系统性红斑狼疮患者外周血辅助性T淋巴细胞表型分析及与疾病活动性的相关性
作者：王来 何培根
单位：王来(武汉，同济医科大学附属同济医院风湿科 430030)；何培根(武汉，同济医科大学附属同济医院风湿科 430030)
关键词：
中华风湿病学杂志000620
系统性红斑狼疮(SLE)患者免疫系统的主要异常是依赖于T细胞的B细胞功能亢进，产生大量 的自身抗体和免疫复合物[1]，根据产生的细胞因子的不同，人CD4+T细胞(辅助 型T细胞)至少可分为三种功能亚型：Th1细胞生成白细胞介素-2(IL-2)，干扰素-γ(IFN -γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；Th2细胞生成IL-4、IL-5、IL-6和IL-10；Th0细 胞可生成两类细胞因子[2]。本文运用流式细胞仪采用三色荧光标记分析SLE患者外 周血单个核细胞(PBMC)的CD4，CD25以及CD30三种表面抗原的表达，试图通过这些表面标记 反映Th细胞的量的变化，激活状态以及活化细胞是否分泌Th2细胞因子，并探讨这些表达与S LE疾病活动性的相关性。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 临床资料：23例SLE患者男性1例，女性22例，年龄13～58岁，病例组均受治于同济医 院内科，根据ACR标准确定诊断[3]，患者均未合并炎性感染，其中10例患者已接受 激素治疗(强的松1～2 mg.kg-1.d-1，口服)，13例患者尚未接受任何治疗 。10名健康献血者作为正常对照组，男性2名，女性8名，年龄22～31岁。
1.2 标本处理：静脉采集的外周血(肝素抗凝)在4 h内进
行分析，首先经Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液(pharmacia)离心分层，取出中间层的PBMC 置于5 ml Falcon试管，每试管的100 μl细胞悬液中含大约105个细胞，采用三色免疫荧 光染色。
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1.3 细胞染色：20 μl异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗人CD30单克隆抗体，20 μl藻 红蛋白(PE)标记的小鼠抗人CD25单克隆抗体和20 μl Cy-chrom标记的小鼠抗人CD4单克隆 抗体(购自PharMingen公司)分别加入待测试管，相应标记的小鼠IgG亚型抗体作为阴性对照 。试管置于4 ℃暗处反应30 min后用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4，含1%叠氮钠和0.5%白蛋 白)清洗离心，吸去上清液后用300 μl 1%多聚甲醛固定待用。
1.4 流式细胞仪分析：运用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson)进行细胞表面抗原分 析，仪器提供前向散射光(FSC)，侧向散射光(SSC)以及不同波长的荧光(FL1，FL2，FL3)等 参数，在FSC-SSC二维点图上确定出淋巴细胞的分布，随后在FL1-FL2及FL2-FL3二维点图 上进行细胞各表面标记的分析，每份标本分析10 000个细胞。
1.5 SLEDAL评分：SLE疾病活动性运用SLEDAL标准评分[4]：中枢神经系统表现( 癫痫、精神病、器质性脑病、视觉障碍、颅神经病变、狼疮性头痛、脑血管意外)各计8分， 血管炎计8分，关节炎和肌炎各计4分，肾脏表现(管型尿、血尿、蛋白尿、脓尿)各计4分， 新发皮疹、脱发和黏膜溃疡各计2分，胸膜炎和心包炎各计2分，低补体血症和DNA结合率增 高各计2分，发热、血小板减少和白细胞减少性血症各计1分，总分105分。
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1.6 统计学处理：分别计算SLE患者组与正常对照组细胞阳性率的中间值，下25%至上25% 的区间值用以反映变化范围，运用Mann-Whitney检验进行SLE组与对照组的表面抗原比较； 运用Spearman检验进行表面抗原与疾病活动性SLEDAI评分的相关性分析，设定P<0.05 为统计学上有显著意义。
2 结 果
2.1 细胞表面抗原表达：病例组及正常对照组的血液标本在采集后及时加以染色分析以尽 可能反映细胞在体内的状况。SLE患者标本的流式细胞仪分析图谱FL1-FL3和FL2-FL3二维 点图显示单个细胞水平上淋巴细胞的三种表面抗原的表达。经统计分析SLE患者PBMC中CD4 +细胞较正常对照组显著减少(P<0.05)，二者的中间值分别为36.2%和30.6%。SLE 组的CD4+CD25+细胞的百分率中间值为8.9%，较正常组的7.0%显著增高，P<0 .05。正常组与SLE组的PBMC几乎均无CD4+CD30+细胞表达，也未见CD4-CD30+ 细胞。
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2.2 SLEDAI评分：23例SLE患者中，22例伴有肾脏病变，20例伴有关节炎和/或肌炎，20例 伴低补体血症和/或DNA结合率增高，18例有皮疹和/或脱发和/或黏膜溃疡，16例伴发热，14 例外周血中血小板减少和/或白细胞减少，13例伴有胸膜炎和/或心包炎，4例合并血管炎，4 例合并中枢神经系统病变。患者的临床疾病活动性SLEDAI评分范围为14～38分，中间值为24 分。
2.3 相关性分析：SLE患者CD4+CD25+细胞阳性率与患者SLEDAI的评分有显著的相关 性(r＝0.433 0，P<0.05)，CD4细胞阳性率与SLEDAI无显著相关性(r＝0.1 24 4，P>0.5)。
3 讨 论
SLE患者外周血中淋巴细胞亚型分布反映了机体免疫调节状态，其变化可以导致SLE的免疫异 常。本文结果证实了SLE CD4+辅助性T细胞数目减少，这是T细胞反应性自身抗体作用的 结果，免疫激活引起的细胞死亡也可能减少细胞数。CD25是IL-2受体的α链，是IL-2的低 亲和力受体，表达于活化的T细胞、B细胞和单核细胞[5]，CD4+细胞的CD25表达 显著增高反映了高水平的免疫系统激活状态；它与疾病活动性存在的显著相关性更说明了SL E的病理性质，CD4+CD25+细胞百分率可视为疾病活动性的标记之一。Wolf等[6 ]的研究报道SLE患者血清中可溶性CD25(sCD25)显著增高，并建议作为疾病进展的观察指 标。
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活化的T细胞可以表达多种表面分子，其中，CD30抗原被认为是产生Th2型细胞因子的一类分 化和/或活化T淋巴细胞的标记。CD30是TNF受体超家族中的一类细胞因子受体，表达于产生T h2型细胞因子的活化的CD4+细胞表面[7，8]，有关细胞因子的研究提示，Th2细 胞因子生成增多参与SLE的病理过程[9，10]，这些因子可以促进分泌自身抗体的B 细胞的活化和分化[11]。SLE患者血清中可溶性CD30(sCD30)较正常对照组明显增高 ，而且与SLE的活动性相关[12]，说明体内存在CD30高表达的细胞。然而本文结果 显示活化的CD4+细胞并未表达CD30，CD4-的淋巴细胞(CD8+细胞)也无CD30的表达 ，其原因可能是外周循环中表达并释放CD30的细胞局限于机体发生炎性病变的微环境中。此 外，文献[13]报道正常外周血淋巴细胞一般不表达CD30，T细胞只有经体外有丝分裂原(如 PHA，抗CD3抗体等)或适当的细胞因子(如IL-2和IL-4)刺激活化之后才表达CD30，CD30也 可能由其他非T细胞分泌。酶点法研究SLE患者PBMC，发现Th2细胞因子(IL-6和IL-10)主要 由CD14+的单核/巨噬细胞分泌[9]。
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T细胞的激活程度反映了SLE的活动性，活化T细胞生成Th1/Th2细胞因子平衡失调，与自身抗 体产生过多密切相关，参与SLE疾病发生及进展。以抑制淋巴细胞活化，调节Th1/Th2细胞因 子失衡为目的的免疫调节制剂的应用，将为治疗SLE提供新的有效手段。
参 考 文 献
1，Mills JA.Systemic lupus erythematosus.N Engl J Med,1994,330:1 871-1879.
2，Romagnani S.Lymphokine production by human T cells in disease states.Ann Rev Immunol,1994,12:227-257.
3，Tan EM,Cohen AS,Fries JF,et al.The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus.Arthritis Rheum,1982,25:1271 -1277.
, 百拇医药
4，Bombardier C,Gladman DD,Urowitz MB,et al.Derivation of the SL EDAI:a disease activity index for lupus patients.Arthritis Rheum,1992,35:630-64 0.
5，Minami Y,Kono T,Miyazaki T,et al.The IL-2 receptor complex:i ts structure, function and target genes.Ann Rev Immunol,1993,11:245-268.
6，Wolf RE,Brelsford WG.Soluble interleukin-2 receptors in syst emic lupus erythematosus.Arthritis Rheum,1988,31:729-735.
, 百拇医药
7，del Prete G,de Carli M,Almerigogna F,et al.Preferential expr ession of CD30 by human CD4+ T cells producing Th2-type cytokines.FASEB J,19 95,9:81-86.
8，del Prete G,de Carli M,D′Elios MM,et al.CD30-mediated signa ling promotes the development of human T helper type 2-like T cells.J Exp Med,1 995,182:1655-1661.
9，Hagiwara E,Gourley MF,Lee S,et al.Disease severity in patient s with systemic lupus erythematosus correlates with an increased ratio of interl eukin-10:interferon-γ-secreting cells in the peripheral blood.Arthritis Rheu m,1996,39:379-385.
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10，Richand PY,Alcocer VJ,Llorente L.High levels of Th2 cytokine gene exp ression in systemic lupus erythematosus.Rev Invest Clin,1995,47:267-272.
11，Kitani A,Hara M,Hirose T,et al.Heterogeneity of B cell responsiveness to interleukin 4,interleukin 6 and low molecular weight B cell growth factor in discrete stages of B cell activation in patients with systemic lupus erythemato sus.Clin Exp Immunol,1989,77:31-36.
12，Caligaris-Cappio F,Bertero MT,Converso M,et al.Circulating levels of soluble CD30:a marker of cells producing Th2-type cytokines,are increased in p atients with systemic lupus erythematosus and correlate with disease activity.Cl in Exp Rheum,1995,13:339-343.
13，Spinozzi F,Agea E,Piattoni S,et al.Lack of correlation between membra ne CD30 expression and cytokine secretion pattern in allergen-primed naive cord blood T cell lines and clones.Scand J Immunol,1997,45:417-422.
收稿日期：2000-03-14, http://www.100md.com
单位：王来(武汉，同济医科大学附属同济医院风湿科 430030)；何培根(武汉，同济医科大学附属同济医院风湿科 430030)
关键词：
中华风湿病学杂志000620
系统性红斑狼疮(SLE)患者免疫系统的主要异常是依赖于T细胞的B细胞功能亢进，产生大量 的自身抗体和免疫复合物[1]，根据产生的细胞因子的不同，人CD4+T细胞(辅助 型T细胞)至少可分为三种功能亚型：Th1细胞生成白细胞介素-2(IL-2)，干扰素-γ(IFN -γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；Th2细胞生成IL-4、IL-5、IL-6和IL-10；Th0细 胞可生成两类细胞因子[2]。本文运用流式细胞仪采用三色荧光标记分析SLE患者外 周血单个核细胞(PBMC)的CD4，CD25以及CD30三种表面抗原的表达，试图通过这些表面标记 反映Th细胞的量的变化，激活状态以及活化细胞是否分泌Th2细胞因子，并探讨这些表达与S LE疾病活动性的相关性。
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1 资料与方法
1.1 临床资料：23例SLE患者男性1例，女性22例，年龄13～58岁，病例组均受治于同济医 院内科，根据ACR标准确定诊断[3]，患者均未合并炎性感染，其中10例患者已接受 激素治疗(强的松1～2 mg.kg-1.d-1，口服)，13例患者尚未接受任何治疗 。10名健康献血者作为正常对照组，男性2名，女性8名，年龄22～31岁。
1.2 标本处理：静脉采集的外周血(肝素抗凝)在4 h内进
行分析，首先经Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液(pharmacia)离心分层，取出中间层的PBMC 置于5 ml Falcon试管，每试管的100 μl细胞悬液中含大约105个细胞，采用三色免疫荧 光染色。
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1.3 细胞染色：20 μl异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗人CD30单克隆抗体，20 μl藻 红蛋白(PE)标记的小鼠抗人CD25单克隆抗体和20 μl Cy-chrom标记的小鼠抗人CD4单克隆 抗体(购自PharMingen公司)分别加入待测试管，相应标记的小鼠IgG亚型抗体作为阴性对照 。试管置于4 ℃暗处反应30 min后用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4，含1%叠氮钠和0.5%白蛋 白)清洗离心，吸去上清液后用300 μl 1%多聚甲醛固定待用。
1.4 流式细胞仪分析：运用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson)进行细胞表面抗原分 析，仪器提供前向散射光(FSC)，侧向散射光(SSC)以及不同波长的荧光(FL1，FL2，FL3)等 参数，在FSC-SSC二维点图上确定出淋巴细胞的分布，随后在FL1-FL2及FL2-FL3二维点图 上进行细胞各表面标记的分析，每份标本分析10 000个细胞。
1.5 SLEDAL评分：SLE疾病活动性运用SLEDAL标准评分[4]：中枢神经系统表现( 癫痫、精神病、器质性脑病、视觉障碍、颅神经病变、狼疮性头痛、脑血管意外)各计8分， 血管炎计8分，关节炎和肌炎各计4分，肾脏表现(管型尿、血尿、蛋白尿、脓尿)各计4分， 新发皮疹、脱发和黏膜溃疡各计2分，胸膜炎和心包炎各计2分，低补体血症和DNA结合率增 高各计2分，发热、血小板减少和白细胞减少性血症各计1分，总分105分。
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1.6 统计学处理：分别计算SLE患者组与正常对照组细胞阳性率的中间值，下25%至上25% 的区间值用以反映变化范围，运用Mann-Whitney检验进行SLE组与对照组的表面抗原比较； 运用Spearman检验进行表面抗原与疾病活动性SLEDAI评分的相关性分析，设定P<0.05 为统计学上有显著意义。
2 结 果
2.1 细胞表面抗原表达：病例组及正常对照组的血液标本在采集后及时加以染色分析以尽 可能反映细胞在体内的状况。SLE患者标本的流式细胞仪分析图谱FL1-FL3和FL2-FL3二维 点图显示单个细胞水平上淋巴细胞的三种表面抗原的表达。经统计分析SLE患者PBMC中CD4 +细胞较正常对照组显著减少(P<0.05)，二者的中间值分别为36.2%和30.6%。SLE 组的CD4+CD25+细胞的百分率中间值为8.9%，较正常组的7.0%显著增高，P<0 .05。正常组与SLE组的PBMC几乎均无CD4+CD30+细胞表达，也未见CD4-CD30+ 细胞。
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2.2 SLEDAI评分：23例SLE患者中，22例伴有肾脏病变，20例伴有关节炎和/或肌炎，20例 伴低补体血症和/或DNA结合率增高，18例有皮疹和/或脱发和/或黏膜溃疡，16例伴发热，14 例外周血中血小板减少和/或白细胞减少，13例伴有胸膜炎和/或心包炎，4例合并血管炎，4 例合并中枢神经系统病变。患者的临床疾病活动性SLEDAI评分范围为14～38分，中间值为24 分。
2.3 相关性分析：SLE患者CD4+CD25+细胞阳性率与患者SLEDAI的评分有显著的相关 性(r＝0.433 0，P<0.05)，CD4细胞阳性率与SLEDAI无显著相关性(r＝0.1 24 4，P>0.5)。
3 讨 论
SLE患者外周血中淋巴细胞亚型分布反映了机体免疫调节状态，其变化可以导致SLE的免疫异 常。本文结果证实了SLE CD4+辅助性T细胞数目减少，这是T细胞反应性自身抗体作用的 结果，免疫激活引起的细胞死亡也可能减少细胞数。CD25是IL-2受体的α链，是IL-2的低 亲和力受体，表达于活化的T细胞、B细胞和单核细胞[5]，CD4+细胞的CD25表达 显著增高反映了高水平的免疫系统激活状态；它与疾病活动性存在的显著相关性更说明了SL E的病理性质，CD4+CD25+细胞百分率可视为疾病活动性的标记之一。Wolf等[6 ]的研究报道SLE患者血清中可溶性CD25(sCD25)显著增高，并建议作为疾病进展的观察指 标。
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活化的T细胞可以表达多种表面分子，其中，CD30抗原被认为是产生Th2型细胞因子的一类分 化和/或活化T淋巴细胞的标记。CD30是TNF受体超家族中的一类细胞因子受体，表达于产生T h2型细胞因子的活化的CD4+细胞表面[7，8]，有关细胞因子的研究提示，Th2细 胞因子生成增多参与SLE的病理过程[9，10]，这些因子可以促进分泌自身抗体的B 细胞的活化和分化[11]。SLE患者血清中可溶性CD30(sCD30)较正常对照组明显增高 ，而且与SLE的活动性相关[12]，说明体内存在CD30高表达的细胞。然而本文结果 显示活化的CD4+细胞并未表达CD30，CD4-的淋巴细胞(CD8+细胞)也无CD30的表达 ，其原因可能是外周循环中表达并释放CD30的细胞局限于机体发生炎性病变的微环境中。此 外，文献[13]报道正常外周血淋巴细胞一般不表达CD30，T细胞只有经体外有丝分裂原(如 PHA，抗CD3抗体等)或适当的细胞因子(如IL-2和IL-4)刺激活化之后才表达CD30，CD30也 可能由其他非T细胞分泌。酶点法研究SLE患者PBMC，发现Th2细胞因子(IL-6和IL-10)主要 由CD14+的单核/巨噬细胞分泌[9]。
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T细胞的激活程度反映了SLE的活动性，活化T细胞生成Th1/Th2细胞因子平衡失调，与自身抗 体产生过多密切相关，参与SLE疾病发生及进展。以抑制淋巴细胞活化，调节Th1/Th2细胞因 子失衡为目的的免疫调节制剂的应用，将为治疗SLE提供新的有效手段。
参 考 文 献
1，Mills JA.Systemic lupus erythematosus.N Engl J Med,1994,330:1 871-1879.
2，Romagnani S.Lymphokine production by human T cells in disease states.Ann Rev Immunol,1994,12:227-257.
3，Tan EM,Cohen AS,Fries JF,et al.The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus.Arthritis Rheum,1982,25:1271 -1277.
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4，Bombardier C,Gladman DD,Urowitz MB,et al.Derivation of the SL EDAI:a disease activity index for lupus patients.Arthritis Rheum,1992,35:630-64 0.
5，Minami Y,Kono T,Miyazaki T,et al.The IL-2 receptor complex:i ts structure, function and target genes.Ann Rev Immunol,1993,11:245-268.
6，Wolf RE,Brelsford WG.Soluble interleukin-2 receptors in syst emic lupus erythematosus.Arthritis Rheum,1988,31:729-735.
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7，del Prete G,de Carli M,Almerigogna F,et al.Preferential expr ession of CD30 by human CD4+ T cells producing Th2-type cytokines.FASEB J,19 95,9:81-86.
8，del Prete G,de Carli M,D′Elios MM,et al.CD30-mediated signa ling promotes the development of human T helper type 2-like T cells.J Exp Med,1 995,182:1655-1661.
9，Hagiwara E,Gourley MF,Lee S,et al.Disease severity in patient s with systemic lupus erythematosus correlates with an increased ratio of interl eukin-10:interferon-γ-secreting cells in the peripheral blood.Arthritis Rheu m,1996,39:379-385.
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10，Richand PY,Alcocer VJ,Llorente L.High levels of Th2 cytokine gene exp ression in systemic lupus erythematosus.Rev Invest Clin,1995,47:267-272.
11，Kitani A,Hara M,Hirose T,et al.Heterogeneity of B cell responsiveness to interleukin 4,interleukin 6 and low molecular weight B cell growth factor in discrete stages of B cell activation in patients with systemic lupus erythemato sus.Clin Exp Immunol,1989,77:31-36.
12，Caligaris-Cappio F,Bertero MT,Converso M,et al.Circulating levels of soluble CD30:a marker of cells producing Th2-type cytokines,are increased in p atients with systemic lupus erythematosus and correlate with disease activity.Cl in Exp Rheum,1995,13:339-343.
13，Spinozzi F,Agea E,Piattoni S,et al.Lack of correlation between membra ne CD30 expression and cytokine secretion pattern in allergen-primed naive cord blood T cell lines and clones.Scand J Immunol,1997,45:417-422.
收稿日期：2000-03-14, http://www.100md.com