一种安全、简便、高效的鲨鱼软骨活性成分抽提法
作者：任 岱
单位：湖南医科大学无机、分析化学教研室(长沙 410078)
关键词：
中国病理生理杂志990133 九十年代初，鲨鱼软骨(shark cartilage,SC)的抗癌作用已使世人瞩目，Cikawa等[1]以及沈先荣等[2，3]的研究都证明，SC的抑癌作用是由于它含有抑制新血管增生的活性物质。有效地提取这种活性物质对于癌症及许多其它与血管增生密切相关的顽疾如动脉粥样硬化、关节炎等的防治有重大意义。
本实验制备3种不同溶剂的SC抽提物，并将其中水抽提物进一步作凝胶柱层析，用牛肺动脉内皮细胞(calf pulmonary artery endothelium cell,CPAE)培养增殖试验，检测各种制剂对血管内皮细胞增殖的抑制作用，目的在建立一种高效、安全、简便的方法来提取SC中的活性成分。
, 百拇医药
材料与方法
(一)材料：Amicon超滤器，相对分子量300 000 Amicon滤膜；冷冻干燥机，Virtis出品；交联葡聚糖(G-150 Superfine),Sigma产品；鲨鱼软骨粉(商品名shark cartilade),Cartilage Technologies Inc.产品；MEM 10X培养液，小牛血清，CPAE均为American Type Culture Collection产品；UV-1601型多功能分光光度计，Shimadzu出品。
(二)方法：
1.SC盐酸胍抽提物(SC guanidine hydrochloride extract,SCGE)制备：100 g SC粉两份，分别用1 mol*L-1和6 mol*L-1盐酸胍各600 mL抽提24 h，离心分离，弃不溶物，用相对分子量300 000 Amicon膜超滤，取滤液冷冻干燥，粉末溶于约40 mL双蒸水，置相对分子量3 500透析膜管内，对水充分透析，再冷冻干燥，分别得约1.0 g，1.5 g干粉，即SCG1E和SCG6E。
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2.SC水抽提物(SC water extract,SCWE)制备：100gSC粉，加入600mL双蒸水，边搅拌边加热至80 ℃左右，维持30 min,(注意勿使沸腾)，待自然冷却，置于0～4 ℃搅拌过夜，24 h后，离心、超滤等按方法1处理，即得SCWE粉末约1.5 g。
3.水抽提物的凝胶过滤：将25 g*L-1SCWE水溶液约40 mL,经Sephadex G-150超细凝胶柱层析，柱床体积240 mL,用水作洗脱剂，部分收集器以每管9 mL收集洗脱液。用光吸收法测定蛋白质浓度；3，5-二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖的浓度；用CPAE培养增殖试验测定其对血管内皮细胞增殖的抑制效应。将活性部分(active fraction of SC, AFrSC)合并后冷冻干燥得AFrSC白色粉末约12 mg。
4.CPAE培养增殖试验(另文报道)：用MEM培养液加10%小牛血清培养CPAE，接种于24孔培养板中，孵育12 h后于待测孔中分别加入一定浓度的不同抽提物，参照孔以培养液代替抽提物，继续孵育3 d，加入含对硝基苯酚磷酸酯和Triton X-100的醋酸钠溶液。孵育2 h后，置冰上终止反应，加入氢氧化钠溶液，使在碱性条件下显色，于410 nm处测吸光度A410。用下式计算各抽提物在实验浓度下对CPAE增殖的抑制效应(%)。
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抑制效应(%)=(Ac-As)/(Ac)×100
式中Ac为同一培养板中参照组8个孔吸光度的平均值；As为该培养板中某试验组4个孔吸光度的平均值。每组各观察4例。各组吸光度与参照组的差异显著性用样本均数与理论均数比较的t检验；两组间差异的显著性用两样本均数比较的t检验。
结 果
1.抑制血管内皮细胞增殖效应的比较：3种抽提物的抑制效应结果见表1，SCWE与SCG6E的抑制效应十分接近，而SCG1E则明显较低。
表1 SC的3种抽提物对CPAE增殖的抑制效应
Tab 1 Inhibitory effect of three SC extracts
, 百拇医药
on CPAE proliferation(
±s) Plate No.
SC extracts
(455 mg·L-1)
A410
Inhibitory
effect(%)
Ⅰ
Control
0.8880±0.0847
, http://www.100md.com 0.00
SCG1E
0.3266±0.0164*
63.22
SCG6E
0.1618±0.0548**#
81.77
Ⅱ
Control
1.2187±0.0413
0.00
, 百拇医药
SCWE
0.1957±0.0009**#△
83.94
*P<0.01，P<0.001，vs control;
＃P<0.05，vs SCG1E；△P>0.05，vs SCG6E
2.AFrSC对CPAE增殖的抑制效应:结果见表2，3.640 mg*L-1AFrSC的抑制百分率，比浓度为其125倍(455 mg*L-1)的SCWE高，即前者比后者抑制效应高125倍以上。表2 不同浓度的AFrSC对CPAE增殖的抑制效应
Tab 2 Inhibitory effect of various concentrations
, 百拇医药
of AFrSC on CPAE proliferation(±s) Plate No.
AFrSC
(mg·L-1)
A410
Inhibitory
effect(%)
Ⅱ
Control
1.2187±0.0413
, 百拇医药 0.00
91.000
0.0860±0.0046**
92.94
Ⅲ
Control
1.1113±0.0994
0.00
18.200
0.0702±0.0118**
93.68
3.640
, http://www.100md.com
0.1004±0.0092**
90.96
0.728
0.6474±0.0448*
41.70
0.146
1.0993±0.0022
1.08
*P<0.05，**P<0.001，vs control讨 论
在水抽提物研制过程中发现，若一切手续相同，唯独省去加热，则所获产物的生物活性比SCWE明显要低(数据未列出)，且产率也降低。这一方面说明加热可杀灭酵母菌，防止活性成分被分解，并增大溶出率，另一方面也证明该活性成分具有相当的耐热性，这在制备SC制剂时十分重要。
, http://www.100md.com
SC制剂在美国已应用于二期临床，在我国也已开始用SC胶囊治疗晚期癌症病人，取得良好效果[4]。但至今国际上尚无人报道SC活性物质简易、高效的分离方法，使SC制品在临床应用受到很大局限。
本文显示了SCWE对CPAE增殖的抑制效应不亚于SCG6E，且该水抽提物经Sephadex G-150超细凝胶柱层析后，能获得高效的活性成分AFrSC，它对CPAE增殖的抑制效应比SCWE增高了125倍以上，这便为SC的临床应用，提供了一条安全、简便、高效、经济的途径。
(鸣谢：本研究在美国Fresno加州大学Dr. Kin-Ping Wong的实验室完成，得到Dr.Kin-Ping Wong,McMurtry J.M.和O'Hara C.的鼎力支持和帮助，特此致谢)
参考文献
1 Cikawa T,Ashino-Fuse H,Shimamura M,et al.A novel angiogenic inhibitor derived from Japanese shark cartilage(I).Extraction and estimation of inhibitory activities toward tumor and embryonic angiogenesis. Cancer Lett,1990,51:181.
, 百拇医药
2 沈先荣，贾福星，王 玲，等.鲨鱼软骨制剂抗肿瘤作用的研究.中国生化药物杂志，1995，16(4)：157.
3 沈先荣，贾福星，王 玲，等.鲨鱼软骨制剂抑制血管生成的研究.生物化学与生物物理进展, 1997，24(2):155.
4 焦炳华，王 路，缪辉南,等.鲨鱼软骨抗癌的物质基础. 生命的化学,1996,16(6):30.
收稿日期：1998年9月4日
修稿日期：1998年11月17日
, 百拇医药
单位：湖南医科大学无机、分析化学教研室(长沙 410078)
关键词：
中国病理生理杂志990133 九十年代初，鲨鱼软骨(shark cartilage,SC)的抗癌作用已使世人瞩目，Cikawa等[1]以及沈先荣等[2，3]的研究都证明，SC的抑癌作用是由于它含有抑制新血管增生的活性物质。有效地提取这种活性物质对于癌症及许多其它与血管增生密切相关的顽疾如动脉粥样硬化、关节炎等的防治有重大意义。
本实验制备3种不同溶剂的SC抽提物，并将其中水抽提物进一步作凝胶柱层析，用牛肺动脉内皮细胞(calf pulmonary artery endothelium cell,CPAE)培养增殖试验，检测各种制剂对血管内皮细胞增殖的抑制作用，目的在建立一种高效、安全、简便的方法来提取SC中的活性成分。
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材料与方法
(一)材料：Amicon超滤器，相对分子量300 000 Amicon滤膜；冷冻干燥机，Virtis出品；交联葡聚糖(G-150 Superfine),Sigma产品；鲨鱼软骨粉(商品名shark cartilade),Cartilage Technologies Inc.产品；MEM 10X培养液，小牛血清，CPAE均为American Type Culture Collection产品；UV-1601型多功能分光光度计，Shimadzu出品。
(二)方法：
1.SC盐酸胍抽提物(SC guanidine hydrochloride extract,SCGE)制备：100 g SC粉两份，分别用1 mol*L-1和6 mol*L-1盐酸胍各600 mL抽提24 h，离心分离，弃不溶物，用相对分子量300 000 Amicon膜超滤，取滤液冷冻干燥，粉末溶于约40 mL双蒸水，置相对分子量3 500透析膜管内，对水充分透析，再冷冻干燥，分别得约1.0 g，1.5 g干粉，即SCG1E和SCG6E。
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2.SC水抽提物(SC water extract,SCWE)制备：100gSC粉，加入600mL双蒸水，边搅拌边加热至80 ℃左右，维持30 min,(注意勿使沸腾)，待自然冷却，置于0～4 ℃搅拌过夜，24 h后，离心、超滤等按方法1处理，即得SCWE粉末约1.5 g。
3.水抽提物的凝胶过滤：将25 g*L-1SCWE水溶液约40 mL,经Sephadex G-150超细凝胶柱层析，柱床体积240 mL,用水作洗脱剂，部分收集器以每管9 mL收集洗脱液。用光吸收法测定蛋白质浓度；3，5-二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖的浓度；用CPAE培养增殖试验测定其对血管内皮细胞增殖的抑制效应。将活性部分(active fraction of SC, AFrSC)合并后冷冻干燥得AFrSC白色粉末约12 mg。
4.CPAE培养增殖试验(另文报道)：用MEM培养液加10%小牛血清培养CPAE，接种于24孔培养板中，孵育12 h后于待测孔中分别加入一定浓度的不同抽提物，参照孔以培养液代替抽提物，继续孵育3 d，加入含对硝基苯酚磷酸酯和Triton X-100的醋酸钠溶液。孵育2 h后，置冰上终止反应，加入氢氧化钠溶液，使在碱性条件下显色，于410 nm处测吸光度A410。用下式计算各抽提物在实验浓度下对CPAE增殖的抑制效应(%)。
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抑制效应(%)=(Ac-As)/(Ac)×100
式中Ac为同一培养板中参照组8个孔吸光度的平均值；As为该培养板中某试验组4个孔吸光度的平均值。每组各观察4例。各组吸光度与参照组的差异显著性用样本均数与理论均数比较的t检验；两组间差异的显著性用两样本均数比较的t检验。
结 果
1.抑制血管内皮细胞增殖效应的比较：3种抽提物的抑制效应结果见表1，SCWE与SCG6E的抑制效应十分接近，而SCG1E则明显较低。
表1 SC的3种抽提物对CPAE增殖的抑制效应
Tab 1 Inhibitory effect of three SC extracts
, 百拇医药
on CPAE proliferation(
±s) Plate No.SC extracts
(455 mg·L-1)
A410
Inhibitory
effect(%)
Ⅰ
Control
0.8880±0.0847
, http://www.100md.com 0.00
SCG1E
0.3266±0.0164*
63.22
SCG6E
0.1618±0.0548**#
81.77
Ⅱ
Control
1.2187±0.0413
0.00
, 百拇医药
SCWE
0.1957±0.0009**#△
83.94
*P<0.01，P<0.001，vs control;
＃P<0.05，vs SCG1E；△P>0.05，vs SCG6E
2.AFrSC对CPAE增殖的抑制效应:结果见表2，3.640 mg*L-1AFrSC的抑制百分率，比浓度为其125倍(455 mg*L-1)的SCWE高，即前者比后者抑制效应高125倍以上。表2 不同浓度的AFrSC对CPAE增殖的抑制效应
Tab 2 Inhibitory effect of various concentrations
, 百拇医药
of AFrSC on CPAE proliferation(
±s) Plate No.AFrSC
(mg·L-1)
A410
Inhibitory
effect(%)
Ⅱ
Control
1.2187±0.0413
, 百拇医药 0.00
91.000
0.0860±0.0046**
92.94
Ⅲ
Control
1.1113±0.0994
0.00
18.200
0.0702±0.0118**
93.68
3.640
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0.1004±0.0092**
90.96
0.728
0.6474±0.0448*
41.70
0.146
1.0993±0.0022
1.08
*P<0.05，**P<0.001，vs control讨 论
在水抽提物研制过程中发现，若一切手续相同，唯独省去加热，则所获产物的生物活性比SCWE明显要低(数据未列出)，且产率也降低。这一方面说明加热可杀灭酵母菌，防止活性成分被分解，并增大溶出率，另一方面也证明该活性成分具有相当的耐热性，这在制备SC制剂时十分重要。
, http://www.100md.com
SC制剂在美国已应用于二期临床，在我国也已开始用SC胶囊治疗晚期癌症病人，取得良好效果[4]。但至今国际上尚无人报道SC活性物质简易、高效的分离方法，使SC制品在临床应用受到很大局限。
本文显示了SCWE对CPAE增殖的抑制效应不亚于SCG6E，且该水抽提物经Sephadex G-150超细凝胶柱层析后，能获得高效的活性成分AFrSC，它对CPAE增殖的抑制效应比SCWE增高了125倍以上，这便为SC的临床应用，提供了一条安全、简便、高效、经济的途径。
(鸣谢：本研究在美国Fresno加州大学Dr. Kin-Ping Wong的实验室完成，得到Dr.Kin-Ping Wong,McMurtry J.M.和O'Hara C.的鼎力支持和帮助，特此致谢)
参考文献
1 Cikawa T,Ashino-Fuse H,Shimamura M,et al.A novel angiogenic inhibitor derived from Japanese shark cartilage(I).Extraction and estimation of inhibitory activities toward tumor and embryonic angiogenesis. Cancer Lett,1990,51:181.
, 百拇医药
2 沈先荣，贾福星，王 玲，等.鲨鱼软骨制剂抗肿瘤作用的研究.中国生化药物杂志，1995，16(4)：157.
3 沈先荣，贾福星，王 玲，等.鲨鱼软骨制剂抑制血管生成的研究.生物化学与生物物理进展, 1997，24(2):155.
4 焦炳华，王 路，缪辉南,等.鲨鱼软骨抗癌的物质基础. 生命的化学,1996,16(6):30.
收稿日期：1998年9月4日
修稿日期：1998年11月17日
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