大剂量甲基强的松龙对大鼠脊髓损伤后脊髓细胞凋亡的影响
作者：张强 廖维宏 伍亚民 李应玉
单位：张强(第三军医大学大坪医院野战外科研究所第三研究室，重庆市，400042)；廖维宏(第三军医大学大坪医院野战外科研究所第三研究室，重庆市，400042)；伍亚民(第三军医大学大坪医院野战外科研究所第三研究室，重庆市，400042)；李应玉(第三军医大学大坪医院野战外科研究所第三研究室，重庆市，400042)
关键词：脊髓损伤；凋亡；甲基强的松龙
中国康复医学杂志000409 摘要 目的：探讨大鼠脊髓损伤后应用大剂量甲基强的松龙对脊髓损伤区细胞凋亡的影响。方法：将大鼠分为脊髓损伤后应用大剂量甲基强的松龙治疗组 (A组)、 单纯脊髓损伤组(B组)，损伤后1、3、7、14、28天对脊髓损伤区进行细胞凋亡的检测(TUNEL)以及Bcl-2蛋白免疫反应表达的测定(免疫组化法)，采用计算机图像分析技术进行定量分析。结果：A、B两组中均发现凋亡细胞及BCL-2蛋白阳性表达，B组细胞凋亡率大于A组，A组Bcl-2蛋白阳性细胞计数大于B组。结论：大剂量甲基强的松龙能抑制脊髓损伤后脊髓损伤区的细胞凋亡。
, http://www.100md.com
Effects of high dose methylprednisolone on apoptosis after spinal cord injury
ZHANG Qiang,LIAO Weihong,WU Yamin,et al.
(Chinese Journal of Rehabilitation Medicine)
Abstract Objective:To investigate the effect of high dose methylprednisolone(MP) on apoptosis after spinal cord injury (SCI).Method:Experimental rats were divided into two groups:Allen′s weight drop spinal cord injury and high dose methylprednisolone group (group A),Allen′s weight drop injury group (group B).After operation the rats were killed on 1, 3, 7, 14,and 28 days.The apoptosis of spinal slice from the injured spinal cord were examined by the methods of the terminal deoxynucleotidal transferase-mediated DUTP-biotin nick end labeling(TUNEL) reaction and the expression of Bcl-2 was measured by immunohistochemistry.The positive cells were quantitatively analized by computer image analysis system.Result:The rate of apoptosis sequence and the strong expression sequence of Bcl-2 protein expression were found in two categories,they were B>A(P<0.005),A>B(P<0.05) respectively.Conclusion:It indicated that the high dose methylprednisolone could inhibit apoptosis after SCI.
, 百拇医药
Key words Spinal cord injury;Apoptosis;Methylprednisolone
程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD) 亦称凋亡(apoptosis)是一种自然的生理过程。在维持细胞和脊髓发育以及排除不必要的细胞过程中起关键作用。近年的研究表明这种凋亡也可发生在脑脊髓损伤后〔1～3〕。我们应用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUDP标记法(terminal deoxynucleotidal transferase-mediated DUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)，观察成年大鼠脊髓损伤后应用大剂量甲基强的松龙(methylprednisolone,MP)对损伤脊髓细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 动物分组
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Wistar大鼠60只，体重180～250g，雌雄不拘。每个时相点每组6只。随机分为脊髓损伤后早期应用大剂量MP治疗组(A组)和单纯脊髓损伤组(B组)。
1.2 脊髓损伤模型制作
戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射麻醉，腰背部脱毛，无菌条件下暴露脊髓腰膨大；应用改良的Allen打击法致伤脊髓(10g×2.5cm)。然后A组大鼠尾静脉内静滴大剂量MP(30mg/kg)24h，B组静脉内静滴等量的生理盐水。
1.3 凋亡细胞的检测
术后第1天、3天、7天、14天、28天实验动物经麻醉后，用生理盐水、4%多聚甲醛做心脏灌注固定。取脊髓全长，对SCI区及上下端1cm的脊髓组织切片进行细胞凋亡的检测。
1.3.1 TUNEL荧光原位末端标记法：参照Boehringer Mannheim公司相关说明书操作，镜下观察阳性标记的细胞数。我们应用凋亡细胞核数估计凋亡细胞，根据公式：凋亡指数(AI)=凋亡细胞核数/总细胞核数计算。
, 百拇医药
1.3.2 Bcl-2检测 Bcl-2单克隆抗体(SANTA CRUZ公司产品)参照SP试剂盒说明书进行操作,镜下观察阳性细胞的标记数。随机计数9张切片(损伤段、损伤上段、损伤下段各3张)，切片经计算机图像分析系统处理，分别测出每张切片平均每平方毫米阳性细胞数。
1.4 统计学分析
应用Tiger计算机图像分析系统计算Bcl-2免疫染色阳性数和凋亡指数(AI)，采用t检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 TUNEL阳性细胞计数
见表1。研究发现TUNEL染色阳性细胞可见于灰质和白质，应用大剂量MP后1天，大鼠脊髓损伤后灰质和白质中的星形胶质细胞，少突胶质细胞，小神经胶质细胞和神经元在脊髓损伤后都参与了PCD，即这些细胞都发生了凋亡。A组高峰发生在损伤后1天，凋亡AI指数明显降低，以后又逐渐降低。B组TUNEL染色细胞24小时逐渐增多，AI较高，3天达到最大值。TUNEL染色可见于三个节段脊髓(损伤段、损伤上段、损伤下段)，损伤后14天仍然可以见到TUNEL染色阳性细胞。MP治疗组和非MP治疗组TUNEL阳性染色细胞数明显不同(图1、2)。
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表1 大鼠脊髓损伤后凋亡细胞指数(
±s)(n=6) 损伤后时间(d)
A组
B组
1
11.50±7.12
28.45±4.81
3
12.43±5.16①
36.27±6.28
7
, http://www.100md.com 8.52±3.46②
20.96±4.12
14
7.60±2.50
9.65±3.56
28
1.50±0.49
3.80±1.42
注:A组与B组比较①P<0.01，②P<0.05
2.2 Bcl-2阳性细胞计数
见表2。Bcl-2染色阳性细胞也可见于灰质和白质。损伤后脊髓组织中在伤后1天即开始较高表达Bcl-2蛋白，B组Bcl-2高峰发生在损伤后3天，B组14天达到高峰，此时Bcl-2蛋白不仅在神经元中有表达，更多的是在胶质细胞中大量表达。Bcl-2蛋白在此状态下，一直维持到伤后14天之后开始下降，伤后28天只有少量神经元表达。MP治疗组明显高于非MP治疗组(图3、4)。表2 大鼠脊髓损伤后Bcl-2阳性细胞数(±s)(/mm2)(n=6) 损伤后时间(d)
, http://www.100md.com
A组
B组
1
22.58±5.84
18.56±2.15
3
37.68±5.83①
21.48±7.83
7
40.50±8.68①
9.13±3.47
14
, 百拇医药
26.36±6.85②
8.87±2.74
28
12.49±2.84
7.26±3.08
注:A组与B组比较①P<0.05，②P<0.01
图1 A组损伤后3天TUNEL免疫荧光，脊髓灰质前角凋亡的细胞核(×400)
图2 B组后损伤3天TUNEL免疫荧光，脊髓灰质前角凋亡的细胞核(×400)
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图3 A组损伤后3天，脊髓灰质前角Bcl-2
免疫反应阳性细胞(×200)
图4 B组损伤后3天，脊髓灰质前角
Bcl-2免疫反应阳性细胞(×200)
图5 大鼠脊髓损伤后3天电子显微镜检查见
神经元细胞核固缩，出现凋亡小体(×1000)
3 讨论
近年来细胞凋亡的概念也引入脊髓损伤。随着分子生物学研究的发展，人们认识到细胞凋亡受细胞内外因素的调节。在神经系统的发育过程中，凋亡起重要作用。神经系统在发育开始时往往产生过量的神经元，而靶组织仅提供有限量的神经营养因子，许多神经元由于缺乏神经营养因子而发生凋亡。目前大量研究表明，不仅在发育过程中在神经系统损伤及神经系统退行性疾病的过程中也可见凋亡的发生。死亡的神经元出现凋亡小体，核固缩，DNA降解〔1、3〕。Bcl-2是一种胞浆蛋白，在中枢神经系统发育过程中Bcl-2蛋白表达水平较高，随着神经系统的逐渐完善其表达水平逐渐降低，当神经系统发育成熟后其蛋白表达维持在较低水平。实验证明Bcl-2能有效地抑制氧自由基的产生及脂质过氧化过程。通过转基因等手段使实验动物过度表达Bcl-2可以减轻神经损伤，并能有效地阻止细胞凋亡。因此，它在神经损伤中的保护作用正越来越受到重视。研究表明Bcl-2是可诱导基因，神经组织损伤后，通过一定形式的诱导作用可以增加它在神经损伤中的表达而提高组织对抗损伤的能力〔4～6〕。
, http://www.100md.com
激素类制剂在本世纪60年代起开始在临床应用于脊髓损伤的治疗，当时主要的理论基础是激素能减轻脊髓损伤后的继发水肿。但近年来经过各国学者的深入研究，认为MP具有多方面的神经保护作用，包括改善微循环、抑制脂质过氧化、减少细胞钙内流、维持神经元兴奋性等〔7～9〕 。我们的研究表明，早期应用大剂量MP后，大鼠脊髓灰质和白质中的星形胶质细胞、少突胶质细胞、小神经胶质细胞和神经元都出现了PCD，即这些细胞都发生了凋亡。单纯损伤组凋亡发生早，AI较高，应用大剂量甲基强的松龙组AI一直处于较低水平，脊髓组织在伤后1天既开始较高表达Bcl-2蛋白，单纯损伤组Bcl-2的表达较低，应用大剂量甲基强的松龙后一直维持在较高水平，到伤后14天后才开始下降，伤后28天两组都只有少量神经元表达Bcl-2。因此，我们推测大鼠脊髓损伤后早期应用大剂量甲基强的松龙不仅可以减轻脊髓水肿改善局部内环境，而且能够阻止或减轻脊髓细胞凋亡。
参考文献
1，Nakashima K, Yamashita K, Uesugi SJ, et al. Temporal and spatial profile of apoptotic cell death in transient intracerebral mass lesion of the rat. J Neurotrauma, 1999,16(2):143-151.
, 百拇医药
2，Kaya SS, Mahmood A, Li Y, et al. Apoptosis and expression of p53 response proteins and cyclin D1 after cortical impact in rat brain. Brain Research, 1999, 818:23-33.
3，Yong C, Arnold PM, Zoubine MN,et al. Apoptosis in cellular compartments of rat spinal cord after severe contusion injury. J Neurotrauma, 1998, 15(7):459-472.
4，Kane DJ, Sarafian TA, Anton K, et al. Bcl-2 inhibition of neural death: Decreased generation of reactive oxygen species. Science, 1993, 262:1274-1277.
, 百拇医药
5，Lou J, Lenke LG, Obrien M. In vivo Bcl-2 onlogene neuronal expression in the rat spinal cord. Spine,1998,23(5)2517-2523.
6，Clark RS,Chen J, Wahtms SC,et al. Apoptosis-suppressor gene Bcl-2 expression after traumatic brain injury in rat. J Neurosci,1997, 17(23): 9172-9182.
7，Madsen JR, MacDonald P, Irwin N, et al. Tacrolimus (FK506) increases neuronal expression of GAP-43 and improves functional recovery after spinal cord injury in rats.Exp Neurol, 1998, 154:673-683.
8，Gabler C. Clinical experiences and result of high dosage methylprednisolone therapy in spinal cord trauma. Spine , 1995,20(1):20.
9，Gerndt SJ, Rodriguez JL, Pawli JW, et al. Consequences of high-dose steroid therapy for acute spinal cord injury. J Trauma , 1997,42:2279-2284.
收稿日期：2000-01-16, 百拇医药
单位：张强(第三军医大学大坪医院野战外科研究所第三研究室，重庆市，400042)；廖维宏(第三军医大学大坪医院野战外科研究所第三研究室，重庆市，400042)；伍亚民(第三军医大学大坪医院野战外科研究所第三研究室，重庆市，400042)；李应玉(第三军医大学大坪医院野战外科研究所第三研究室，重庆市，400042)
关键词：脊髓损伤；凋亡；甲基强的松龙
中国康复医学杂志000409 摘要 目的：探讨大鼠脊髓损伤后应用大剂量甲基强的松龙对脊髓损伤区细胞凋亡的影响。方法：将大鼠分为脊髓损伤后应用大剂量甲基强的松龙治疗组 (A组)、 单纯脊髓损伤组(B组)，损伤后1、3、7、14、28天对脊髓损伤区进行细胞凋亡的检测(TUNEL)以及Bcl-2蛋白免疫反应表达的测定(免疫组化法)，采用计算机图像分析技术进行定量分析。结果：A、B两组中均发现凋亡细胞及BCL-2蛋白阳性表达，B组细胞凋亡率大于A组，A组Bcl-2蛋白阳性细胞计数大于B组。结论：大剂量甲基强的松龙能抑制脊髓损伤后脊髓损伤区的细胞凋亡。
, http://www.100md.com
Effects of high dose methylprednisolone on apoptosis after spinal cord injury
ZHANG Qiang,LIAO Weihong,WU Yamin,et al.
(Chinese Journal of Rehabilitation Medicine)
Abstract Objective:To investigate the effect of high dose methylprednisolone(MP) on apoptosis after spinal cord injury (SCI).Method:Experimental rats were divided into two groups:Allen′s weight drop spinal cord injury and high dose methylprednisolone group (group A),Allen′s weight drop injury group (group B).After operation the rats were killed on 1, 3, 7, 14,and 28 days.The apoptosis of spinal slice from the injured spinal cord were examined by the methods of the terminal deoxynucleotidal transferase-mediated DUTP-biotin nick end labeling(TUNEL) reaction and the expression of Bcl-2 was measured by immunohistochemistry.The positive cells were quantitatively analized by computer image analysis system.Result:The rate of apoptosis sequence and the strong expression sequence of Bcl-2 protein expression were found in two categories,they were B>A(P<0.005),A>B(P<0.05) respectively.Conclusion:It indicated that the high dose methylprednisolone could inhibit apoptosis after SCI.
, 百拇医药
Key words Spinal cord injury;Apoptosis;Methylprednisolone
程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD) 亦称凋亡(apoptosis)是一种自然的生理过程。在维持细胞和脊髓发育以及排除不必要的细胞过程中起关键作用。近年的研究表明这种凋亡也可发生在脑脊髓损伤后〔1～3〕。我们应用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUDP标记法(terminal deoxynucleotidal transferase-mediated DUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)，观察成年大鼠脊髓损伤后应用大剂量甲基强的松龙(methylprednisolone,MP)对损伤脊髓细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 动物分组
, http://www.100md.com
Wistar大鼠60只，体重180～250g，雌雄不拘。每个时相点每组6只。随机分为脊髓损伤后早期应用大剂量MP治疗组(A组)和单纯脊髓损伤组(B组)。
1.2 脊髓损伤模型制作
戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射麻醉，腰背部脱毛，无菌条件下暴露脊髓腰膨大；应用改良的Allen打击法致伤脊髓(10g×2.5cm)。然后A组大鼠尾静脉内静滴大剂量MP(30mg/kg)24h，B组静脉内静滴等量的生理盐水。
1.3 凋亡细胞的检测
术后第1天、3天、7天、14天、28天实验动物经麻醉后，用生理盐水、4%多聚甲醛做心脏灌注固定。取脊髓全长，对SCI区及上下端1cm的脊髓组织切片进行细胞凋亡的检测。
1.3.1 TUNEL荧光原位末端标记法：参照Boehringer Mannheim公司相关说明书操作，镜下观察阳性标记的细胞数。我们应用凋亡细胞核数估计凋亡细胞，根据公式：凋亡指数(AI)=凋亡细胞核数/总细胞核数计算。
, 百拇医药
1.3.2 Bcl-2检测 Bcl-2单克隆抗体(SANTA CRUZ公司产品)参照SP试剂盒说明书进行操作,镜下观察阳性细胞的标记数。随机计数9张切片(损伤段、损伤上段、损伤下段各3张)，切片经计算机图像分析系统处理，分别测出每张切片平均每平方毫米阳性细胞数。
1.4 统计学分析
应用Tiger计算机图像分析系统计算Bcl-2免疫染色阳性数和凋亡指数(AI)，采用t检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 TUNEL阳性细胞计数
见表1。研究发现TUNEL染色阳性细胞可见于灰质和白质，应用大剂量MP后1天，大鼠脊髓损伤后灰质和白质中的星形胶质细胞，少突胶质细胞，小神经胶质细胞和神经元在脊髓损伤后都参与了PCD，即这些细胞都发生了凋亡。A组高峰发生在损伤后1天，凋亡AI指数明显降低，以后又逐渐降低。B组TUNEL染色细胞24小时逐渐增多，AI较高，3天达到最大值。TUNEL染色可见于三个节段脊髓(损伤段、损伤上段、损伤下段)，损伤后14天仍然可以见到TUNEL染色阳性细胞。MP治疗组和非MP治疗组TUNEL阳性染色细胞数明显不同(图1、2)。
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表1 大鼠脊髓损伤后凋亡细胞指数(
±s)(n=6) 损伤后时间(d)A组
B组
1
11.50±7.12
28.45±4.81
3
12.43±5.16①
36.27±6.28
7
, http://www.100md.com 8.52±3.46②
20.96±4.12
14
7.60±2.50
9.65±3.56
28
1.50±0.49
3.80±1.42
注:A组与B组比较①P<0.01，②P<0.05
2.2 Bcl-2阳性细胞计数
见表2。Bcl-2染色阳性细胞也可见于灰质和白质。损伤后脊髓组织中在伤后1天即开始较高表达Bcl-2蛋白，B组Bcl-2高峰发生在损伤后3天，B组14天达到高峰，此时Bcl-2蛋白不仅在神经元中有表达，更多的是在胶质细胞中大量表达。Bcl-2蛋白在此状态下，一直维持到伤后14天之后开始下降，伤后28天只有少量神经元表达。MP治疗组明显高于非MP治疗组(图3、4)。表2 大鼠脊髓损伤后Bcl-2阳性细胞数(
±s)(/mm2)(n=6) 损伤后时间(d), http://www.100md.com
A组
B组
1
22.58±5.84
18.56±2.15
3
37.68±5.83①
21.48±7.83
7
40.50±8.68①
9.13±3.47
14
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26.36±6.85②
8.87±2.74
28
12.49±2.84
7.26±3.08
注:A组与B组比较①P<0.05，②P<0.01
图1 A组损伤后3天TUNEL免疫荧光，脊髓灰质前角凋亡的细胞核(×400)
图2 B组后损伤3天TUNEL免疫荧光，脊髓灰质前角凋亡的细胞核(×400)
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图3 A组损伤后3天，脊髓灰质前角Bcl-2
免疫反应阳性细胞(×200)
图4 B组损伤后3天，脊髓灰质前角
Bcl-2免疫反应阳性细胞(×200)
图5 大鼠脊髓损伤后3天电子显微镜检查见
神经元细胞核固缩，出现凋亡小体(×1000)
3 讨论
近年来细胞凋亡的概念也引入脊髓损伤。随着分子生物学研究的发展，人们认识到细胞凋亡受细胞内外因素的调节。在神经系统的发育过程中，凋亡起重要作用。神经系统在发育开始时往往产生过量的神经元，而靶组织仅提供有限量的神经营养因子，许多神经元由于缺乏神经营养因子而发生凋亡。目前大量研究表明，不仅在发育过程中在神经系统损伤及神经系统退行性疾病的过程中也可见凋亡的发生。死亡的神经元出现凋亡小体，核固缩，DNA降解〔1、3〕。Bcl-2是一种胞浆蛋白，在中枢神经系统发育过程中Bcl-2蛋白表达水平较高，随着神经系统的逐渐完善其表达水平逐渐降低，当神经系统发育成熟后其蛋白表达维持在较低水平。实验证明Bcl-2能有效地抑制氧自由基的产生及脂质过氧化过程。通过转基因等手段使实验动物过度表达Bcl-2可以减轻神经损伤，并能有效地阻止细胞凋亡。因此，它在神经损伤中的保护作用正越来越受到重视。研究表明Bcl-2是可诱导基因，神经组织损伤后，通过一定形式的诱导作用可以增加它在神经损伤中的表达而提高组织对抗损伤的能力〔4～6〕。
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激素类制剂在本世纪60年代起开始在临床应用于脊髓损伤的治疗，当时主要的理论基础是激素能减轻脊髓损伤后的继发水肿。但近年来经过各国学者的深入研究，认为MP具有多方面的神经保护作用，包括改善微循环、抑制脂质过氧化、减少细胞钙内流、维持神经元兴奋性等〔7～9〕 。我们的研究表明，早期应用大剂量MP后，大鼠脊髓灰质和白质中的星形胶质细胞、少突胶质细胞、小神经胶质细胞和神经元都出现了PCD，即这些细胞都发生了凋亡。单纯损伤组凋亡发生早，AI较高，应用大剂量甲基强的松龙组AI一直处于较低水平，脊髓组织在伤后1天既开始较高表达Bcl-2蛋白，单纯损伤组Bcl-2的表达较低，应用大剂量甲基强的松龙后一直维持在较高水平，到伤后14天后才开始下降，伤后28天两组都只有少量神经元表达Bcl-2。因此，我们推测大鼠脊髓损伤后早期应用大剂量甲基强的松龙不仅可以减轻脊髓水肿改善局部内环境，而且能够阻止或减轻脊髓细胞凋亡。
参考文献
1，Nakashima K, Yamashita K, Uesugi SJ, et al. Temporal and spatial profile of apoptotic cell death in transient intracerebral mass lesion of the rat. J Neurotrauma, 1999,16(2):143-151.
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2，Kaya SS, Mahmood A, Li Y, et al. Apoptosis and expression of p53 response proteins and cyclin D1 after cortical impact in rat brain. Brain Research, 1999, 818:23-33.
3，Yong C, Arnold PM, Zoubine MN,et al. Apoptosis in cellular compartments of rat spinal cord after severe contusion injury. J Neurotrauma, 1998, 15(7):459-472.
4，Kane DJ, Sarafian TA, Anton K, et al. Bcl-2 inhibition of neural death: Decreased generation of reactive oxygen species. Science, 1993, 262:1274-1277.
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5，Lou J, Lenke LG, Obrien M. In vivo Bcl-2 onlogene neuronal expression in the rat spinal cord. Spine,1998,23(5)2517-2523.
6，Clark RS,Chen J, Wahtms SC,et al. Apoptosis-suppressor gene Bcl-2 expression after traumatic brain injury in rat. J Neurosci,1997, 17(23): 9172-9182.
7，Madsen JR, MacDonald P, Irwin N, et al. Tacrolimus (FK506) increases neuronal expression of GAP-43 and improves functional recovery after spinal cord injury in rats.Exp Neurol, 1998, 154:673-683.
8，Gabler C. Clinical experiences and result of high dosage methylprednisolone therapy in spinal cord trauma. Spine , 1995,20(1):20.
9，Gerndt SJ, Rodriguez JL, Pawli JW, et al. Consequences of high-dose steroid therapy for acute spinal cord injury. J Trauma , 1997,42:2279-2284.
收稿日期：2000-01-16, 百拇医药