第一附属医院风湿科 230022)；张锐(合肥，安徽医科大学第一附属医院风湿科 230022)；张仁利(日本名古屋市立大学医学部)
关键词：钙蛋白酶；钙蛋白酶抑制蛋白；关节炎，类风湿
中华风湿病学杂志000604 【摘 要】 目的 通过比较钙蛋白酶(calpain)和钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)mRNA在类风湿关节炎(RA)和骨关节炎(OA)滑膜上的表达以及人的calpastatin抗原表位的探查，研究calpain和calpastatin在RA发病机制中的作用。方法 总RNA从3例RA和2例OA患者滑膜组织中提取；RT-PCR和数字影像光密度仪检测calpain和calpastatin的表达。用自动多肽合成仪合成人的calpastatin N端L区和C端Ⅳ区重叠的寡聚肽链；7例RA血清通过dot-ELISA法鉴定合成的calpastatin肽链的抗原表位。结果 RA和OA患者的滑膜组织calpain mRNA的表达水平均高于calpastatin的表达，同时calpain的表达在RA高于OA。人的calpastatin的三个共同的抗原表位被鉴别在C-端Ⅳ区。结论 Calpain和calpastatin系统参与了RA的发病；RA患者体内存在抗calpastatin自身抗体，合成人的calpastatin肽链可能为RA的诊治提供新的思路。
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Expression of calpain and calpastatin in arthritis and antigen epitopes of human calpastatin recognized by rheumatoid arthritis sera
XU Jianhua ZHANG Renli SUN Guihua
(Department of Rheumatology,First Affiliated Hospital,Anhui Medical University,Hefei 230022,China)
【Abstract】 Objective To compare the expression level of calpain and calpastatin mRNA in rheumatoid arthritis (RA) and osteoarthritis (OA) synovial tissues (ST) and analyze the antigen epitopes of human calpastatin recognized by RA sera.Methods Total RNA of three RA and two OA patients was isolated from ST and expression levels of calpain and calpastatin mRNA were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).According to hydrophilicity of human calpastatin (Accession,U 31346),overlapping oligopeptides were synthesized by auto-spot Robot in N-terminal (L domain) and C-terminal (Ⅳ domain) of calpastatin.The epitopes of synthesized peptides were analyzed by RA sera using dot-ELISA.Results mRNA expression of calpain showed higher than that of calpastatin in both OA and RA.Meanwhile,the mRNA expression level of calpain increased in RA more than that in OA.Three antigen epitopes of human calpastatin (with the sequence DKDLDDALD,DTIPPEYRH and QDPIDALSG) were identified by RA sera,while control sera failed to react with synthetic peptides.Conclusion The calpain-calpastatin system may participate in pathogenic mechanism of RA,and the calpastatin may be a target for autoantibody of RA,which implies that it is not only possible to treat RA patients with synthetic peptide of human calpastatin,as a chemotherapeutant,but also a materials for immunodiagnosis of RA.
, 百拇医药
【Key words】 Calpain; Calpastatin; Arthritis,rheumatoid
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以滑膜增生，软骨破坏和骨侵蚀为特征。发病机制仍不很清楚。最近一些研究报道了钙蛋白酶(calpain)能够降解结缔组织基质并在RA软骨破坏上发挥了重要的作用[1]。Calpain是一种钙依赖中性半胱氨酸蛋白酶，只有在钙存在时才能被激活，它包括一个相对分子质量为80 000的大亚基和一个相对分子质量为30 000的小亚基[2]。钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)是calpain的天然抑制剂，它由5个部分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和L区)组成，每个部分约140个氨基酸[3，4]。Calpain-calpastatin系统最初被认为是一个细胞内蛋白水解酶[5]，最近证明它们也存在于细胞外，如在RA和OA的滑液中[6，7]。本研究用RT-PCR探查和比较calpain-calpastatin系统在RA和OA滑膜组织中的情况；同时合成calpastatin的Ⅳ区和L区肽链，用RA患者血清通过ELISA方法鉴别其抗原的表位，进一步探讨RA的发病机制。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本
3例RA和2例OA病人的膝关节滑膜组织，7例RA患者的血清被获取。所有RA患者均符合ARA 1987年诊断RA的标准[8]。
1.2 方法
1.2.1 RT-PCR：总RNA提取：取5～10 mg冷冻滑膜组织，用PURE试剂盒(Gibco公司)，按操作说明进行。1 μg总RNA用随机hexamer引物进行反转录获得cDNA。人的calpain引物：5′-AGCTTCC-AGAATGGCTATGC-3′和5′-TGGCCTCCATGTCTAGAACG-3′；calpastatin引物：5′-GACCTCGATGATGCCTTGGA-3′，和5′-GCATCAATGGGGTC-TTGGTC-3′分别以cDNA为模板进行扩增(94 ℃ 9 min—94 ℃ 45 s；56 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min 35循环—72 ℃ 7 min)。PCR产物电泳：2% agarose胶加入0.1 μg/ml溴化乙啶在TE缓冲液中进行。数字影像光密度仪测定PCR产物含量。同时我们使用β-actin作为内部对照，从actin的mRNA扩增一个600 bp的片断(其引物是：5′-ATGGATGACGATATCGCTG-3′和5′-ATGAGGTAGTCTGTCA-GGT-3′；它的退火温度是60 ℃)作为内部参考来判断标本的mRNA表达的量。
, 百拇医药
1.2.2 Dot-ELISA检测合成的重叠寡聚肽链：用Genetyx-Mac 9.0分析人的calpastatin的亲水性，calpastatin的两个亲水区；L区(101～153)和Ⅳ区(564～680)被合成为以9个氨基酸为一个寡聚肽链的重叠的肽链库，每相邻的两个肽链之间，仅有一个氨基酸不同，按自动spot Robot(Gilson公司)的操作原理将肽链合成在固相上，并用计算机控制合成程序。在固相filter上，每结合一个氨基酸需用2%的acetic anhydride来封闭，合成完毕后，用dimethylformamide充分冲洗。用trifluoroacetic acid来脱除侧链反应。7例RA患者血清和1例正常人血清作为对照，用dot-ELISA方法[9]来测定抗原的表位，并用数字影像系统来分析dot-ELISA的结果，以确定每个点的反应强度。
2 结 果
2.1 Calpain和calpastatin mRNA的表达：calpain和calpastatin mRNA的表达在RA和OA滑膜组织RT-PCR的结果显示：RA患者的calpain和calpastatin的浓度强于OA(见图1)。光密度仪测定PCR产物含量示：在RA和OA滑膜组织calpain mRNA的表达均高于calpastatin，在RA的表达更高于OA，calpain/calpastatin的比值RA＝2.02/1，OA＝1.3/1(见表1)。
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图1 RT-PCR分析RA和OA患者关节滑膜
calpain和calpastatin mRNA的表达
表1 RA和OA患者的关节滑膜calpain和
calpastatin mRNA的表达比较 组别
序号
Calpain
Calpastatin
OA
1
1 434.00
960.00
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2
1 473.00
1 196.00
RA
3
3 548.00
2 201.00
4
2613.00
1 825.00
5
2 664.00
1 395.00
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注：数字影像光密度仪测定RT-PCR产物染色的强度2.2 用RA血清鉴别calpastatin线性表位图：为了鉴别calpastatin的抗原性和表位。每9个氨基酸肽链为最小的阳性片段重叠的144寡聚肽链(calpastatin的101～153和564～680氨基酸残基)被合成和分析。Dot-ELISA法探查合成的calpastatin抗原表位，7例RA血清有5例患者与合成的肽链发生明显的反应，并且3个共同的表位被显示，其氨基酸序列分别为DKDLDDALD (residue,564～572)，DTIPPEYRH (residue,612～620)和QDPIDALSG (residue 648～656)。正常人对照血清没有反应(见图2)。
3 讨 论
Calpain-calpastatin系统与RA的联系已经被报道[10-14]。Calpain是一个溶解性的钙依赖半胱氨酸蛋白酶已经被广泛研究在体内外炎症模型中[13]和在体外降解软骨的蛋白多糖[15]。一些动物模型提示与细胞相互作用有关的蛋白水解酶在软骨破坏上发挥作用[10]，这些蛋白水解酶通常在体内被特异性天然的抑制剂灭活[16]。在正常的生理情况下，激活的calpain可被calpastatin抑制而保持平衡，但是在关节炎时calpain和calpastatin被提示是不平衡的[14，16]。Yamamoto等[12]报道：用免疫组织化学探查了calpain在RA和OA滑膜内层的分布，结果RA的calpain稍强于OA；同时在RA患者的关节滑液中calpastatin少于calpain。本研究也显示calpain和calpastatin mRNA的表达在RA和OA滑膜组织是不平衡的，calpain高于calpastatin，尤其在RA更为明显。这个结果提示过多的calpain可能参与了RA和OA的软骨破坏，这与临床上RA和OA都有软骨损伤，而RA更是以软骨和骨进行性破坏为特征的临床表现相一致。
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图2 Dot-ELISA分析合成的calpastatin肽链的抗原表位
Calpain多于calpastatin的机制如何?目前尚不清楚。但抗calpastatin自身抗体被探查在RA为48%～57%，而在其他结缔组织病为11%～25%[14，17]。抗calpastatin抗体完全有可能阻止了calpastatin介导的抑制calpain的蛋白水解活性，该抗体与calpastatin结合，使活性calpastatin减少，相对增加了calpain的活性并可能累及组织损伤[14]，这就可能导致免疫复合物介导的炎症反应和不可控制的calpain激活。
在我们的研究中，人的calpastatin的N-端(L区)和C-端(Ⅳ区)被选择来合成了寡聚肽链，合成肽链抗原的表位用dot-ELISA检测，7例RA患者的血清有5例显示与合成的肽链有明显的反应并且几个共同的表位均被鉴定在calpastatin的C-端，N-端没有观察到反应，这与calpastatin的N-端没有抑制功能，C-端为抑制功能区可能有关[3，4]。同时正常对照血清没有反应。这个结果说明calpastatin可能是一个自身抗原，它的表位能够与RA患者的血清中的抗calpastatin自身抗体结合。Mimori等[14]也报道了一个对靶抗原的自身抗体cDNA克隆(RA-6)完全被鉴定在人的calpastatin的C-端。虽然我们的研究显示，合成的人的calpastatin的C-端(Ⅳ区)与RA患者的血清起反应，但是否与calpastatin的C-端(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区)起反应，是否与OA患者的血清起反应，尚需进一步的研究。
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抗calpastatin自身抗体又是如何产生?有报道发现：calpain和calpastatin的表达增加在感染了人类嗜T淋巴细胞病毒1(一种反转录病毒)细胞内[18，19]，这种病毒可以引起类似RA的关节病变[20]，可能与人类的calpastatin有共同抗原。另外calpastatin基因突变也可能产生异常的calpastatin表达，成为自身抗原。Esser等[11]已报道了用合成的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhitors，CPIs)作为抗风湿疾病的缓解药已用于小鼠的佐剂性关节炎和胶原诱导的关节炎。因此，研究calpain-calpastatin系统有助于理解RA的发病机制，合成钙蛋白酶的抑制剂可能为开拓新的抗风湿药提供思路。
基金项目：安徽省教育委员会自然科学基金资助项目(99jl0096)
参 考 文 献
, 百拇医药
1，Harris ED Jr.Rheumatoid arthritis:pathophysiology and implications for therapy.N Engl J Med,1990,322:1277-1289.
2，Ohno S,Emori Y,Imajoh S,et al.Evolutionary origin of a calcium dependent protease by fusion of genes for a thiol protease and a calcium binding protein.Nature,1984,312:566-570.
3，Asada K,Ishino Y,Shimada M,et al.cDNA cloning of human calpastatin:sequence homology among human,pig and rabbit calpastatins.J Enzyme Inhibit,1989,3:49-56.
, 百拇医药
4，Emori Y,Kawasaki H,Imajoh S,et al.Endogenous inhibitor for calcium-dependent cysteine protease contains four internal repeats that could be responsible for its mutiple sites.Proc Natl Acad Sci USA,1987,84:3590-3594.
5，Murachi T.Calpain and calpastatin.Trends Biochem Sci,1983,8:167-169.
6，Suzuki K,Shimizu K,Hamamoto T,et al.Biochemical demonstration of calpains and calpastatin in osteoarthritic synovial fluid.Arthritis Rheum,1990,33:728-732.
, 百拇医药
7，Fukui I,Tanaka K,Murachi T.Extracellar appearance of calpain and calpastatin in the synovial fluid of the knee joint.Biochem Biophys Res Commun,1989,162:559-566.
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13，Gabrijelcic D,Annan-Prah A,Rodic B,et al.Determination of cat-hepsins B and H in sera and synovial fluids of patients with different joint diseases.J Clin Chem Clin Biochem,1990,28:149-153.
14，Mimori T,Suganuma K,Tanami Y,et al.Autoantibodies to calpastatin (an endogenous inhibitor for calcium-dependent neutral protease,calpain) in systemic rheumatic disease.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:7267-7271.
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, 百拇医药
16，Despres N,Talbot G,Plouffe B,et al.Detection and expression of a cDNA clone that encodes a polypeptide containing two inhibitory domains of human calpastatin and its recognition by rheumatoid arthritis sera.J Clin Invest,1995,95:1891-1896.
17，Takada R,Matsumoto M,Yosida M,et al.Detection of isotpe-specific autoantibodies to calpastatin in sera from patients with rheumatic diseases using heat-treated HeLa cell extract as an antigen source for immunoblotting.Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi,1998,21:150-158.
, 百拇医药
18，Adachi Y,Takano E,Murachi T,et al.Distribution and expression of calpastatin in human hematopoietic system cells.Biol Chem Hoppe Seyler,1988,369:223-227.
19，Adachi Y,Kitahara-Ozawa A,Sugamura K,et al.Expression of calpain Ⅱ gene in human hematopoietic system cells infected with human T-cell leukemia virus type Ⅰ.J Biol Chem,1992,267:19373-19387.
20，Kitajima I,Yamamoto K,Sato K,et al.Detection of human T cell lymphotropic virus type I proviral DNA and its gene expression in synovial cells in chronic inflammatory arthropathy.J Clin Invest,1991,88:1315-1322.
收稿日期：1999-12-25, 百拇医药
单位：徐建华(合肥，安徽医科大学第一附属医院风湿科 230022)；孙桂华(合肥，安徽医科大学第一附属医院风湿科 230022)；杨明功(合肥，安徽医科大学第一附属医院风湿科 230022)；帅宗文(合肥，安徽医科大学第一附属医院风湿科 230022)；张锐(合肥，安徽医科大学第一附属医院风湿科 230022)；张仁利(日本名古屋市立大学医学部)
关键词：钙蛋白酶；钙蛋白酶抑制蛋白；关节炎，类风湿
中华风湿病学杂志000604 【摘 要】 目的 通过比较钙蛋白酶(calpain)和钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)mRNA在类风湿关节炎(RA)和骨关节炎(OA)滑膜上的表达以及人的calpastatin抗原表位的探查，研究calpain和calpastatin在RA发病机制中的作用。方法 总RNA从3例RA和2例OA患者滑膜组织中提取；RT-PCR和数字影像光密度仪检测calpain和calpastatin的表达。用自动多肽合成仪合成人的calpastatin N端L区和C端Ⅳ区重叠的寡聚肽链；7例RA血清通过dot-ELISA法鉴定合成的calpastatin肽链的抗原表位。结果 RA和OA患者的滑膜组织calpain mRNA的表达水平均高于calpastatin的表达，同时calpain的表达在RA高于OA。人的calpastatin的三个共同的抗原表位被鉴别在C-端Ⅳ区。结论 Calpain和calpastatin系统参与了RA的发病；RA患者体内存在抗calpastatin自身抗体，合成人的calpastatin肽链可能为RA的诊治提供新的思路。
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Expression of calpain and calpastatin in arthritis and antigen epitopes of human calpastatin recognized by rheumatoid arthritis sera
XU Jianhua ZHANG Renli SUN Guihua
(Department of Rheumatology,First Affiliated Hospital,Anhui Medical University,Hefei 230022,China)
【Abstract】 Objective To compare the expression level of calpain and calpastatin mRNA in rheumatoid arthritis (RA) and osteoarthritis (OA) synovial tissues (ST) and analyze the antigen epitopes of human calpastatin recognized by RA sera.Methods Total RNA of three RA and two OA patients was isolated from ST and expression levels of calpain and calpastatin mRNA were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).According to hydrophilicity of human calpastatin (Accession,U 31346),overlapping oligopeptides were synthesized by auto-spot Robot in N-terminal (L domain) and C-terminal (Ⅳ domain) of calpastatin.The epitopes of synthesized peptides were analyzed by RA sera using dot-ELISA.Results mRNA expression of calpain showed higher than that of calpastatin in both OA and RA.Meanwhile,the mRNA expression level of calpain increased in RA more than that in OA.Three antigen epitopes of human calpastatin (with the sequence DKDLDDALD,DTIPPEYRH and QDPIDALSG) were identified by RA sera,while control sera failed to react with synthetic peptides.Conclusion The calpain-calpastatin system may participate in pathogenic mechanism of RA,and the calpastatin may be a target for autoantibody of RA,which implies that it is not only possible to treat RA patients with synthetic peptide of human calpastatin,as a chemotherapeutant,but also a materials for immunodiagnosis of RA.
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【Key words】 Calpain; Calpastatin; Arthritis,rheumatoid
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以滑膜增生，软骨破坏和骨侵蚀为特征。发病机制仍不很清楚。最近一些研究报道了钙蛋白酶(calpain)能够降解结缔组织基质并在RA软骨破坏上发挥了重要的作用[1]。Calpain是一种钙依赖中性半胱氨酸蛋白酶，只有在钙存在时才能被激活，它包括一个相对分子质量为80 000的大亚基和一个相对分子质量为30 000的小亚基[2]。钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)是calpain的天然抑制剂，它由5个部分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和L区)组成，每个部分约140个氨基酸[3，4]。Calpain-calpastatin系统最初被认为是一个细胞内蛋白水解酶[5]，最近证明它们也存在于细胞外，如在RA和OA的滑液中[6，7]。本研究用RT-PCR探查和比较calpain-calpastatin系统在RA和OA滑膜组织中的情况；同时合成calpastatin的Ⅳ区和L区肽链，用RA患者血清通过ELISA方法鉴别其抗原的表位，进一步探讨RA的发病机制。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本
3例RA和2例OA病人的膝关节滑膜组织，7例RA患者的血清被获取。所有RA患者均符合ARA 1987年诊断RA的标准[8]。
1.2 方法
1.2.1 RT-PCR：总RNA提取：取5～10 mg冷冻滑膜组织，用PURE试剂盒(Gibco公司)，按操作说明进行。1 μg总RNA用随机hexamer引物进行反转录获得cDNA。人的calpain引物：5′-AGCTTCC-AGAATGGCTATGC-3′和5′-TGGCCTCCATGTCTAGAACG-3′；calpastatin引物：5′-GACCTCGATGATGCCTTGGA-3′，和5′-GCATCAATGGGGTC-TTGGTC-3′分别以cDNA为模板进行扩增(94 ℃ 9 min—94 ℃ 45 s；56 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min 35循环—72 ℃ 7 min)。PCR产物电泳：2% agarose胶加入0.1 μg/ml溴化乙啶在TE缓冲液中进行。数字影像光密度仪测定PCR产物含量。同时我们使用β-actin作为内部对照，从actin的mRNA扩增一个600 bp的片断(其引物是：5′-ATGGATGACGATATCGCTG-3′和5′-ATGAGGTAGTCTGTCA-GGT-3′；它的退火温度是60 ℃)作为内部参考来判断标本的mRNA表达的量。
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1.2.2 Dot-ELISA检测合成的重叠寡聚肽链：用Genetyx-Mac 9.0分析人的calpastatin的亲水性，calpastatin的两个亲水区；L区(101～153)和Ⅳ区(564～680)被合成为以9个氨基酸为一个寡聚肽链的重叠的肽链库，每相邻的两个肽链之间，仅有一个氨基酸不同，按自动spot Robot(Gilson公司)的操作原理将肽链合成在固相上，并用计算机控制合成程序。在固相filter上，每结合一个氨基酸需用2%的acetic anhydride来封闭，合成完毕后，用dimethylformamide充分冲洗。用trifluoroacetic acid来脱除侧链反应。7例RA患者血清和1例正常人血清作为对照，用dot-ELISA方法[9]来测定抗原的表位，并用数字影像系统来分析dot-ELISA的结果，以确定每个点的反应强度。
2 结 果
2.1 Calpain和calpastatin mRNA的表达：calpain和calpastatin mRNA的表达在RA和OA滑膜组织RT-PCR的结果显示：RA患者的calpain和calpastatin的浓度强于OA(见图1)。光密度仪测定PCR产物含量示：在RA和OA滑膜组织calpain mRNA的表达均高于calpastatin，在RA的表达更高于OA，calpain/calpastatin的比值RA＝2.02/1，OA＝1.3/1(见表1)。
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图1 RT-PCR分析RA和OA患者关节滑膜
calpain和calpastatin mRNA的表达
表1 RA和OA患者的关节滑膜calpain和
calpastatin mRNA的表达比较 组别
序号
Calpain
Calpastatin
OA
1
1 434.00
960.00
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2
1 473.00
1 196.00
RA
3
3 548.00
2 201.00
4
2613.00
1 825.00
5
2 664.00
1 395.00
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注：数字影像光密度仪测定RT-PCR产物染色的强度2.2 用RA血清鉴别calpastatin线性表位图：为了鉴别calpastatin的抗原性和表位。每9个氨基酸肽链为最小的阳性片段重叠的144寡聚肽链(calpastatin的101～153和564～680氨基酸残基)被合成和分析。Dot-ELISA法探查合成的calpastatin抗原表位，7例RA血清有5例患者与合成的肽链发生明显的反应，并且3个共同的表位被显示，其氨基酸序列分别为DKDLDDALD (residue,564～572)，DTIPPEYRH (residue,612～620)和QDPIDALSG (residue 648～656)。正常人对照血清没有反应(见图2)。
3 讨 论
Calpain-calpastatin系统与RA的联系已经被报道[10-14]。Calpain是一个溶解性的钙依赖半胱氨酸蛋白酶已经被广泛研究在体内外炎症模型中[13]和在体外降解软骨的蛋白多糖[15]。一些动物模型提示与细胞相互作用有关的蛋白水解酶在软骨破坏上发挥作用[10]，这些蛋白水解酶通常在体内被特异性天然的抑制剂灭活[16]。在正常的生理情况下，激活的calpain可被calpastatin抑制而保持平衡，但是在关节炎时calpain和calpastatin被提示是不平衡的[14，16]。Yamamoto等[12]报道：用免疫组织化学探查了calpain在RA和OA滑膜内层的分布，结果RA的calpain稍强于OA；同时在RA患者的关节滑液中calpastatin少于calpain。本研究也显示calpain和calpastatin mRNA的表达在RA和OA滑膜组织是不平衡的，calpain高于calpastatin，尤其在RA更为明显。这个结果提示过多的calpain可能参与了RA和OA的软骨破坏，这与临床上RA和OA都有软骨损伤，而RA更是以软骨和骨进行性破坏为特征的临床表现相一致。
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图2 Dot-ELISA分析合成的calpastatin肽链的抗原表位
Calpain多于calpastatin的机制如何?目前尚不清楚。但抗calpastatin自身抗体被探查在RA为48%～57%，而在其他结缔组织病为11%～25%[14，17]。抗calpastatin抗体完全有可能阻止了calpastatin介导的抑制calpain的蛋白水解活性，该抗体与calpastatin结合，使活性calpastatin减少，相对增加了calpain的活性并可能累及组织损伤[14]，这就可能导致免疫复合物介导的炎症反应和不可控制的calpain激活。
在我们的研究中，人的calpastatin的N-端(L区)和C-端(Ⅳ区)被选择来合成了寡聚肽链，合成肽链抗原的表位用dot-ELISA检测，7例RA患者的血清有5例显示与合成的肽链有明显的反应并且几个共同的表位均被鉴定在calpastatin的C-端，N-端没有观察到反应，这与calpastatin的N-端没有抑制功能，C-端为抑制功能区可能有关[3，4]。同时正常对照血清没有反应。这个结果说明calpastatin可能是一个自身抗原，它的表位能够与RA患者的血清中的抗calpastatin自身抗体结合。Mimori等[14]也报道了一个对靶抗原的自身抗体cDNA克隆(RA-6)完全被鉴定在人的calpastatin的C-端。虽然我们的研究显示，合成的人的calpastatin的C-端(Ⅳ区)与RA患者的血清起反应，但是否与calpastatin的C-端(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区)起反应，是否与OA患者的血清起反应，尚需进一步的研究。
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抗calpastatin自身抗体又是如何产生?有报道发现：calpain和calpastatin的表达增加在感染了人类嗜T淋巴细胞病毒1(一种反转录病毒)细胞内[18，19]，这种病毒可以引起类似RA的关节病变[20]，可能与人类的calpastatin有共同抗原。另外calpastatin基因突变也可能产生异常的calpastatin表达，成为自身抗原。Esser等[11]已报道了用合成的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhitors，CPIs)作为抗风湿疾病的缓解药已用于小鼠的佐剂性关节炎和胶原诱导的关节炎。因此，研究calpain-calpastatin系统有助于理解RA的发病机制，合成钙蛋白酶的抑制剂可能为开拓新的抗风湿药提供思路。
基金项目：安徽省教育委员会自然科学基金资助项目(99jl0096)
参 考 文 献
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收稿日期：1999-12-25, 百拇医药