骨髓基质细胞的造血支持作用等生物学特性的研究
作者：杨吉成 盛伟华 李丽娥 董宁征 王红卫 郭瑃 王晓东 杨宗华
单位：杨吉成 盛伟华 李丽娥 董宁征 王红卫(苏州医学院基因工程研究室苏州 215007)；郭瑃(苏州医学院人体解剖学教研室)；王晓东(苏州医学院附儿院骨科)；杨宗华(常熟市第一人民医院)
关键词：人骨髓基质细胞；长期培养起始细胞；成纤维细胞；造血支持功能
中国血液变学杂志000206 摘 要 采用静置贴壁细胞培养法，体外长期培养了胎儿、儿童、成人骨髓基质细胞，时间为6个月，可传至10代，并观察了成纤维肌样细胞、内皮细胞和巨噬细胞；通过免疫细胞化学染色法，证明了1～3代的骨髓基质肌样细胞Viementin为阳性，第Ⅷ因子阴性；采用流式细胞仪检测法，证明了儿童骨髓基质细胞的细胞表型为CD-33、CD-34、CD-38、CD+W90,成人骨髓基质细胞为CD-33、CD-34、CD+38、CD+W90。
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采用体外培养和扩增的脐血造血干细胞的半固体集落形成法，证明了基质细胞能长期维持脐血中的LTC-IC的生存，若加入IL-6、IL-3、SCF细胞因子的扩增体系，基质细胞对长期维持和扩增LTC-IC的效果更为明显(P<0.01)，比无基质细胞的对照组所形成的LTC-IC产率高于2～4倍。表明骨髓基质细胞具有支持造血功能。
中图分类号 R239.2+8
THE STUDY ON BIOLOGIC CHARACTERISTICS OF HUMAN BONE MARROW
STROMAL CELLS INCLUDING THE HEMATOPOIESIS SUPPORTED FUNCTION
Yang Ji-cheng Sheng Wei-Hua Li Li-e
, 百拇医药
(Gene engineering research unit of Suzhou Medecal college, 215007)
Abstract Fetal, child, adult bone marrow stomal cells were cultured for six months in vitro by static adherent assay, and propagated up to 10 times, The myoid fibroblast, endothelial and macrophagic cells were observed. The result of immunocyte chemisty intricated the myoid cells propagated 1 to 3 times were positive for viementin and negtive for Ⅷ factor. The result of phenotype analysis by FACS suggested the child bone marrow stromal cells were CD-33、CD-34、CD-38、CD+W90，and adult cells were CD-33、CD-34、CD+38、CD+W90。
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The CFC assay was used to test the hematopoietic in cord bleed after culture and expansion in vitro, the result demonstrated the long-term supportive effect of stromal cells on the survival of LTC-ICs in cord blood. The expansion of LTC-ICs in the stromal-supported system containing SCF, IL-3,IL-6 was more remarkable than that in nonstroma system (P<0.01). The frequency of LTC-ICs of the stromal-supported system was 2 to 4 times higher than that of nonstroma system. The results above suggested that the bone marrow stromal cells have bone marrow hematopoiesis-supported function.
, 百拇医药
Keywords Human bone marrow stromal cells Long-term cultrue-initiating cells (LTC-ICs) Fibroblast Hematopoiesis-supported function
人骨髓基质细胞包括成纤维细胞，内皮细胞，脂肪细胞和巨噬细胞。在体内可提供造血微环境[1，2]，已成为造血干细胞生长、分化和自我更新的重要场所，这可能与基质细胞能合成和分泌多种调控因子(细胞因子和粘附分子)和基质(胶原和酶等)有关[3，4]。
国内外近期对人骨髓基质细胞的造血调控的研究已取得了可喜的进展，并探讨了造血基质干细胞对维持造血微环境的作用，为此我们近期对来源于胎儿、儿童和成人骨髓基质细胞进行了体外长期培养，并开展了有关细胞分化表型、造血支持作用等生物学特性的实验研究，现分别报告如下：
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1 材料
1.1 人骨髓基质细胞的组织来源
胎儿骨髓取自于孕早期5～6个月的人工流产的正常胎儿骨髓共3例(由本市第二人民医院妇产科提供)。儿童骨髓取自于骨折后的健康儿童(志愿者)，年龄2～10岁，共3例(由本院附属儿院骨科提供)，成人骨髓取自于骨折后健康成人(志愿者)，年龄20～45岁，共4例(由本院附属一院骨科提供)。
1.2 传代细胞系 WI-38细胞(人胚肺二倍体成纤维细胞系)，HOS-8603细胞(骨肉瘤细胞系)，3T3细胞(鼠成纤维细胞系)均为本室保存。按常规培养传代。
1.3 试剂
①Ficoll淋巴细胞分层液(比重1.077)(上海试剂二厂产)。
②单抗试剂：波形纤维蛋白(Viementin)单抗，结蛋白(Desmin)单抗。α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin)单抗，Ⅷ因子抗原(Von willebrand factor)单抗均为DAKO公司产，ABC标准试剂盒(Vector公司产)，异硫氰荧光素标记的鼠抗人CD34、CD33、CD38、CDW90单抗(Immunotech公司产)。
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③细胞因子：IL-3(中科院刘新恒院士惠赠)，GM-CSF(上海二军大曹雪涛教授惠赠)，IL-2、G-SCF、EPO购自深圳晶美公司。
1.4 脐血 取足月顺产健康新生儿抗凝脐血(由本市妇保医院提供)。
2 方法
2.1 人骨髓基质细胞的分离和培养
取骨髓3～5ml，用Ficoll淋巴细胞分层液(比重1.077)分离单核细胞(MNCS)，用无钙、镁PBS洗2次，RPMI1640洗一次后，用含20%小牛血清的RPMI1640培养基静置培养，每隔3～天半量换液一次，换液时将上层悬浮的细胞移入新瓶培养，原瓶培养的原代细胞以Po代表，新瓶中原代细胞为P′o，待贴壁的骨髓基质纤维细胞形成单层后，再进行传代，由Po细胞传代后的各代用P1(一代)，P2(二代)，P3(三代)代表，由P′o细胞传代后的各代用P′1(一代)，P′2(二代)，P′3(三代)代表以此类推。
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2.2 人骨髓基质细胞的传代培养和维护
用0.25%胰酶蛋白酶及0.02%EDTA消化已形成单层的基质细胞层，制成悬液后再以1∶2分瓶培养(37℃ 5%CO2)，开始每隔3～4天换液一次，每周可传代一次，当传至5～7代后细胞生长速度明显减慢，改为5天换液一次，2周传代一次，并将胎儿、儿童、成人骨髓基质细胞统一分别用EBMSC、CBMSC、ABMSC表示，C-后面的数字表示所传代次。
2.3 免疫细胞化学染色法 按常规法先加一抗，结合水洗后，按ABC法说明书进行，经染色、透明、封片后镜检。用3T3细胞株来作Viementin表达阳性的细胞对照，阴性对照用PBS替代一抗。
2.4 流式细胞仪检测法 按常规操作程序进行。
2.5 人骨髓基质细胞对脐血造血细胞的支持效应。
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2.5.1 人骨髓基质细胞体外维持脐血造血干细胞试验
附图 人骨髓基质细胞体外维持和扩增脐血造血干细胞试验的流程
2.5.2 半固体混合集落(CFU-Mix)形成试验
收集培养至2周、4周、6周的造血和基质细胞，经洗涤后接种含有1.3%甲基纤维素(Sigma产)的IMDA培养体系(含20%FCS，氢考、双抗、SCF50ng/ml、IL-3、IL-6为25ng/ml，GM-CSF为40ng/ml，EPO为2u/ml)在24孔板中于37℃,5%CO2，培养2～3周，计数混合集落数(CFU-Mix)即为集落形成细胞(Colony-forming、cells,CFC)的总数和长期培养5～6周生成的长期培养起始细胞ITC-IC(long-term culture-initiating cells)的数量，并采用双因素比较行t检验。
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2.5.3 人骨髓基质细胞IL-6诱生试验
用IL-3(10ng/ml)和LPS(北京帮定)10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml刺激成人骨髓基质细胞，24小时后收获上清，并设有无任何因子刺激的常规培养对照组，采用IL-6依赖的B9细胞，经微量细胞增殖的MTT法测定上清中IL-6效价(IU/ml)，并进行双因素比较行t检验。
3 结果
3.1 各种人骨髓基质细胞分离和体外传代培养结果
人骨髓基质细胞贴壁生长，一周后有大量成纤维细胞贴壁，并有集落产生，呈岛状。经换液培养于2周左右方可形成单层；每次换液时，收集悬浮细胞移入新瓶继续静置培养，仍有许多贴壁细胞生长。再次移瓶培养可见有单核巨噬细胞贴壁生长，此细胞虽不能分裂和传代培养，但可持续存活2个月。在纤维细胞消化传代中，发现当纤维细胞完全脱落时，瓶壁上仍贴有未消化下来的内皮细胞，经充分消化和洗涤，又可将骨髓基质中的纤维细胞和内皮细胞分离开来，这样既可获得较纯的纤维细胞，又可获得较纯的内皮细胞，经镜检，成纤维细胞形体大而细长，多呈纤维状，可成束排列，胞浆丰富，核大；内皮细胞形体较小，呈上皮样，排列紧密，排列类似蜂窝状。单核巨噬细胞形体大，多呈园形或椭园形，膜周边不整齐，胞浆淡，核大而明显，有的还伸出伪足而不规则。现已将成纤维基质细胞传至5～10代，长达6个月左右，随着培养时间的延长和所传代次数的增加，生长速度也明显减慢，形态、排列也不规则。有衰退趋势，故骨髓基质细胞的永生化问题有待进一步研究。
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3.2 人骨髓基质细胞的免疫细胞化学染色结果
在CBMSC(原代Po)中有99.8%的Viementin阳性细胞，可呈现棕黄色的网架。有99.5%阳性细胞呈黄色或浅黄色，P3代有33.3%阳性细胞呈黄色或浅黄色。P5代未见阳性细胞。随培养时间延长，传代次数的增加Viementin阳性率也随之下降，换液时收集的非贴壁细胞经静置培养3天后才出现梭形细胞贴壁，7～10天逐渐增加，换液培养约需2～3周才形成单层，由于细胞数量限制，直到传至第3代(即P′3代)才行染色，此时对Viementin有100%的阳性细胞，并呈棕褐色或棕黄色。这可能与再贴壁的细胞间充质纤维细胞分化增殖迟后有关。
对第Ⅷ因子呈阴性反应，说明本测定的基质纤维细胞中不含内皮细胞。与大多数报道一致。而对平滑肌肌动蛋白和结蛋白的染色呈阴性，似乎有些不一致，这功能与实际培养条件有关。
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3.3 流式细胞仪测定结果
①细胞周期：对CBMSC-5(8周龄)细胞周期(DNA)测定的结果为：61.5%的细胞处于G1期，平均DNA含量Meen G1=103.9;有22.5%细胞处于G2期，Meen G2=204.6,G2/G(DNA)=1.970，仅16.1%的基质细胞处于S期，说明基质细胞体外培养至5代时，S期细胞含量少，说明分裂增殖能力明显降低。
②CBMSC-5(8周龄)的分化表型分析：其CD33、CD34、CD38、CDW90抗原检测的结果如表1。
表1 CBMSC-5和ABMSC-5(8周龄)细胞和WI38细胞免疫表型 细 胞
CD33
, 百拇医药
CD34
CD38
CDW90
儿童(CBMSC-5)
2.0±1.9
2.3±1.9
4.2±1.9
22.71±1.9
成人(ABMSC-5)
3.6±1.4
2.4±1.4
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41.6±1.4
9.1±1.4
WI-38(人胚肺)
2.1±1.6
1.7±1.6
1.3±1.6
68.0±1.6
结果表明，成人和儿童骨髓基质细胞和WI-38细胞均为非造血细胞，因此几乎不被CD33、CD34抗体标记，说明骨髓基质的免疫表型与造血干细胞不同。CD38表型检测结果为：成人(41.6±1.4)>儿童(4.2±1.9)>人胚肺(2.16±1.6)>呈下降趋势；CDW90表型：成人(9.1±1.4)>儿童(22.71±1.9)>人胚肺(68.0±16)呈上升趋势。说明儿童骨髓基质细胞比成人更趋幼稚、更原始，分化能力更高。
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3.4 人骨髓基质细胞支持脐血造血细胞体外扩增的作用
3.4.1 不同发育阶段的骨髓基质细胞对脐血造血细胞的CFC和LTC-IC的维持作用
7人份脐血MNCS(105/孔)在不同发育阶段的骨髓基质细胞中，长期培养2周、4周、6周后收取悬浮和贴壁细胞，经半固体混合集落形成试验测定脐血造血细胞中的CFC和LTC-IC的集落形成数(如表2)。表2 在不同发育阶段的基质细胞中长期培养脐血MNCS
所产生的CFC和LTC-IC的效率(n=7)(x±s)
组 别
2周(CFC)
4周(CFC)
, 百拇医药 6周(LTC-IC)
成人基质细胞组
64.5±11.3
46.3±7.6
11.3±3.1
儿童基质细胞组
50.6±7.4
34.4±8.8
12.6±2.3
胎儿基质细胞组
46.6±5.2
30.1±6.2
, 百拇医药
18.5±5.2
注：n为基质细胞例数
表2结果表明：在成人基质细胞组培养2周、4周的脐血CFC的产率显著高于儿童组(P<0.05)和胎儿组(P<0.01)，为成人>儿童>胎儿，说明成人和儿童骨髓基质细胞支持脐血造血的增殖能力优于胎儿基质细胞；但LTC-IC的产率胎儿基质细胞组又高于成人组和儿童组(P<0.05)，说明胎儿基质细胞体外长期维持脐血造血起始干细胞的能力优于儿童和成人组，为造血干细胞，特别是起始干细胞的长期维持提供了经验和实验依据。
3.4.2 人骨髓基质细胞对体外扩增脐血的CFC和LTC-IC的支持作用
5人份脐血MNCS(105”孔)，在含有SCF、IL-3、IL-6细胞因子的基质细胞和无基质细胞的扩增培体系中，均能有效的扩增脐血CFC和LTC-IC，结果如表3。
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表3 人骨髓基质细胞对扩增脐血CFC和LTC-IC的作用(n=5份脐血) 组 别
CFC(1周)
LTC-IC(6周)
成人基质细胞组
876.9±152.7
26.3±7.4
胎儿基质细胞组
448.7±137.1
41.0±8.7
无基持细胞组
563.8±132.5
, 百拇医药
11.6±4.8
表3结果表明：成人骨髓基质细胞对扩增体系中的脐血CFC和LTC-IC的产率均明显高于无基质细胞组(P<0.01)，胎儿基质细胞在此扩增体系中培养一周的脐血CFC略低于无基质组，但6周后的LTC-IC却明显高于无基质细胞和成人基质细胞组，分别高3.5倍和2倍，说明胎儿基质细胞在扩增体系中对长期维持脐血中造血起始干细胞的能力最强。若没有基质细胞的支持，对维持和扩增LTC-IC不仅数量降低，而且质量也下降。
3.4.3 IL-3在成人骨髓基质细胞培养体中对脐血CFC和LTC-IC产率的协同效应
脐血MNCS(106/ml)，在成人基质细胞培养体系中设加IL-3(20ng/ml)处理组和不加IL-3的对照组，培养2周、4周、6周，收集悬浮和贴壁细胞，经半固体混合集落(CFU-Mix)形成试验测定CFC和LTC-IC集落形成数，结果如表4。表4 IL-3在成人骨髓基质细胞培养体系中对脐血CFC和LTC-IC产率的协同效应 周
, 百拇医药
对照组
IL-3处理组
t检验
2周(CFC)
52.4±4.2
54.7±9.3
P>0.05
4周(CFC)
15.3±3.1
35.4±5.3
P<0.01
6周(LTC-IC)
, 百拇医药
11.5±4.2
18.3±3.4
P<0.01
表4结果表明：IL-3处理组培养2周的脐血CFC产率与对照组无明显差异，在第4周IL-3处理组的脐血CFC产率明显高于对照组(P<0.01)，第6周LTC-IC的产率也明显高于对照组，均有明显差异(P<0.01)。说明IL-3+骨髓基质细胞对脐血中LTC-IC长期维持和扩增作用明显。
3.4.4 LPS或IL-3对成人骨髓基质细胞分泌造血因子IL-6的刺激效应
用传至4～5代的成人骨髓基质单层细胞，当加入IL-3(10ng/ml)或不同浓度(10ng/m;,100ng/ml,1000ng/ml)的LPS进行IL-6的诱生试验，同时设有不加因子的常规培养对照组，共同培养24小时，收培养上清并按常规法测定上清中IL6效价，结果如表5。表5 LPS和IL-3对成人骨髓基质细胞分泌IL-6的刺激效应
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对照组
(0)
LPS诱导组 (ng/ml)
IL-3诱导组
(ng/ml)
10
100
100
IL-6效价
(IU/ml)
5.299±1.472
12.118±2.67
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38.153±4.521
28.614±3.841
23.845±2.435
诱导组/对照组
2.3
7.2
5.4
4.5
表5结果表明：LPS各剂各和IL-3均可刺激成人骨髓细胞合成造血细胞因子IL-6。其中LPS最佳刺激剂量为100ng/ml。
3 讨论
, http://www.100md.com 本文的实验中，观察了人骨髓基质细胞中成纤维肌样细胞、巨噬细胞、内皮细胞的形态，并进行了胎儿、儿童、成人骨髓基质细胞的长期传代培养，在不同代次和培养方式的基质细胞中，经免疫细胞化学检测，原代细胞为Viementin(波形纤维蛋白)阳性，并随传代次数增加和培养时间延长呈减弱趋势，对第Ⅷ因子呈阴性。其细胞表型采用流式细胞仪测定，儿童骨髓基质肌样细胞表型为CD-33、CD-34、CD-38、CD+W90，而成人骨髓基质肌样细胞表型为CD-33、CD+34、CD+38、CD+W90。这与Healy报告基本一致[5]。
在骨髓基质细胞培养体质中，其不同发育阶段的(胎儿、儿童、成人)的基质细胞对脐血的CFC产率均有较好的支持效应，对培养6周的脐血LTC-IC的产率也有较好的维持作用，采用本法可使脐血中的LTC-IC达长期存活，其中胎儿基质优于儿童和成人(P<0.05)，但产率仍不令人满意，这与Verfaillie报告的仅有20%的LTC-IC被保留下来的结果一致[6]，后改用加入多种造血细胞因子的体外扩增体系，该扩增体系在有或无基质细胞支持下，均能有效地扩增脐血的CFC和LTC-IC。但成人、胎儿基质细胞接触的扩增体系可使脐血中的LTC-IC的产率比无基质扩增体系分别提高2倍、4倍，有明显差异，尤以胎儿基质接触的效果最佳。这可能与不同发育阶段的基质细胞分泌造血因子的种类和数量有关[7，8]。此外我们在基质细胞培养体系中将脐血MNCS联合IL-3扩增4～6周，CFC和LTC=Ic比无IL-3有明显的支持和促增殖效应(P<0.01)。用LPS或IL-3刺激诱导骨髓基质细胞的培养上清中也检测到较高水平的IL-6，分别比无LPS或IL-3的对照组高4～7倍及2倍以上。说明骨髓基质细胞不仅可低水平分必OL-6，而且具有刺激分泌较高水平的IL-6造血细胞因子的能力[9]。
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江苏省自然科学基金资助课题
参考文献
[1]Hauser SP, Waldron JA, Upuda KB,et al. Morphotogical characterijation of Stromal cell type in hematopoietically active long-term murine bone marrow cultare. J Histochemi Chemis,1995,43(4):371
[2]Huang S, Terstappen LW. Formation of hematopoietic microenviroment and hematopoietic stem cells from single humn bone marrow stem cells, Nature,1993,360:745
, http://www.100md.com
[3]Buder SP, Kurth AA, shea M, et al.Bone regeration by implantion of purified culture expanded human mesenchymal stem cells. J Orthop Res, 1998,16(2):155
[4]Butnarim-Ephrat M, Robinson D, Mendes DG, et al.Resurfacing of goat articullar cartilage by chondrocytes derived from bone marrow, Clin Orthop, 1996,sep,330:334
[5]Heely L, May G. Gale K, et al.The stem cell antigen CD34 functions as a regulator of hemopoietin cell adhesion. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(16):2422
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[6]Verfaillie CM, Catangaro PM, Li MN. Macrophage, Inflammayory protin 12, Interleuking 3 and diffusible marrow stromeal factors maintain human hemetopoietic stem cells or at least eitht weeks in vitro. J. Exp Med, 1994,179:643
[7]Breems DA, Blokland EAW, Siebel KE et al. Stromal-contact prevents loss of hematopoietic stem cell quality turing ex vivo expansion of CD+34 mobilized perpheral blood stem cells. Blood, 1998,91:111
[8]Breem DA, Blokland EAW, Ploemacher RE. Stromal-conditionde media improve exaansion of human primitive hematopoietic stem cells and progeneitor cells Leukemia, 1997,11:142
[9]李丽娥，王红卫.骨髓基质细胞的研究进展.国外医学输血及血液学分册，1999(2)：72
(1999年2月21日收稿), http://www.100md.com
单位：杨吉成 盛伟华 李丽娥 董宁征 王红卫(苏州医学院基因工程研究室苏州 215007)；郭瑃(苏州医学院人体解剖学教研室)；王晓东(苏州医学院附儿院骨科)；杨宗华(常熟市第一人民医院)
关键词：人骨髓基质细胞；长期培养起始细胞；成纤维细胞；造血支持功能
中国血液变学杂志000206 摘 要 采用静置贴壁细胞培养法，体外长期培养了胎儿、儿童、成人骨髓基质细胞，时间为6个月，可传至10代，并观察了成纤维肌样细胞、内皮细胞和巨噬细胞；通过免疫细胞化学染色法，证明了1～3代的骨髓基质肌样细胞Viementin为阳性，第Ⅷ因子阴性；采用流式细胞仪检测法，证明了儿童骨髓基质细胞的细胞表型为CD-33、CD-34、CD-38、CD+W90,成人骨髓基质细胞为CD-33、CD-34、CD+38、CD+W90。
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THE STUDY ON BIOLOGIC CHARACTERISTICS OF HUMAN BONE MARROW
STROMAL CELLS INCLUDING THE HEMATOPOIESIS SUPPORTED FUNCTION
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Abstract Fetal, child, adult bone marrow stomal cells were cultured for six months in vitro by static adherent assay, and propagated up to 10 times, The myoid fibroblast, endothelial and macrophagic cells were observed. The result of immunocyte chemisty intricated the myoid cells propagated 1 to 3 times were positive for viementin and negtive for Ⅷ factor. The result of phenotype analysis by FACS suggested the child bone marrow stromal cells were CD-33、CD-34、CD-38、CD+W90，and adult cells were CD-33、CD-34、CD+38、CD+W90。
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The CFC assay was used to test the hematopoietic in cord bleed after culture and expansion in vitro, the result demonstrated the long-term supportive effect of stromal cells on the survival of LTC-ICs in cord blood. The expansion of LTC-ICs in the stromal-supported system containing SCF, IL-3,IL-6 was more remarkable than that in nonstroma system (P<0.01). The frequency of LTC-ICs of the stromal-supported system was 2 to 4 times higher than that of nonstroma system. The results above suggested that the bone marrow stromal cells have bone marrow hematopoiesis-supported function.
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Keywords Human bone marrow stromal cells Long-term cultrue-initiating cells (LTC-ICs) Fibroblast Hematopoiesis-supported function
人骨髓基质细胞包括成纤维细胞，内皮细胞，脂肪细胞和巨噬细胞。在体内可提供造血微环境[1，2]，已成为造血干细胞生长、分化和自我更新的重要场所，这可能与基质细胞能合成和分泌多种调控因子(细胞因子和粘附分子)和基质(胶原和酶等)有关[3，4]。
国内外近期对人骨髓基质细胞的造血调控的研究已取得了可喜的进展，并探讨了造血基质干细胞对维持造血微环境的作用，为此我们近期对来源于胎儿、儿童和成人骨髓基质细胞进行了体外长期培养，并开展了有关细胞分化表型、造血支持作用等生物学特性的实验研究，现分别报告如下：
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1.1 人骨髓基质细胞的组织来源
胎儿骨髓取自于孕早期5～6个月的人工流产的正常胎儿骨髓共3例(由本市第二人民医院妇产科提供)。儿童骨髓取自于骨折后的健康儿童(志愿者)，年龄2～10岁，共3例(由本院附属儿院骨科提供)，成人骨髓取自于骨折后健康成人(志愿者)，年龄20～45岁，共4例(由本院附属一院骨科提供)。
1.2 传代细胞系 WI-38细胞(人胚肺二倍体成纤维细胞系)，HOS-8603细胞(骨肉瘤细胞系)，3T3细胞(鼠成纤维细胞系)均为本室保存。按常规培养传代。
1.3 试剂
①Ficoll淋巴细胞分层液(比重1.077)(上海试剂二厂产)。
②单抗试剂：波形纤维蛋白(Viementin)单抗，结蛋白(Desmin)单抗。α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin)单抗，Ⅷ因子抗原(Von willebrand factor)单抗均为DAKO公司产，ABC标准试剂盒(Vector公司产)，异硫氰荧光素标记的鼠抗人CD34、CD33、CD38、CDW90单抗(Immunotech公司产)。
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③细胞因子：IL-3(中科院刘新恒院士惠赠)，GM-CSF(上海二军大曹雪涛教授惠赠)，IL-2、G-SCF、EPO购自深圳晶美公司。
1.4 脐血 取足月顺产健康新生儿抗凝脐血(由本市妇保医院提供)。
2 方法
2.1 人骨髓基质细胞的分离和培养
取骨髓3～5ml，用Ficoll淋巴细胞分层液(比重1.077)分离单核细胞(MNCS)，用无钙、镁PBS洗2次，RPMI1640洗一次后，用含20%小牛血清的RPMI1640培养基静置培养，每隔3～天半量换液一次，换液时将上层悬浮的细胞移入新瓶培养，原瓶培养的原代细胞以Po代表，新瓶中原代细胞为P′o，待贴壁的骨髓基质纤维细胞形成单层后，再进行传代，由Po细胞传代后的各代用P1(一代)，P2(二代)，P3(三代)代表，由P′o细胞传代后的各代用P′1(一代)，P′2(二代)，P′3(三代)代表以此类推。
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2.2 人骨髓基质细胞的传代培养和维护
用0.25%胰酶蛋白酶及0.02%EDTA消化已形成单层的基质细胞层，制成悬液后再以1∶2分瓶培养(37℃ 5%CO2)，开始每隔3～4天换液一次，每周可传代一次，当传至5～7代后细胞生长速度明显减慢，改为5天换液一次，2周传代一次，并将胎儿、儿童、成人骨髓基质细胞统一分别用EBMSC、CBMSC、ABMSC表示，C-后面的数字表示所传代次。
2.3 免疫细胞化学染色法 按常规法先加一抗，结合水洗后，按ABC法说明书进行，经染色、透明、封片后镜检。用3T3细胞株来作Viementin表达阳性的细胞对照，阴性对照用PBS替代一抗。
2.4 流式细胞仪检测法 按常规操作程序进行。
2.5 人骨髓基质细胞对脐血造血细胞的支持效应。
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2.5.1 人骨髓基质细胞体外维持脐血造血干细胞试验
附图 人骨髓基质细胞体外维持和扩增脐血造血干细胞试验的流程
2.5.2 半固体混合集落(CFU-Mix)形成试验
收集培养至2周、4周、6周的造血和基质细胞，经洗涤后接种含有1.3%甲基纤维素(Sigma产)的IMDA培养体系(含20%FCS，氢考、双抗、SCF50ng/ml、IL-3、IL-6为25ng/ml，GM-CSF为40ng/ml，EPO为2u/ml)在24孔板中于37℃,5%CO2，培养2～3周，计数混合集落数(CFU-Mix)即为集落形成细胞(Colony-forming、cells,CFC)的总数和长期培养5～6周生成的长期培养起始细胞ITC-IC(long-term culture-initiating cells)的数量，并采用双因素比较行t检验。
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2.5.3 人骨髓基质细胞IL-6诱生试验
用IL-3(10ng/ml)和LPS(北京帮定)10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml刺激成人骨髓基质细胞，24小时后收获上清，并设有无任何因子刺激的常规培养对照组，采用IL-6依赖的B9细胞，经微量细胞增殖的MTT法测定上清中IL-6效价(IU/ml)，并进行双因素比较行t检验。
3 结果
3.1 各种人骨髓基质细胞分离和体外传代培养结果
人骨髓基质细胞贴壁生长，一周后有大量成纤维细胞贴壁，并有集落产生，呈岛状。经换液培养于2周左右方可形成单层；每次换液时，收集悬浮细胞移入新瓶继续静置培养，仍有许多贴壁细胞生长。再次移瓶培养可见有单核巨噬细胞贴壁生长，此细胞虽不能分裂和传代培养，但可持续存活2个月。在纤维细胞消化传代中，发现当纤维细胞完全脱落时，瓶壁上仍贴有未消化下来的内皮细胞，经充分消化和洗涤，又可将骨髓基质中的纤维细胞和内皮细胞分离开来，这样既可获得较纯的纤维细胞，又可获得较纯的内皮细胞，经镜检，成纤维细胞形体大而细长，多呈纤维状，可成束排列，胞浆丰富，核大；内皮细胞形体较小，呈上皮样，排列紧密，排列类似蜂窝状。单核巨噬细胞形体大，多呈园形或椭园形，膜周边不整齐，胞浆淡，核大而明显，有的还伸出伪足而不规则。现已将成纤维基质细胞传至5～10代，长达6个月左右，随着培养时间的延长和所传代次数的增加，生长速度也明显减慢，形态、排列也不规则。有衰退趋势，故骨髓基质细胞的永生化问题有待进一步研究。
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3.2 人骨髓基质细胞的免疫细胞化学染色结果
在CBMSC(原代Po)中有99.8%的Viementin阳性细胞，可呈现棕黄色的网架。有99.5%阳性细胞呈黄色或浅黄色，P3代有33.3%阳性细胞呈黄色或浅黄色。P5代未见阳性细胞。随培养时间延长，传代次数的增加Viementin阳性率也随之下降，换液时收集的非贴壁细胞经静置培养3天后才出现梭形细胞贴壁，7～10天逐渐增加，换液培养约需2～3周才形成单层，由于细胞数量限制，直到传至第3代(即P′3代)才行染色，此时对Viementin有100%的阳性细胞，并呈棕褐色或棕黄色。这可能与再贴壁的细胞间充质纤维细胞分化增殖迟后有关。
对第Ⅷ因子呈阴性反应，说明本测定的基质纤维细胞中不含内皮细胞。与大多数报道一致。而对平滑肌肌动蛋白和结蛋白的染色呈阴性，似乎有些不一致，这功能与实际培养条件有关。
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3.3 流式细胞仪测定结果
①细胞周期：对CBMSC-5(8周龄)细胞周期(DNA)测定的结果为：61.5%的细胞处于G1期，平均DNA含量Meen G1=103.9;有22.5%细胞处于G2期，Meen G2=204.6,G2/G(DNA)=1.970，仅16.1%的基质细胞处于S期，说明基质细胞体外培养至5代时，S期细胞含量少，说明分裂增殖能力明显降低。
②CBMSC-5(8周龄)的分化表型分析：其CD33、CD34、CD38、CDW90抗原检测的结果如表1。
表1 CBMSC-5和ABMSC-5(8周龄)细胞和WI38细胞免疫表型 细 胞
CD33
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CD34
CD38
CDW90
儿童(CBMSC-5)
2.0±1.9
2.3±1.9
4.2±1.9
22.71±1.9
成人(ABMSC-5)
3.6±1.4
2.4±1.4
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41.6±1.4
9.1±1.4
WI-38(人胚肺)
2.1±1.6
1.7±1.6
1.3±1.6
68.0±1.6
结果表明，成人和儿童骨髓基质细胞和WI-38细胞均为非造血细胞，因此几乎不被CD33、CD34抗体标记，说明骨髓基质的免疫表型与造血干细胞不同。CD38表型检测结果为：成人(41.6±1.4)>儿童(4.2±1.9)>人胚肺(2.16±1.6)>呈下降趋势；CDW90表型：成人(9.1±1.4)>儿童(22.71±1.9)>人胚肺(68.0±16)呈上升趋势。说明儿童骨髓基质细胞比成人更趋幼稚、更原始，分化能力更高。
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3.4 人骨髓基质细胞支持脐血造血细胞体外扩增的作用
3.4.1 不同发育阶段的骨髓基质细胞对脐血造血细胞的CFC和LTC-IC的维持作用
7人份脐血MNCS(105/孔)在不同发育阶段的骨髓基质细胞中，长期培养2周、4周、6周后收取悬浮和贴壁细胞，经半固体混合集落形成试验测定脐血造血细胞中的CFC和LTC-IC的集落形成数(如表2)。表2 在不同发育阶段的基质细胞中长期培养脐血MNCS
所产生的CFC和LTC-IC的效率(n=7)(x±s)
组 别
2周(CFC)
4周(CFC)
, 百拇医药 6周(LTC-IC)
成人基质细胞组
64.5±11.3
46.3±7.6
11.3±3.1
儿童基质细胞组
50.6±7.4
34.4±8.8
12.6±2.3
胎儿基质细胞组
46.6±5.2
30.1±6.2
, 百拇医药
18.5±5.2
注：n为基质细胞例数
表2结果表明：在成人基质细胞组培养2周、4周的脐血CFC的产率显著高于儿童组(P<0.05)和胎儿组(P<0.01)，为成人>儿童>胎儿，说明成人和儿童骨髓基质细胞支持脐血造血的增殖能力优于胎儿基质细胞；但LTC-IC的产率胎儿基质细胞组又高于成人组和儿童组(P<0.05)，说明胎儿基质细胞体外长期维持脐血造血起始干细胞的能力优于儿童和成人组，为造血干细胞，特别是起始干细胞的长期维持提供了经验和实验依据。
3.4.2 人骨髓基质细胞对体外扩增脐血的CFC和LTC-IC的支持作用
5人份脐血MNCS(105”孔)，在含有SCF、IL-3、IL-6细胞因子的基质细胞和无基质细胞的扩增培体系中，均能有效的扩增脐血CFC和LTC-IC，结果如表3。
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表3 人骨髓基质细胞对扩增脐血CFC和LTC-IC的作用(n=5份脐血) 组 别
CFC(1周)
LTC-IC(6周)
成人基质细胞组
876.9±152.7
26.3±7.4
胎儿基质细胞组
448.7±137.1
41.0±8.7
无基持细胞组
563.8±132.5
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11.6±4.8
表3结果表明：成人骨髓基质细胞对扩增体系中的脐血CFC和LTC-IC的产率均明显高于无基质细胞组(P<0.01)，胎儿基质细胞在此扩增体系中培养一周的脐血CFC略低于无基质组，但6周后的LTC-IC却明显高于无基质细胞和成人基质细胞组，分别高3.5倍和2倍，说明胎儿基质细胞在扩增体系中对长期维持脐血中造血起始干细胞的能力最强。若没有基质细胞的支持，对维持和扩增LTC-IC不仅数量降低，而且质量也下降。
3.4.3 IL-3在成人骨髓基质细胞培养体中对脐血CFC和LTC-IC产率的协同效应
脐血MNCS(106/ml)，在成人基质细胞培养体系中设加IL-3(20ng/ml)处理组和不加IL-3的对照组，培养2周、4周、6周，收集悬浮和贴壁细胞，经半固体混合集落(CFU-Mix)形成试验测定CFC和LTC-IC集落形成数，结果如表4。表4 IL-3在成人骨髓基质细胞培养体系中对脐血CFC和LTC-IC产率的协同效应 周
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对照组
IL-3处理组
t检验
2周(CFC)
52.4±4.2
54.7±9.3
P>0.05
4周(CFC)
15.3±3.1
35.4±5.3
P<0.01
6周(LTC-IC)
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11.5±4.2
18.3±3.4
P<0.01
表4结果表明：IL-3处理组培养2周的脐血CFC产率与对照组无明显差异，在第4周IL-3处理组的脐血CFC产率明显高于对照组(P<0.01)，第6周LTC-IC的产率也明显高于对照组，均有明显差异(P<0.01)。说明IL-3+骨髓基质细胞对脐血中LTC-IC长期维持和扩增作用明显。
3.4.4 LPS或IL-3对成人骨髓基质细胞分泌造血因子IL-6的刺激效应
用传至4～5代的成人骨髓基质单层细胞，当加入IL-3(10ng/ml)或不同浓度(10ng/m;,100ng/ml,1000ng/ml)的LPS进行IL-6的诱生试验，同时设有不加因子的常规培养对照组，共同培养24小时，收培养上清并按常规法测定上清中IL6效价，结果如表5。表5 LPS和IL-3对成人骨髓基质细胞分泌IL-6的刺激效应
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对照组
(0)
LPS诱导组 (ng/ml)
IL-3诱导组
(ng/ml)
10
100
100
IL-6效价
(IU/ml)
5.299±1.472
12.118±2.67
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38.153±4.521
28.614±3.841
23.845±2.435
诱导组/对照组
2.3
7.2
5.4
4.5
表5结果表明：LPS各剂各和IL-3均可刺激成人骨髓细胞合成造血细胞因子IL-6。其中LPS最佳刺激剂量为100ng/ml。
3 讨论
, http://www.100md.com 本文的实验中，观察了人骨髓基质细胞中成纤维肌样细胞、巨噬细胞、内皮细胞的形态，并进行了胎儿、儿童、成人骨髓基质细胞的长期传代培养，在不同代次和培养方式的基质细胞中，经免疫细胞化学检测，原代细胞为Viementin(波形纤维蛋白)阳性，并随传代次数增加和培养时间延长呈减弱趋势，对第Ⅷ因子呈阴性。其细胞表型采用流式细胞仪测定，儿童骨髓基质肌样细胞表型为CD-33、CD-34、CD-38、CD+W90，而成人骨髓基质肌样细胞表型为CD-33、CD+34、CD+38、CD+W90。这与Healy报告基本一致[5]。
在骨髓基质细胞培养体质中，其不同发育阶段的(胎儿、儿童、成人)的基质细胞对脐血的CFC产率均有较好的支持效应，对培养6周的脐血LTC-IC的产率也有较好的维持作用，采用本法可使脐血中的LTC-IC达长期存活，其中胎儿基质优于儿童和成人(P<0.05)，但产率仍不令人满意，这与Verfaillie报告的仅有20%的LTC-IC被保留下来的结果一致[6]，后改用加入多种造血细胞因子的体外扩增体系，该扩增体系在有或无基质细胞支持下，均能有效地扩增脐血的CFC和LTC-IC。但成人、胎儿基质细胞接触的扩增体系可使脐血中的LTC-IC的产率比无基质扩增体系分别提高2倍、4倍，有明显差异，尤以胎儿基质接触的效果最佳。这可能与不同发育阶段的基质细胞分泌造血因子的种类和数量有关[7，8]。此外我们在基质细胞培养体系中将脐血MNCS联合IL-3扩增4～6周，CFC和LTC=Ic比无IL-3有明显的支持和促增殖效应(P<0.01)。用LPS或IL-3刺激诱导骨髓基质细胞的培养上清中也检测到较高水平的IL-6，分别比无LPS或IL-3的对照组高4～7倍及2倍以上。说明骨髓基质细胞不仅可低水平分必OL-6，而且具有刺激分泌较高水平的IL-6造血细胞因子的能力[9]。
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江苏省自然科学基金资助课题
参考文献
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[3]Buder SP, Kurth AA, shea M, et al.Bone regeration by implantion of purified culture expanded human mesenchymal stem cells. J Orthop Res, 1998,16(2):155
[4]Butnarim-Ephrat M, Robinson D, Mendes DG, et al.Resurfacing of goat articullar cartilage by chondrocytes derived from bone marrow, Clin Orthop, 1996,sep,330:334
[5]Heely L, May G. Gale K, et al.The stem cell antigen CD34 functions as a regulator of hemopoietin cell adhesion. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(16):2422
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[6]Verfaillie CM, Catangaro PM, Li MN. Macrophage, Inflammayory protin 12, Interleuking 3 and diffusible marrow stromeal factors maintain human hemetopoietic stem cells or at least eitht weeks in vitro. J. Exp Med, 1994,179:643
[7]Breems DA, Blokland EAW, Siebel KE et al. Stromal-contact prevents loss of hematopoietic stem cell quality turing ex vivo expansion of CD+34 mobilized perpheral blood stem cells. Blood, 1998,91:111
[8]Breem DA, Blokland EAW, Ploemacher RE. Stromal-conditionde media improve exaansion of human primitive hematopoietic stem cells and progeneitor cells Leukemia, 1997,11:142
[9]李丽娥，王红卫.骨髓基质细胞的研究进展.国外医学输血及血液学分册，1999(2)：72
(1999年2月21日收稿), http://www.100md.com