金属蛋白涂层支架用于小型猪冠状动脉质粒介导下转基因研究
作者：钱杰 高润霖 史瑞文 宋来凤 祁哲 李永利 魏英杰 孟亮 袁卫民 司文学 汤健
单位：
关键词：动物，转基因 支架
中国循环杂志990310 摘要 目的：评价在质粒介导下，金属蛋白涂层支架向血管内局部转基因的可行性、效率和选择性。方法：金属支架由316L不锈钢丝编织而成，其涂层是通过把支架放入有交联剂的明胶溶液中浸泡而成。基因载体为PcDNA2质粒，并携带有β-半乳糖苷酶标记基因，该基因编码核特异性β-半乳糖苷酶。首先将蛋白涂层支架分别固定在3.0 mm或3.5 mm经皮冠状动脉腔内成形术球囊上并在浓度为8 μg/μl的基因原液中浸泡3分钟，然后通过8F大腔引导导管将支架送入小型猪冠状动脉前降支中段(转基因组，n=3)，另外把没有浸泡过基因的支架也送入小型猪冠状动脉前降支中段(对照组，n=3)。在支架植入后7天处死动物。β-半乳糖苷酶表达由X-Gal染色评估。结果：所有转基因动物均有基因表达。转基因表达出现在内膜、中层和外膜。中层平滑肌细胞转染率为3.0%。远处器官和对照组冠状动脉均未显示核特异性β-半乳糖苷酶阳性表达。结论：蛋白涂层支架在质粒介导下向血管内转基因有效、可行，因此，它有可能成为冠状动脉腔内成形术后再狭窄基因治疗的有效转基因系统。
, 百拇医药
Plasmid-mediated Intracoronary Local Gene Transfer Using Protein-coated
Metallic Stent in Mini-swine
Qian Jie,Gao Runlin,Shi Ruiwen,et al.
Division of Coronary Heart Disease,Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital,CAMS and PUMC,Beijing(100037)
Abstract Objective:To assess the feasibility,efficiency and selectivity of plasmid-mediated gene transfer to local arterial wall by protein-coated metallic stent.Method:Metallic stent was made by 316L stainless wire.The coating for metallic stent was made by immersing in gelatin solution containing crosslinker.PcDNA2 plasmid carrying LacZ reporter gene for nuclear-specific β-galactosidase was used.The coated stent was mounted on a 3.5 or 3.0 mm percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA) balloon and immersed into the gene stock(8 μg/μl)for 3 min,and then implanted into the left anterior descending branch of coronary artery of mini-swine(n=3)via a 8F large lumen guiding catheter.Coated stent without gene was implanted into the same of mini-swine as control(n=3).All the animals were sacrificed 7 days after implantation.β-galactosidase expressioon was assessed by X-gal staining.Results:The expression of transgene was detected in the intima,media and adventitia of all the transgenic animals.The transfection efficiency of medial smooth muscle cells was 3.0%.No X-gal stained samples was detected in remote organs and coronary arteries of the controls.Conclusions:Plasmid-mediated arterial gene transfer to endothelial,smooth muscle cells and adventitia is feasible and efficacious by protein-coated metallic stent.The coated stent may be a good carrier for plasmid-mediated gene transfer and thus a potentially effective transgenic means for the prevention of restenosis following PTCA.
, 百拇医药
Key words Animals,Gene transfer;Stent
经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)后再狭窄是目前冠心病介入治疗最主要的一个问题，虽然支架植入术明显降低了再狭窄的发生率，但仍有15%左右的患者需要反复治疗。近年来，基因治疗成为大家关注的一个解决方法。我们实验室使用金属蛋白涂层支架转基因治疗PTCA术后再狭窄已经取得了一些进展[1～3]，但由于基因载体是腺病毒，在人类中使用目前还不可能[4]，因此，我们进一步研究了依靠这种支架并使用质粒载体向血管局部转基因的可行性及效率。
1 材料和方法
实验动物：1998年3月至10月选用6只正常小型猪，雌雄不限，实验期间动物喂饲普通谷物饲料。支架及涂层方法同以往报道[1]。
标记基因：含有β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的PcDNA2质粒由北京医科大学心血管病研究所构建(汤健教授惠赠)，我们自行扩增、提取和酶切鉴定，基因浓度为8 μg/μl。
, 百拇医药
在体血管局部转基因：将6只动物分为转基因组(n=3)和对照组(n=3)。麻醉方法同文献[1]。手术期间行气管插管和持续心电监测。在常规消毒条件下采用外科手术方法分离暴露右侧股动脉，用12号穿刺针局部穿刺股动脉，插入引导钢丝，并送入8F鞘管，经鞘管注入肝素(200 IU/kg)，同时在X线透视下将8FJR大腔引导导管插入左冠状动脉前降支开口处，并根据血管粗细选用3.0 mm或3.5 mm球囊，把支架固定在球囊上，然后在基因原液中浸泡3分钟后送入前降支中段，以1 013.25 kPa的压力(10个大气压)扩张2次，每次1分钟，术后结扎股动脉，缝合伤口，并常规肌肉注射青霉素3天，每天480万单位(不给以抗凝剂及阿司匹林)。对照组使用不沾基因支架。
动脉壁内β-半乳糖苷酶表达的评价：在转染后7天，使用上述方法麻醉动物，然后迅速取出转基因组(n=3)和对照组的冠状动脉(n=3)，并轻轻取出支架。首先，在冰浴下切开血管，使用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍，然后放在由2.0%的福尔马林加0.2%的戊二醛组成的固定液中浸泡30分钟，再用PBS冲洗3遍，37℃下放置在0.2%的X-Gal溶液中浸泡5小时，取出后再置入2.0%的福尔马林加0.2%的戊二醛组成的固定液中浸泡24小时，然后用石蜡包埋组织，进行厚度为5 μm的切片，相邻两张切片分别进行伊红复染和苏木素伊红(HE)染色，后再用梯度酒精脱水，二甲苯透明，以甘油明胶封片。在光学显微镜下观察到深蓝色细胞核(阳性颗粒)即为β-半乳糖苷酶表达阳性(图1)。每个转基因冠状动脉随机选取3张组化染色切片及3张对应苏木素伊红染色切片，通过显微微机彩色图像处理系统在对应切片上随机选取4个高倍视野(20倍)，分别计数中层平滑肌细胞数和染色阳性细胞数，从而计算出中层平滑肌细胞转染率。
, 百拇医药
远处器官β-半乳糖苷酶表达的检测：在转染7天后取转基因动物冠状动脉的同时，取出其部分心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、骨骼肌标本和邻近支架的近远端血管，同样使用上述染色方法确定其有无β-半乳糖苷酶阳性表达。
2 结果
光镜检查显示：3例转基因猪冠状动脉血管均有阳性表达，其阳性颗粒可见于内膜、中膜和外膜，但分布很不均匀(图2)，以靠近支架损伤处转染效率较高(图3)。中层平滑肌细胞转染率为3.0%。支架植入后未见内膜下损伤、出血和血管夹层。对照组和远处脏器包括心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、骨骼肌及邻近血管X-Gal染色均未显示核特异性β-半乳糖苷酶阳性表达。
3 讨论
PTCA术后再狭窄预防的研究方兴未艾，由于冠状动脉局部直接转基因实验取得了成功[5，6]，因此，基因治疗再狭窄已经成为目前研究解决此问题的一个热点。在此研究领域中，有效治疗基因、合适基因载体及高效转基因运输系统是目前需要解决的3个主要问题。
, 百拇医药
在运输系统上，国外实验研究使用的主要有以下几种：①被动转运球囊导管，如双球囊导管、水凝胶球囊导管等，它们的主要缺点是导致的缺血时间长，尽管后者已经用于外周血管的转基因治疗，但它很难用于冠状动脉；②压力辅助球囊，如带孔球囊、微孔球囊等，其主要问题是导致血管壁更多的损伤，也可导致更多的内膜增生；③机械辅助球囊，如针刺球囊，但仍然面临增加损伤的问题。
我们实验室研制了一种新型金属蛋白涂层支架，由于支架植入术目前已经广泛应用，因此，这种转基因系统可以简单、方便、安全地进行基因预防再狭窄实验研究。在已经完成的腺病毒介导下转基因预防PTCA术后再狭窄的实验研究中，这种转基因系统可以在腺病毒介导下高效表达目的基因。但考虑到腺病毒目前还无法用于人类心血管疾病的基因治疗[4]，而质粒则是一种安全的转基因载体，并已进入临床治疗领域[7，8]，所以，我们进行了此项质粒介导下金属蛋白涂层支架转基因实验研究。
本研究结果显示：中层平滑肌细胞转染率达到了3.0%，这比国外文献报道的质粒介导下球囊转基因最高转染率1.0%明显增高[9]，其可能原因是支架可以长期保存在病变部位，因此，它比球囊增加了转染时间和转染效率。上述结果表明：这种蛋白涂层支架转基因系统不仅可行，而且可以提高质粒的转基因效率。如果把它和质粒介导下的治疗基因联合使用，可能成为一种有实用价值的对再狭窄进行治疗的局部转基因运输系统。这种支架在转基因时有其特点，其转基因阳性颗粒分布有极大的不均衡性，光镜下显示：阳性颗粒主要分布在支架损伤血管周围，从内膜、中膜直到外膜，在1处损伤达到外膜的切片上，可见附近有大量阳性颗粒，但它周围组织则几乎没有。这可能和基因附着于支架上有关。而各种球囊转基因系统则不存在这种问题。基因转染的这种不均衡分布是否对基因治疗会产生影响还需要进一步的试验观察。本研究中对照组及远处器官均没有发现阳性颗粒。
, 百拇医药
综上所述，本研究表明：在质粒介导下，此蛋白涂层支架向血管内转基因有效、可行，因此，它有可能成为PTCA术后再狭窄基因治疗的有效转基因系统。(本文图1～3见封三)
图1 血管外膜处组织致密，可见散在深蓝色细胞核(阳性颗粒)即为阳性表达细胞XGal ×550
图2 血管壁的内、中、外膜均有蓝色颗粒阳性表达，以中膜部表达较多XGal 138
图3 支架与血管接触部的血管壁，支畸损伤处(↑),附近蓝色颗粒阳性表达较高XGal 275
参考文献
, 百拇医药
1 袁晋青，高润霖，史瑞文，等.金属蛋白涂层支架介导的血管内局部转基因.中国循环杂志，1997，87：330—333.
2 Gao RL,Yuan JQ,Shi RW,et al.Intracoronary prourokinase gene transfer with protein-coated stent decreased platelet deposition and smooth muscle cell proliferation in mini-swine.JACC,1998,31:5(Suppl C):257C.
3 Gao RL,Yuan JQ,Shi RW,et al.Intravascular local gene transfer mediated by protein-coated metallic stent.JACC,1998,31:5(Suppl C):203C.
, 百拇医药
4 Schulick AH,Vassalli G,Dunn PF,et al.Established immunity precludes adenovirus-mediated gene transfer in rat carotid arteries:potential for immunosuppression and vector engineering to overcome barriers of immunity.J Clin Invest,1997，99:209—219.
5 French BA,Mazue W,Ali NM,et al.Percutaneous transluminal in vivo gene transfer by recombinant adenovirus in normal porcine coronary arteries,atherosclerotic arteries,and two models of coronary restenosis.Circulation,1994,90:2402—2413.
, 百拇医药
6 Lim CS,Chapman GD,Gammon RS,et al.Direct in vivo gene transfer into coronary and peripheral vasculatures of the intact dog.Circulation,1991,83:2007—2011.
7 Isner JM,Pieczek A,Schainfeld R,et al.Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of phVEGF165 in patient with ischemic limb.Lancet,1996,348:370_374.
8 Baumgartner I,Pieczek A,Manor O,et al.Constitutive expression of phVEGF165 intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia.Circulation,1998,97:1114—1123.
9 Baek S,March KL.Gene therapy for restenosis:Getting nearer the heart of the matter.Circ Res,1998,82:295—305.
(收稿：1998-12-09 修回：1999-03-05), http://www.100md.com
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关键词：动物，转基因 支架
中国循环杂志990310 摘要 目的：评价在质粒介导下，金属蛋白涂层支架向血管内局部转基因的可行性、效率和选择性。方法：金属支架由316L不锈钢丝编织而成，其涂层是通过把支架放入有交联剂的明胶溶液中浸泡而成。基因载体为PcDNA2质粒，并携带有β-半乳糖苷酶标记基因，该基因编码核特异性β-半乳糖苷酶。首先将蛋白涂层支架分别固定在3.0 mm或3.5 mm经皮冠状动脉腔内成形术球囊上并在浓度为8 μg/μl的基因原液中浸泡3分钟，然后通过8F大腔引导导管将支架送入小型猪冠状动脉前降支中段(转基因组，n=3)，另外把没有浸泡过基因的支架也送入小型猪冠状动脉前降支中段(对照组，n=3)。在支架植入后7天处死动物。β-半乳糖苷酶表达由X-Gal染色评估。结果：所有转基因动物均有基因表达。转基因表达出现在内膜、中层和外膜。中层平滑肌细胞转染率为3.0%。远处器官和对照组冠状动脉均未显示核特异性β-半乳糖苷酶阳性表达。结论：蛋白涂层支架在质粒介导下向血管内转基因有效、可行，因此，它有可能成为冠状动脉腔内成形术后再狭窄基因治疗的有效转基因系统。
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Plasmid-mediated Intracoronary Local Gene Transfer Using Protein-coated
Metallic Stent in Mini-swine
Qian Jie,Gao Runlin,Shi Ruiwen,et al.
Division of Coronary Heart Disease,Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital,CAMS and PUMC,Beijing(100037)
Abstract Objective:To assess the feasibility,efficiency and selectivity of plasmid-mediated gene transfer to local arterial wall by protein-coated metallic stent.Method:Metallic stent was made by 316L stainless wire.The coating for metallic stent was made by immersing in gelatin solution containing crosslinker.PcDNA2 plasmid carrying LacZ reporter gene for nuclear-specific β-galactosidase was used.The coated stent was mounted on a 3.5 or 3.0 mm percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA) balloon and immersed into the gene stock(8 μg/μl)for 3 min,and then implanted into the left anterior descending branch of coronary artery of mini-swine(n=3)via a 8F large lumen guiding catheter.Coated stent without gene was implanted into the same of mini-swine as control(n=3).All the animals were sacrificed 7 days after implantation.β-galactosidase expressioon was assessed by X-gal staining.Results:The expression of transgene was detected in the intima,media and adventitia of all the transgenic animals.The transfection efficiency of medial smooth muscle cells was 3.0%.No X-gal stained samples was detected in remote organs and coronary arteries of the controls.Conclusions:Plasmid-mediated arterial gene transfer to endothelial,smooth muscle cells and adventitia is feasible and efficacious by protein-coated metallic stent.The coated stent may be a good carrier for plasmid-mediated gene transfer and thus a potentially effective transgenic means for the prevention of restenosis following PTCA.
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Key words Animals,Gene transfer;Stent
经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)后再狭窄是目前冠心病介入治疗最主要的一个问题，虽然支架植入术明显降低了再狭窄的发生率，但仍有15%左右的患者需要反复治疗。近年来，基因治疗成为大家关注的一个解决方法。我们实验室使用金属蛋白涂层支架转基因治疗PTCA术后再狭窄已经取得了一些进展[1～3]，但由于基因载体是腺病毒，在人类中使用目前还不可能[4]，因此，我们进一步研究了依靠这种支架并使用质粒载体向血管局部转基因的可行性及效率。
1 材料和方法
实验动物：1998年3月至10月选用6只正常小型猪，雌雄不限，实验期间动物喂饲普通谷物饲料。支架及涂层方法同以往报道[1]。
标记基因：含有β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的PcDNA2质粒由北京医科大学心血管病研究所构建(汤健教授惠赠)，我们自行扩增、提取和酶切鉴定，基因浓度为8 μg/μl。
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在体血管局部转基因：将6只动物分为转基因组(n=3)和对照组(n=3)。麻醉方法同文献[1]。手术期间行气管插管和持续心电监测。在常规消毒条件下采用外科手术方法分离暴露右侧股动脉，用12号穿刺针局部穿刺股动脉，插入引导钢丝，并送入8F鞘管，经鞘管注入肝素(200 IU/kg)，同时在X线透视下将8FJR大腔引导导管插入左冠状动脉前降支开口处，并根据血管粗细选用3.0 mm或3.5 mm球囊，把支架固定在球囊上，然后在基因原液中浸泡3分钟后送入前降支中段，以1 013.25 kPa的压力(10个大气压)扩张2次，每次1分钟，术后结扎股动脉，缝合伤口，并常规肌肉注射青霉素3天，每天480万单位(不给以抗凝剂及阿司匹林)。对照组使用不沾基因支架。
动脉壁内β-半乳糖苷酶表达的评价：在转染后7天，使用上述方法麻醉动物，然后迅速取出转基因组(n=3)和对照组的冠状动脉(n=3)，并轻轻取出支架。首先，在冰浴下切开血管，使用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍，然后放在由2.0%的福尔马林加0.2%的戊二醛组成的固定液中浸泡30分钟，再用PBS冲洗3遍，37℃下放置在0.2%的X-Gal溶液中浸泡5小时，取出后再置入2.0%的福尔马林加0.2%的戊二醛组成的固定液中浸泡24小时，然后用石蜡包埋组织，进行厚度为5 μm的切片，相邻两张切片分别进行伊红复染和苏木素伊红(HE)染色，后再用梯度酒精脱水，二甲苯透明，以甘油明胶封片。在光学显微镜下观察到深蓝色细胞核(阳性颗粒)即为β-半乳糖苷酶表达阳性(图1)。每个转基因冠状动脉随机选取3张组化染色切片及3张对应苏木素伊红染色切片，通过显微微机彩色图像处理系统在对应切片上随机选取4个高倍视野(20倍)，分别计数中层平滑肌细胞数和染色阳性细胞数，从而计算出中层平滑肌细胞转染率。
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远处器官β-半乳糖苷酶表达的检测：在转染7天后取转基因动物冠状动脉的同时，取出其部分心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、骨骼肌标本和邻近支架的近远端血管，同样使用上述染色方法确定其有无β-半乳糖苷酶阳性表达。
2 结果
光镜检查显示：3例转基因猪冠状动脉血管均有阳性表达，其阳性颗粒可见于内膜、中膜和外膜，但分布很不均匀(图2)，以靠近支架损伤处转染效率较高(图3)。中层平滑肌细胞转染率为3.0%。支架植入后未见内膜下损伤、出血和血管夹层。对照组和远处脏器包括心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、骨骼肌及邻近血管X-Gal染色均未显示核特异性β-半乳糖苷酶阳性表达。
3 讨论
PTCA术后再狭窄预防的研究方兴未艾，由于冠状动脉局部直接转基因实验取得了成功[5，6]，因此，基因治疗再狭窄已经成为目前研究解决此问题的一个热点。在此研究领域中，有效治疗基因、合适基因载体及高效转基因运输系统是目前需要解决的3个主要问题。
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在运输系统上，国外实验研究使用的主要有以下几种：①被动转运球囊导管，如双球囊导管、水凝胶球囊导管等，它们的主要缺点是导致的缺血时间长，尽管后者已经用于外周血管的转基因治疗，但它很难用于冠状动脉；②压力辅助球囊，如带孔球囊、微孔球囊等，其主要问题是导致血管壁更多的损伤，也可导致更多的内膜增生；③机械辅助球囊，如针刺球囊，但仍然面临增加损伤的问题。
我们实验室研制了一种新型金属蛋白涂层支架，由于支架植入术目前已经广泛应用，因此，这种转基因系统可以简单、方便、安全地进行基因预防再狭窄实验研究。在已经完成的腺病毒介导下转基因预防PTCA术后再狭窄的实验研究中，这种转基因系统可以在腺病毒介导下高效表达目的基因。但考虑到腺病毒目前还无法用于人类心血管疾病的基因治疗[4]，而质粒则是一种安全的转基因载体，并已进入临床治疗领域[7，8]，所以，我们进行了此项质粒介导下金属蛋白涂层支架转基因实验研究。
本研究结果显示：中层平滑肌细胞转染率达到了3.0%，这比国外文献报道的质粒介导下球囊转基因最高转染率1.0%明显增高[9]，其可能原因是支架可以长期保存在病变部位，因此，它比球囊增加了转染时间和转染效率。上述结果表明：这种蛋白涂层支架转基因系统不仅可行，而且可以提高质粒的转基因效率。如果把它和质粒介导下的治疗基因联合使用，可能成为一种有实用价值的对再狭窄进行治疗的局部转基因运输系统。这种支架在转基因时有其特点，其转基因阳性颗粒分布有极大的不均衡性，光镜下显示：阳性颗粒主要分布在支架损伤血管周围，从内膜、中膜直到外膜，在1处损伤达到外膜的切片上，可见附近有大量阳性颗粒，但它周围组织则几乎没有。这可能和基因附着于支架上有关。而各种球囊转基因系统则不存在这种问题。基因转染的这种不均衡分布是否对基因治疗会产生影响还需要进一步的试验观察。本研究中对照组及远处器官均没有发现阳性颗粒。
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综上所述，本研究表明：在质粒介导下，此蛋白涂层支架向血管内转基因有效、可行，因此，它有可能成为PTCA术后再狭窄基因治疗的有效转基因系统。(本文图1～3见封三)
图1 血管外膜处组织致密，可见散在深蓝色细胞核(阳性颗粒)即为阳性表达细胞XGal ×550
图2 血管壁的内、中、外膜均有蓝色颗粒阳性表达，以中膜部表达较多XGal 138
图3 支架与血管接触部的血管壁，支畸损伤处(↑),附近蓝色颗粒阳性表达较高XGal 275
参考文献
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1 袁晋青，高润霖，史瑞文，等.金属蛋白涂层支架介导的血管内局部转基因.中国循环杂志，1997，87：330—333.
2 Gao RL,Yuan JQ,Shi RW,et al.Intracoronary prourokinase gene transfer with protein-coated stent decreased platelet deposition and smooth muscle cell proliferation in mini-swine.JACC,1998,31:5(Suppl C):257C.
3 Gao RL,Yuan JQ,Shi RW,et al.Intravascular local gene transfer mediated by protein-coated metallic stent.JACC,1998,31:5(Suppl C):203C.
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4 Schulick AH,Vassalli G,Dunn PF,et al.Established immunity precludes adenovirus-mediated gene transfer in rat carotid arteries:potential for immunosuppression and vector engineering to overcome barriers of immunity.J Clin Invest,1997，99:209—219.
5 French BA,Mazue W,Ali NM,et al.Percutaneous transluminal in vivo gene transfer by recombinant adenovirus in normal porcine coronary arteries,atherosclerotic arteries,and two models of coronary restenosis.Circulation,1994,90:2402—2413.
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6 Lim CS,Chapman GD,Gammon RS,et al.Direct in vivo gene transfer into coronary and peripheral vasculatures of the intact dog.Circulation,1991,83:2007—2011.
7 Isner JM,Pieczek A,Schainfeld R,et al.Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of phVEGF165 in patient with ischemic limb.Lancet,1996,348:370_374.
8 Baumgartner I,Pieczek A,Manor O,et al.Constitutive expression of phVEGF165 intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia.Circulation,1998,97:1114—1123.
9 Baek S,March KL.Gene therapy for restenosis:Getting nearer the heart of the matter.Circ Res,1998,82:295—305.
(收稿：1998-12-09 修回：1999-03-05), http://www.100md.com