IL-6与登革病毒感染相互关系的实验研究
作者：曹艳英 郭辉玉
单位：曹艳英 暨南大学组织移植与免疫实验中心(广州 510632)；郭辉玉 中山医科大学微生物教研室
关键词：登革热病毒；单核细胞；白细胞介素6
IL 摘 要 目的：研究IL-6对登革Ⅱ型病毒(D2V)复制的影响以及细胞感染D2V后IL-6产生能力的变化。方法：以人单核细胞为感染模型，用微量蚀斑法测定病毒滴度，用ELISA法测定IL-6含量。结果：重组IL-6能增强D2V的复制，D2V感染能引起人单核细胞产生IL-6，它们的水平与D2V感染量正相关。结论：IL-6在登革病毒感染中起重要的作用。
Experimental study on interaction between IL-6 and dengue virus infection
, 百拇医药
CAO Yan-Ying，GUO Hui-Yu
Institute of Tissue Transplantation and Immunology,Jinan University,Guangzhou(510632)
Abstract AIM：To study the effect of IL-6 on D2V replication and production of IL-6 by D2V infected cells.METHOD：Human monocytes from normal peripheral blood and cord blood were used as D2V infected target cells.Plaque-forming test determinate D2V titration and ELISA analyze the production of IL-6.RESULT：IL-6 could enhance D2V replication in human monocytes.The production of IL-6 was increased by D2V infected cells and level of IL-6 was parallel to infected D2V concentration. CONCLUSION：IL-6 play an important role in dengue virus infection.
, http://www.100md.com
MeSH Dengue virus;Monocytes;Interleukin-6
登革病毒感染是世界热带与亚热带地区严重的公共卫生问题[1]。其发病机制迄今还没完全明了，近年注意到T细胞的激活和细胞因子的释放在发病中起重要作用[2]。有人报道登革病人血清中白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)水平升高[3]。IL-6对登革病毒复制的影响以及单核细胞感染病毒后IL-6的产生能力还很不清楚。本课题以人单核细胞为登革Ⅱ型病毒(D2V)感染的靶细胞来研究IL-6对病毒复制的影响以及感染的人单核细胞IL-6产生能力的变化，探讨IL-6在登革病毒感染中的作用。
材料与方法
1.重组人IL-6，美国Sigma公司产品。
2.病毒D2V标准株(New Guinea stain),本室自行传代保存。
, 百拇医药
3.IL-6检测试剂盒，Genzyme公司产品(购自深圳晶美生物工程公司)。
4.人单核细胞：取正常人外周血和脐带抗凝血，用淋巴细胞分层液分离出单个核细胞。PRMI 1640洗两遍后让细胞贴壁培养3d，去非贴壁细胞，用等量0.02%EDTA与20%FCS1640混合液消化15 min后收集贴壁细胞，用培养液洗两遍，细胞用于D2V感染。
5.D2V感染人单核细胞：取人单核细胞计数1×105/孔加入24孔板中，设四组，阴性对照组、IL-6低浓度组(1000 U/L)、中浓度组(104U/L)、高浓度组(105 U/L)。选择不同的时间加入IL-6：吸附前为IL-6与人单核细胞孵育24h，洗细胞两遍后再感染D2V；吸附同时为IL-6和病毒同时与人单核细胞孵育2 h,洗细胞两遍，吸附后为病毒吸附人单核细胞2 h后再加入IL-6。感染的人单核细胞用10%FCS1640培养，取48h感染上清测定病毒滴度。
, 百拇医药
6.病毒滴度的测定[4]：用D2V敏感的C6/36单层细胞与甲基纤维素复盖层的微量蚀斑法滴定D2V，病毒滴度以病毒空斑形成单位(Pfu/mL)表示。
7.统计学处理：每次实验取实验组与对照组，每例作两个平行孔。实验数据用平均值±标准差(
±s)表示，组间比较用t检验。并作直线回归分析。
结 果
一、人单核细胞感染性测定：
用5pfu/cell的D2V感染脐带血人单核细胞后，取不同时间的上清测定病毒滴度。结果表明病毒感染48 h后达高峰，以后逐渐下降(见图1)。正常人单核细胞感染D2V的实验结果与之相同。
, 百拇医药
二、IL-6对D2V复制的影响：
选择病毒感染的不同时间(吸附前、吸附同时、吸附后)加入IL-6作用于正常人单核细胞，取48 h感染上清测定病毒滴度。结果表明IL-6的低、中浓度在病毒吸附前和吸附后加入均能增加病毒的产量，在吸附的同时只有中浓度IL-6能增加病毒的产量，(见表1)。
表1 IL-6对人单核细胞中D2V复制的影响
Tab 1 Effect of IL-6 on D2V replication in human monocytes(103pfu/mL，±s,n=6)
, 百拇医药
IL-6
(×103U/L)
Before adsorption
During adsorption
After adsorption
Control
9.00±2.88
7.33±2.57
8.33±3.13
1
16.58±4.39*
, 百拇医药
7.92±2.90
16.00±4.95*
10
19.58±4.92*
10.50±3.46*
14.67±5.11*
100
8.53±2.50
7.83±1.61
8.67±4.79
*P<0.05，vs control
, 百拇医药
三、IL-6对未感染和感染的人单核细胞数量的影响：
用不同浓度的IL-6与未感染和感染的人单核细胞孵育24 h，用结晶紫染色法在490nm处测OD值。结果表明不同浓度IL-6对未感染和感染的人单核细胞数量无明显影响(P>0.05)。
四、人单核细胞感染D2V后IL-6产生能力的变化：
用20pfu/cell的D2V感染正常人单核细胞，取不同时间的上清测IL-6的量。结果表明感染D2V后4 h即产生IL-6，24 h达高峰以后下降，96 h维持在一定水平，感染24 h和96 h的IL-6水平与未感染的阴性对照有明显差异(P<0.05)(见图2)。
, 百拇医药
Fig 1 Detection of D2V titration by infected cord monocytes(±s,n=6) 图1 脐带血单核细胞感染D2V后病毒滴度测定
Fig 2 Changes of IL-6 production by D2V infected monocytes from normal peripheral blood (±s,n=6)--+--D2V infected -o- control
, http://www.100md.com
图2 正常人单核细胞感染D2V后IL-6产生能力的变化
Fig 3 IL-6 production by cord blood monocytes infected with different concentration of D2V (±s,n=6).
图3 不同感染量D2V感染脐带血单核细胞后IL-6产生能力的变化
五、不同感染量D2V感染人单核细胞后IL-6产生能力的变化：
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用不同感染量的D2V(0.1、5、20、50、100pfu/cell)感染脐带血单核细胞，取24h感染上清测IL-6。结果表明人单核细胞感染D2V后产生IL-6，IL-6的量与病毒感染量呈正相关，相关系数为r=0.8577(见图3)。
讨 论
IL-6是近年研究的与病毒感染密切相关的重要细胞因子之一。病毒感染诱导宿主细胞产生IL-6，IL-6反过来影响疾病的发生和发展。Becker等[5]的研究表明呼吸道合胞病毒(RSV)刺激肺胞巨噬细胞产生IL-6；Mcentee[6]的研究结果显示类人猿免疫缺陷病毒感染的单核细胞和激活的CD4+细胞产生IL-6；Rosenberg等[7]发现IL-6能增加HIV在巨噬细胞中的增殖[7]。类人猿免疫缺陷病毒感染猪后能引起急性致死性的疾病，血清中的IL-6明显升高[8]，提示IL-6参与病毒感染过程。最近有学者报道登革病毒感染病人血清中IL-6升高[3]，但IL-6与病毒复制的相互关系未作研究。本课题以人单核细胞为D2V感染靶细胞，研究了IL-6对D2V的影响以及病毒感染后细胞IL-6产生能力的变化。结果显示低、中浓度的IL-6能增加D2V的复制，高浓度的IL-6对D2V复制无明显影响，提示该细胞因子的作用存在负反馈；人单核细胞感染D2V后产生IL-6并与病毒量正相关。IL-6增加病毒的复制以及登革病毒引起IL-6产生的机理有待进一步阐明。我们的结果提示单核细胞感染D2V后产生IL-6，IL-6促进登革病毒感染与发病过程密切相关。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Halstead SB.Pathogenesis of dengue challenges to molecular biology.Science,1988,239:476.
2 Balkwill FR,Burke F.The cytokine network.Immunol Today,1989,10:299.
3 Didier Hober,Lucien Poli,Bertrand Roblin,et al.Serum levels of TNFα，IL-6 and IL-1β in dengue infected patients.Am J Trop Med Hyg,1993,48:324.
4 陈佩嘉，郭辉玉.登革病毒单克隆抗体和登革热病人血清对人单核细胞系U937的促进作用.中国临床和病毒学杂志，1988，2：20.
, 百拇医药
5 Becker S,Quay J Soukup J.Cytokine(TNFα，IL-6 and IL-8)production by respiratory syncytial virus-infected human alveolar macrophages.J Immunol,1991,147:4307.
6 Mcentee MF,Gorrell MD,Adams RJ,et al.TNF and IL-6 production during interaction between activated CD4+lymphocytes and simian immunodeficiency virus infected macrophages. J Gen Virol,1992,73:1107.
7 Rosenberg ZD,Fauci AS.Immunopathogenetic mechanisms of HIV infection:cytokine induction of HIV expression. Immunol Today,1990,11:176
8 Birx DL.Association of IL-6 in the pathogenesis of acutely fatal SIV/PBJ in pigtailed macaques. AIDS Res Hum Retroviruses,1993,9:1123.
收稿日期：1997年4月22日
修稿日期：1998年9月22日, 百拇医药
单位：曹艳英 暨南大学组织移植与免疫实验中心(广州 510632)；郭辉玉 中山医科大学微生物教研室
关键词：登革热病毒；单核细胞；白细胞介素6
IL 摘 要 目的：研究IL-6对登革Ⅱ型病毒(D2V)复制的影响以及细胞感染D2V后IL-6产生能力的变化。方法：以人单核细胞为感染模型，用微量蚀斑法测定病毒滴度，用ELISA法测定IL-6含量。结果：重组IL-6能增强D2V的复制，D2V感染能引起人单核细胞产生IL-6，它们的水平与D2V感染量正相关。结论：IL-6在登革病毒感染中起重要的作用。
Experimental study on interaction between IL-6 and dengue virus infection
, 百拇医药
CAO Yan-Ying，GUO Hui-Yu
Institute of Tissue Transplantation and Immunology,Jinan University,Guangzhou(510632)
Abstract AIM：To study the effect of IL-6 on D2V replication and production of IL-6 by D2V infected cells.METHOD：Human monocytes from normal peripheral blood and cord blood were used as D2V infected target cells.Plaque-forming test determinate D2V titration and ELISA analyze the production of IL-6.RESULT：IL-6 could enhance D2V replication in human monocytes.The production of IL-6 was increased by D2V infected cells and level of IL-6 was parallel to infected D2V concentration. CONCLUSION：IL-6 play an important role in dengue virus infection.
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MeSH Dengue virus;Monocytes;Interleukin-6
登革病毒感染是世界热带与亚热带地区严重的公共卫生问题[1]。其发病机制迄今还没完全明了，近年注意到T细胞的激活和细胞因子的释放在发病中起重要作用[2]。有人报道登革病人血清中白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)水平升高[3]。IL-6对登革病毒复制的影响以及单核细胞感染病毒后IL-6的产生能力还很不清楚。本课题以人单核细胞为登革Ⅱ型病毒(D2V)感染的靶细胞来研究IL-6对病毒复制的影响以及感染的人单核细胞IL-6产生能力的变化，探讨IL-6在登革病毒感染中的作用。
材料与方法
1.重组人IL-6，美国Sigma公司产品。
2.病毒D2V标准株(New Guinea stain),本室自行传代保存。
, 百拇医药
3.IL-6检测试剂盒，Genzyme公司产品(购自深圳晶美生物工程公司)。
4.人单核细胞：取正常人外周血和脐带抗凝血，用淋巴细胞分层液分离出单个核细胞。PRMI 1640洗两遍后让细胞贴壁培养3d，去非贴壁细胞，用等量0.02%EDTA与20%FCS1640混合液消化15 min后收集贴壁细胞，用培养液洗两遍，细胞用于D2V感染。
5.D2V感染人单核细胞：取人单核细胞计数1×105/孔加入24孔板中，设四组，阴性对照组、IL-6低浓度组(1000 U/L)、中浓度组(104U/L)、高浓度组(105 U/L)。选择不同的时间加入IL-6：吸附前为IL-6与人单核细胞孵育24h，洗细胞两遍后再感染D2V；吸附同时为IL-6和病毒同时与人单核细胞孵育2 h,洗细胞两遍，吸附后为病毒吸附人单核细胞2 h后再加入IL-6。感染的人单核细胞用10%FCS1640培养，取48h感染上清测定病毒滴度。
, 百拇医药
6.病毒滴度的测定[4]：用D2V敏感的C6/36单层细胞与甲基纤维素复盖层的微量蚀斑法滴定D2V，病毒滴度以病毒空斑形成单位(Pfu/mL)表示。
7.统计学处理：每次实验取实验组与对照组，每例作两个平行孔。实验数据用平均值±标准差(
±s)表示，组间比较用t检验。并作直线回归分析。结 果
一、人单核细胞感染性测定：
用5pfu/cell的D2V感染脐带血人单核细胞后，取不同时间的上清测定病毒滴度。结果表明病毒感染48 h后达高峰，以后逐渐下降(见图1)。正常人单核细胞感染D2V的实验结果与之相同。
, 百拇医药
二、IL-6对D2V复制的影响：
选择病毒感染的不同时间(吸附前、吸附同时、吸附后)加入IL-6作用于正常人单核细胞，取48 h感染上清测定病毒滴度。结果表明IL-6的低、中浓度在病毒吸附前和吸附后加入均能增加病毒的产量，在吸附的同时只有中浓度IL-6能增加病毒的产量，(见表1)。
表1 IL-6对人单核细胞中D2V复制的影响
Tab 1 Effect of IL-6 on D2V replication in human monocytes(103pfu/mL，
±s,n=6), 百拇医药
IL-6
(×103U/L)
Before adsorption
During adsorption
After adsorption
Control
9.00±2.88
7.33±2.57
8.33±3.13
1
16.58±4.39*
, 百拇医药
7.92±2.90
16.00±4.95*
10
19.58±4.92*
10.50±3.46*
14.67±5.11*
100
8.53±2.50
7.83±1.61
8.67±4.79
*P<0.05，vs control
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三、IL-6对未感染和感染的人单核细胞数量的影响：
用不同浓度的IL-6与未感染和感染的人单核细胞孵育24 h，用结晶紫染色法在490nm处测OD值。结果表明不同浓度IL-6对未感染和感染的人单核细胞数量无明显影响(P>0.05)。
四、人单核细胞感染D2V后IL-6产生能力的变化：
用20pfu/cell的D2V感染正常人单核细胞，取不同时间的上清测IL-6的量。结果表明感染D2V后4 h即产生IL-6，24 h达高峰以后下降，96 h维持在一定水平，感染24 h和96 h的IL-6水平与未感染的阴性对照有明显差异(P<0.05)(见图2)。
, 百拇医药
Fig 1 Detection of D2V titration by infected cord monocytes(
±s,n=6) 图1 脐带血单核细胞感染D2V后病毒滴度测定Fig 2 Changes of IL-6 production by D2V infected monocytes from normal peripheral blood (
±s,n=6)--+--D2V infected -o- control, http://www.100md.com
图2 正常人单核细胞感染D2V后IL-6产生能力的变化
Fig 3 IL-6 production by cord blood monocytes infected with different concentration of D2V (
±s,n=6).图3 不同感染量D2V感染脐带血单核细胞后IL-6产生能力的变化
五、不同感染量D2V感染人单核细胞后IL-6产生能力的变化：
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用不同感染量的D2V(0.1、5、20、50、100pfu/cell)感染脐带血单核细胞，取24h感染上清测IL-6。结果表明人单核细胞感染D2V后产生IL-6，IL-6的量与病毒感染量呈正相关，相关系数为r=0.8577(见图3)。
讨 论
IL-6是近年研究的与病毒感染密切相关的重要细胞因子之一。病毒感染诱导宿主细胞产生IL-6，IL-6反过来影响疾病的发生和发展。Becker等[5]的研究表明呼吸道合胞病毒(RSV)刺激肺胞巨噬细胞产生IL-6；Mcentee[6]的研究结果显示类人猿免疫缺陷病毒感染的单核细胞和激活的CD4+细胞产生IL-6；Rosenberg等[7]发现IL-6能增加HIV在巨噬细胞中的增殖[7]。类人猿免疫缺陷病毒感染猪后能引起急性致死性的疾病，血清中的IL-6明显升高[8]，提示IL-6参与病毒感染过程。最近有学者报道登革病毒感染病人血清中IL-6升高[3]，但IL-6与病毒复制的相互关系未作研究。本课题以人单核细胞为D2V感染靶细胞，研究了IL-6对D2V的影响以及病毒感染后细胞IL-6产生能力的变化。结果显示低、中浓度的IL-6能增加D2V的复制，高浓度的IL-6对D2V复制无明显影响，提示该细胞因子的作用存在负反馈；人单核细胞感染D2V后产生IL-6并与病毒量正相关。IL-6增加病毒的复制以及登革病毒引起IL-6产生的机理有待进一步阐明。我们的结果提示单核细胞感染D2V后产生IL-6，IL-6促进登革病毒感染与发病过程密切相关。
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参考文献
1 Halstead SB.Pathogenesis of dengue challenges to molecular biology.Science,1988,239:476.
2 Balkwill FR,Burke F.The cytokine network.Immunol Today,1989,10:299.
3 Didier Hober,Lucien Poli,Bertrand Roblin,et al.Serum levels of TNFα，IL-6 and IL-1β in dengue infected patients.Am J Trop Med Hyg,1993,48:324.
4 陈佩嘉，郭辉玉.登革病毒单克隆抗体和登革热病人血清对人单核细胞系U937的促进作用.中国临床和病毒学杂志，1988，2：20.
, 百拇医药
5 Becker S,Quay J Soukup J.Cytokine(TNFα，IL-6 and IL-8)production by respiratory syncytial virus-infected human alveolar macrophages.J Immunol,1991,147:4307.
6 Mcentee MF,Gorrell MD,Adams RJ,et al.TNF and IL-6 production during interaction between activated CD4+lymphocytes and simian immunodeficiency virus infected macrophages. J Gen Virol,1992,73:1107.
7 Rosenberg ZD,Fauci AS.Immunopathogenetic mechanisms of HIV infection:cytokine induction of HIV expression. Immunol Today,1990,11:176
8 Birx DL.Association of IL-6 in the pathogenesis of acutely fatal SIV/PBJ in pigtailed macaques. AIDS Res Hum Retroviruses,1993,9:1123.
收稿日期：1997年4月22日
修稿日期：1998年9月22日, 百拇医药