重型肝炎时中性粒细胞的形态改变
作者：王英杰 王宇明 李梦东 可金星 张文军 陈烯伟
单位：王英杰 王宇明 李梦东 第三军医大学西南医院传染科 (重庆 400038)；可金星 张文军 陈烯伟 基础部中心实验室电镜室
关键词：肝炎；中性白细胞；显微镜检查；电子
中国病理生理杂志990226 摘 要 目的：观察并探讨重型肝炎时血中性粒细胞的形态变化及其意义。方法：20例重型肝炎患者血中性粒细胞标本，常规固定、包埋制片、电镜检查。结果：所有患者的中性粒细胞均有明显异常，其改变程度与患者肝衰竭分期相平行。主要包括：中性粒细胞质变性，吞噬泡欠缺，细胞器及细胞颗粒减少，线粒体肿胀，细胞核浓缩等。核面积测量、线粒体和细胞颗粒电镜计数结果与上述改变一致。结论：该结果可视为严重肝病患者中性粒细胞功能减退及其对细菌易感性显著增高的形态学证据，患者中性粒细胞超微结构异常与肝衰竭之间可能有某些互为因果关系。
, 百拇医药
Morphological changes of neutrophils in severe hepatitis
WANG Ying-Jie, WANG Yu-Ming, LI Meng-Dong, KE Jing-Xing, ZHANG Wei-Jun, CHEN Xi-Wei
Department of Infectious Disease, Southwest Hospital, Third Military College, Chongqing (400038)
Abstract AIM: To study the morphological changes of neutrophils in patients with severe hepatitis and discuss their significance. METHODS: 20 cases of neutrophils specimens prepared with routine methods were observed by electron microscopy. RESULTS: Abnormalities of neutrophils were observated in all patients, which paralleled closely with the stage of hepatic failure in patients. Main ultrastructrual changes included cytoplasm degeneration, want of pinocytotic vesicle and phagosone, decreased organelles and granules, mitochondria swelling, nucleus condensation, etc. Nuclear area measure, mitochondria and cell granules count were consistent with the above observation.CONCLUSION: This results could be regarded as a morphological evidence of the reduced neutrophil functions and the increased susceptibility to bacterial infection in patients with severe liver disease. A mutually causal relation may be existed between the ultrastructural abnormalities of neutrophils and the hepatic failure in severe hepatitis patients.
, 百拇医药
MeSH Hepatitis; Neutrophils; Microscopy, electron
有关肝病患者中性粒细胞异常的研究已为数不少，但大多系针对肝硬化等慢性肝病患者细菌易感性增高而进行的中性粒细胞功能研究[1～3]，对其形态改变了解尚少。本文对20例重型病毒性肝炎(重型肝炎)患者中性粒细胞超微结构进行了初步观察，以期从形态学角度为阐明中性粒细胞在重型肝炎病情演变中的意义提供实验依据。
材料与方法
1.临床资料：重型肝炎20例，系我科住院的乙型重型肝炎患者，男16例，女4例，平均年龄35.4岁。临床表现均符合1995年《病毒性肝炎防治方案》中的诊断标准。其中13例经肝组织病理检查证实本病。依患者肝衰竭程度及是否伴有严重并发症分早期和极期各10例进行观察。以本院健康献血员为正常对照组，共15例，男10例，女5例，平均年龄34.3岁。
, 百拇医药
2.电镜标本的制备：取静脉血4.5mL，0.13mol/L枸橼酸钠抗凝，以100×g离心5min，于所分离的血浆中缓慢加入0.03mol/L戊二醛0.2mL，常温放置5min。再以1000×g离心10min，弃上清，沿试管壁加入0.3mol/L戊二醛缓冲液2mL，常温下固定5h。轻轻拔出试管内的有核细胞层，用0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗，将所得标本修成1.5mm×1.5mm×1.5mm的小块，置0.3mol/L戊二醛内4℃下固定3h。以0.039mol/L锇酸作后固定，醋酸铀块染，系列丙酮脱水，环氧树脂618包埋，半薄切片HE染色后光镜下选择粒细胞层准确定位，制超薄切片两铝染色，H-300型透射电镜下观察。
3.核面积测量：于3000倍下随机对中性粒细胞摄片，置S-600型图像处理系统(重庆大学研制)进行核面积测量，每例随机连续测50个细胞核，取均值为其核面积代表值，用t检验处理数据。
4.线粒体、细胞颗粒计数：在电镜下直接随机连续计数50个中性粒细胞内线粒体(完全空化者不计数)、致密颗粒和低密度颗粒数，亦取均值为每例患者各项计数的代表值，同上方法统计处理。
, 百拇医药
结 果
一、超微结构观察结果(图1)。
Fig 1 The ultrastructural abnormalities of neutrophils in patients with severe hepatitis
1.The number of mitochondria, phagosome and granules of neutrophil decreased significantly.2.A significant swelling of mitochondria appeared in neutrophil. 3.The nucleus condensation of neutrophils was widely seen in extreme stage. 4.Endoplasmic reticula of neutrophil became dilated and some appeared degeneration
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图1 重型肝炎患者中性粒细胞的超微结构改变
观察发现20例患者中性粒细胞均有明显的超微结构异常，以极期患者最为显著，早期患者次之。与正常对照组相比大致有以下几类变化：(1)粒细胞表面突起及伪足普遍减少，且不规则，其内所含胞质稀少，少见吞噬泡存在。极期及部分早期患者细胞形态和大小欠均一，易见质膜和胞浆的较多部分外突而使细胞呈畸形，一些极期患者的细胞质膜有局限性模糊不清和缺损现象。(2)粒细胞胞浆均有不同程度改变，一些为胞质密度不均匀，部分胞质溶解、空化和呈凝固状。多数为整个细胞胞质疏松、水肿变性，部分细胞胞浆内出现大小不等、数目多寡不一的空泡。胞浆内所含细胞器明显减少，吞噬泡、低密度颗粒、致密颗粒等均显著减少，严重者胞浆内仅见到2～3个细胞颗粒。(3)粒细胞线粒体改变颇为突出。其数量显著减少，极期患者线粒体完全缺失现象多见。残留线粒体呈不同程度的退行性改变，包括灶性肿胀、嵴断裂、高度水肿及空泡化，部分空泡变的线粒体内见髓鞘样结构。(4)极期及多数早期患者粒细胞核浆比例下降，呈明显的核浓缩，部分甚至呈核固缩，染色质亦显著浓缩，电子密度极度，伴有核周间隙消失等改变。(5)粒细胞内的膜性管道系统变化不一 。有些患者细胞内微管数量增多，呈灶性聚集。有些内质网高度扩张，内含均一的细颗粒状物质，部分甚至扩张成大空泡，并伴膜结构的溶解消失和较多的髓鞘样结构。
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表1 中性粒细胞核面积测量和细胞器计数
Tab 1 The nuclear area measure and the organelles count of neutrophils Group
n
Nuclear
area(μm2)
Mitochondria
High density
granules
Low diensity granules
, 百拇医药 Control
15
51.2±8.6
8.2±3.1
9.6±3.4
42.7±9.6
Early stage
10
42.6±7.9*
4.5±2.4**
6.7±3.7
26.4±10.2**
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Extreme stage
10
33.4±10.1***
3.6±2.1**
5.8±2.9*
18.1±12.8*
*P<0.05， **P<0.01，vs control group ＃P<0.05， vs early stage group
二、核面积测量和细胞器计数结果(表1)：
由表1可见，重型肝炎早期时粒细胞核面积、细胞颗粒及线粒体就已低于正常对照组，除致密颗粒外，余均有统计学意义(P<0.05)。进入极期后，四项指标进一步下降，与对照组相差显著(P<0.05，P<0.01)。此外，极期与早期核面积之间也有显著差异(P<0.05)。讨 论
, 百拇医药
即往的研究证实，肝硬化等肝病患者粒细胞功能严重障碍，包括细胞脱粒，趋化、吞噬作用降低，过氧化物减少，炎性介质合成障碍等[3，4]，由于中性粒细胞在抵御细菌感染中起关键作用[5]，故上述粒细胞功能障碍是肝病患者易继发细菌感染的主要原因之一。本研究发现重型肝炎患者中性粒细胞有明显的超微结构异常，集中表现为粒细胞胞浆变性，细胞器减少、线粒体肿胀、细胞核浓缩等，这些改变与上述研究结果基本吻合，可视为肝病患者中性粒细胞功能异常的形态学证据，同时恰可解释重型肝炎患者临床过程中很高的细菌感染率。
Itoh等[6]发现，肝硬化患者中性粒细胞产生过氧离子能力的下降程度与肝功能障碍有相关关系，提示肝功能状态与粒细胞依氧性杀菌作用及其它细胞功能之间有一定的关系。我们在观察中注意到，重型肝炎患者中性粒细胞超微结构改变与肝衰竭分期基本一致，早期患者粒细胞改变已较明显，极期改变更为突出。提示中性粒细胞异常不仅可作为衡量重型肝炎患者预防感染能力的可靠指标，而且对重型肝炎患者病情及预后判断也有一定的参考价值。
, http://www.100md.com
已知酒精、营养不良、叶酸代谢失常以及骨髓抑制等均可引起粒细胞功能障碍，近来一些研究相继从乙型肝炎患者粒细胞中发现乙肝病毒[7]，鉴于多种病毒感染外周血细胞后可引起其细胞功能改变，故推测肝病时中性粒细胞的异常可能也与肝炎病毒直接或间接作用有关。上述研究似可说明肝病患者粒细胞改变系多种复杂因素长期慢性作用的结果，但尚不能完全解释重型肝炎时的中性粒细胞异常。由于重型肝炎是以肝衰竭为特征，病情严重者多发生多器官衰竭，其中严重的内毒素血症及复杂的免疫反应产物、免疫复合物等可作为血浆因素[8]而对细胞功能起直接抑制作用。故我们认为，中性粒细胞异常与肝衰竭之间可能存在着互为因果的关系，在重型肝炎患者粒细胞异常中，除其它因素外，肝衰竭本身可能起重要作用，确切的机理有待进一步深入研究。
(本研究承蒙本校基础部病理教研室刘友生教授帮助与指导，谨致谢意)
参考文献
, http://www.100md.com 1 Holdstock G, Leslie B, Hills C, et al. Monocyte function in cirrhosis. J Clin Pathol, 1982, 35:972.
2 Fernandez MA, Manifold IH, Fergusson L, et al. Neutrophil and monocyte phagocytosis in chronic liver disease. Clin Sci, 1982, 63:54.
3 Rajkovic IA, Williams S R. Abnormalities of neutrophil phagocytosis, intracellular killing, and metabolic activity in alcoholic cirrhosis and hepatitis. Hepatology, 1986, 6:252.
, 百拇医药
4 Laffi G, Carloni V, Baldi E, et al. Impaired superoxide anion, platelet-activating factor, and leukotriene B4 synthesis by neutrophils in cirrhosis. Gastroenterology, 1993, 105:170.
5 Konig WW, Schonfeld M, Raulf M, et al. The neutrophil and leukotrienes-role in health and disease. Eicosanoids, 1990, 3:1.
6 Itoh K, Nakao A, Kishimoto W, et al. Decreased production of active oxygen species by neutrophils in patients with liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Gastroenterol Jpn, 1993, 28:541.
, http://www.100md.com
7 Shen HD, Choo KB, Lee SD, et al. Hepatitis B virus DNA in leukocytos of patients with hepatitis B virus-associated disease. J Med Virol, 1986, 18:201.
8 DeMeo AN, Anderson BR. Defective chemotaxis associated a serum inhibitor in cirrhotic patients. N Engl J Med, 1972, 286:735.
收稿日期：1997年3月16日
修稿日期：1997年10月6日, 百拇医药
单位：王英杰 王宇明 李梦东 第三军医大学西南医院传染科 (重庆 400038)；可金星 张文军 陈烯伟 基础部中心实验室电镜室
关键词：肝炎；中性白细胞；显微镜检查；电子
中国病理生理杂志990226 摘 要 目的：观察并探讨重型肝炎时血中性粒细胞的形态变化及其意义。方法：20例重型肝炎患者血中性粒细胞标本，常规固定、包埋制片、电镜检查。结果：所有患者的中性粒细胞均有明显异常，其改变程度与患者肝衰竭分期相平行。主要包括：中性粒细胞质变性，吞噬泡欠缺，细胞器及细胞颗粒减少，线粒体肿胀，细胞核浓缩等。核面积测量、线粒体和细胞颗粒电镜计数结果与上述改变一致。结论：该结果可视为严重肝病患者中性粒细胞功能减退及其对细菌易感性显著增高的形态学证据，患者中性粒细胞超微结构异常与肝衰竭之间可能有某些互为因果关系。
, 百拇医药
Morphological changes of neutrophils in severe hepatitis
WANG Ying-Jie, WANG Yu-Ming, LI Meng-Dong, KE Jing-Xing, ZHANG Wei-Jun, CHEN Xi-Wei
Department of Infectious Disease, Southwest Hospital, Third Military College, Chongqing (400038)
Abstract AIM: To study the morphological changes of neutrophils in patients with severe hepatitis and discuss their significance. METHODS: 20 cases of neutrophils specimens prepared with routine methods were observed by electron microscopy. RESULTS: Abnormalities of neutrophils were observated in all patients, which paralleled closely with the stage of hepatic failure in patients. Main ultrastructrual changes included cytoplasm degeneration, want of pinocytotic vesicle and phagosone, decreased organelles and granules, mitochondria swelling, nucleus condensation, etc. Nuclear area measure, mitochondria and cell granules count were consistent with the above observation.CONCLUSION: This results could be regarded as a morphological evidence of the reduced neutrophil functions and the increased susceptibility to bacterial infection in patients with severe liver disease. A mutually causal relation may be existed between the ultrastructural abnormalities of neutrophils and the hepatic failure in severe hepatitis patients.
, 百拇医药
MeSH Hepatitis; Neutrophils; Microscopy, electron
有关肝病患者中性粒细胞异常的研究已为数不少，但大多系针对肝硬化等慢性肝病患者细菌易感性增高而进行的中性粒细胞功能研究[1～3]，对其形态改变了解尚少。本文对20例重型病毒性肝炎(重型肝炎)患者中性粒细胞超微结构进行了初步观察，以期从形态学角度为阐明中性粒细胞在重型肝炎病情演变中的意义提供实验依据。
材料与方法
1.临床资料：重型肝炎20例，系我科住院的乙型重型肝炎患者，男16例，女4例，平均年龄35.4岁。临床表现均符合1995年《病毒性肝炎防治方案》中的诊断标准。其中13例经肝组织病理检查证实本病。依患者肝衰竭程度及是否伴有严重并发症分早期和极期各10例进行观察。以本院健康献血员为正常对照组，共15例，男10例，女5例，平均年龄34.3岁。
, 百拇医药
2.电镜标本的制备：取静脉血4.5mL，0.13mol/L枸橼酸钠抗凝，以100×g离心5min，于所分离的血浆中缓慢加入0.03mol/L戊二醛0.2mL，常温放置5min。再以1000×g离心10min，弃上清，沿试管壁加入0.3mol/L戊二醛缓冲液2mL，常温下固定5h。轻轻拔出试管内的有核细胞层，用0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗，将所得标本修成1.5mm×1.5mm×1.5mm的小块，置0.3mol/L戊二醛内4℃下固定3h。以0.039mol/L锇酸作后固定，醋酸铀块染，系列丙酮脱水，环氧树脂618包埋，半薄切片HE染色后光镜下选择粒细胞层准确定位，制超薄切片两铝染色，H-300型透射电镜下观察。
3.核面积测量：于3000倍下随机对中性粒细胞摄片，置S-600型图像处理系统(重庆大学研制)进行核面积测量，每例随机连续测50个细胞核，取均值为其核面积代表值，用t检验处理数据。
4.线粒体、细胞颗粒计数：在电镜下直接随机连续计数50个中性粒细胞内线粒体(完全空化者不计数)、致密颗粒和低密度颗粒数，亦取均值为每例患者各项计数的代表值，同上方法统计处理。
, 百拇医药
结 果
一、超微结构观察结果(图1)。
Fig 1 The ultrastructural abnormalities of neutrophils in patients with severe hepatitis
1.The number of mitochondria, phagosome and granules of neutrophil decreased significantly.2.A significant swelling of mitochondria appeared in neutrophil. 3.The nucleus condensation of neutrophils was widely seen in extreme stage. 4.Endoplasmic reticula of neutrophil became dilated and some appeared degeneration
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图1 重型肝炎患者中性粒细胞的超微结构改变
观察发现20例患者中性粒细胞均有明显的超微结构异常，以极期患者最为显著，早期患者次之。与正常对照组相比大致有以下几类变化：(1)粒细胞表面突起及伪足普遍减少，且不规则，其内所含胞质稀少，少见吞噬泡存在。极期及部分早期患者细胞形态和大小欠均一，易见质膜和胞浆的较多部分外突而使细胞呈畸形，一些极期患者的细胞质膜有局限性模糊不清和缺损现象。(2)粒细胞胞浆均有不同程度改变，一些为胞质密度不均匀，部分胞质溶解、空化和呈凝固状。多数为整个细胞胞质疏松、水肿变性，部分细胞胞浆内出现大小不等、数目多寡不一的空泡。胞浆内所含细胞器明显减少，吞噬泡、低密度颗粒、致密颗粒等均显著减少，严重者胞浆内仅见到2～3个细胞颗粒。(3)粒细胞线粒体改变颇为突出。其数量显著减少，极期患者线粒体完全缺失现象多见。残留线粒体呈不同程度的退行性改变，包括灶性肿胀、嵴断裂、高度水肿及空泡化，部分空泡变的线粒体内见髓鞘样结构。(4)极期及多数早期患者粒细胞核浆比例下降，呈明显的核浓缩，部分甚至呈核固缩，染色质亦显著浓缩，电子密度极度，伴有核周间隙消失等改变。(5)粒细胞内的膜性管道系统变化不一 。有些患者细胞内微管数量增多，呈灶性聚集。有些内质网高度扩张，内含均一的细颗粒状物质，部分甚至扩张成大空泡，并伴膜结构的溶解消失和较多的髓鞘样结构。
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表1 中性粒细胞核面积测量和细胞器计数
Tab 1 The nuclear area measure and the organelles count of neutrophils Group
n
Nuclear
area(μm2)
Mitochondria
High density
granules
Low diensity granules
, 百拇医药 Control
15
51.2±8.6
8.2±3.1
9.6±3.4
42.7±9.6
Early stage
10
42.6±7.9*
4.5±2.4**
6.7±3.7
26.4±10.2**
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Extreme stage
10
33.4±10.1***
3.6±2.1**
5.8±2.9*
18.1±12.8*
*P<0.05， **P<0.01，vs control group ＃P<0.05， vs early stage group
二、核面积测量和细胞器计数结果(表1)：
由表1可见，重型肝炎早期时粒细胞核面积、细胞颗粒及线粒体就已低于正常对照组，除致密颗粒外，余均有统计学意义(P<0.05)。进入极期后，四项指标进一步下降，与对照组相差显著(P<0.05，P<0.01)。此外，极期与早期核面积之间也有显著差异(P<0.05)。讨 论
, 百拇医药
即往的研究证实，肝硬化等肝病患者粒细胞功能严重障碍，包括细胞脱粒，趋化、吞噬作用降低，过氧化物减少，炎性介质合成障碍等[3，4]，由于中性粒细胞在抵御细菌感染中起关键作用[5]，故上述粒细胞功能障碍是肝病患者易继发细菌感染的主要原因之一。本研究发现重型肝炎患者中性粒细胞有明显的超微结构异常，集中表现为粒细胞胞浆变性，细胞器减少、线粒体肿胀、细胞核浓缩等，这些改变与上述研究结果基本吻合，可视为肝病患者中性粒细胞功能异常的形态学证据，同时恰可解释重型肝炎患者临床过程中很高的细菌感染率。
Itoh等[6]发现，肝硬化患者中性粒细胞产生过氧离子能力的下降程度与肝功能障碍有相关关系，提示肝功能状态与粒细胞依氧性杀菌作用及其它细胞功能之间有一定的关系。我们在观察中注意到，重型肝炎患者中性粒细胞超微结构改变与肝衰竭分期基本一致，早期患者粒细胞改变已较明显，极期改变更为突出。提示中性粒细胞异常不仅可作为衡量重型肝炎患者预防感染能力的可靠指标，而且对重型肝炎患者病情及预后判断也有一定的参考价值。
, http://www.100md.com
已知酒精、营养不良、叶酸代谢失常以及骨髓抑制等均可引起粒细胞功能障碍，近来一些研究相继从乙型肝炎患者粒细胞中发现乙肝病毒[7]，鉴于多种病毒感染外周血细胞后可引起其细胞功能改变，故推测肝病时中性粒细胞的异常可能也与肝炎病毒直接或间接作用有关。上述研究似可说明肝病患者粒细胞改变系多种复杂因素长期慢性作用的结果，但尚不能完全解释重型肝炎时的中性粒细胞异常。由于重型肝炎是以肝衰竭为特征，病情严重者多发生多器官衰竭，其中严重的内毒素血症及复杂的免疫反应产物、免疫复合物等可作为血浆因素[8]而对细胞功能起直接抑制作用。故我们认为，中性粒细胞异常与肝衰竭之间可能存在着互为因果的关系，在重型肝炎患者粒细胞异常中，除其它因素外，肝衰竭本身可能起重要作用，确切的机理有待进一步深入研究。
(本研究承蒙本校基础部病理教研室刘友生教授帮助与指导，谨致谢意)
参考文献
, http://www.100md.com 1 Holdstock G, Leslie B, Hills C, et al. Monocyte function in cirrhosis. J Clin Pathol, 1982, 35:972.
2 Fernandez MA, Manifold IH, Fergusson L, et al. Neutrophil and monocyte phagocytosis in chronic liver disease. Clin Sci, 1982, 63:54.
3 Rajkovic IA, Williams S R. Abnormalities of neutrophil phagocytosis, intracellular killing, and metabolic activity in alcoholic cirrhosis and hepatitis. Hepatology, 1986, 6:252.
, 百拇医药
4 Laffi G, Carloni V, Baldi E, et al. Impaired superoxide anion, platelet-activating factor, and leukotriene B4 synthesis by neutrophils in cirrhosis. Gastroenterology, 1993, 105:170.
5 Konig WW, Schonfeld M, Raulf M, et al. The neutrophil and leukotrienes-role in health and disease. Eicosanoids, 1990, 3:1.
6 Itoh K, Nakao A, Kishimoto W, et al. Decreased production of active oxygen species by neutrophils in patients with liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Gastroenterol Jpn, 1993, 28:541.
, http://www.100md.com
7 Shen HD, Choo KB, Lee SD, et al. Hepatitis B virus DNA in leukocytos of patients with hepatitis B virus-associated disease. J Med Virol, 1986, 18:201.
8 DeMeo AN, Anderson BR. Defective chemotaxis associated a serum inhibitor in cirrhotic patients. N Engl J Med, 1972, 286:735.
收稿日期：1997年3月16日
修稿日期：1997年10月6日, 百拇医药