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编号:10271350
免疫调节剂对大鼠巨噬细胞脂质过氧化物和酸性磷酸酶的影响
http://www.100md.com 《中国病理生理杂志》 1999年第2期
     作者:吕建新 金丽琴 陈国荣 陈希贤 陆永绥 蔡 勤

    单位:吕建新 陈希贤 陆永绥 温州医学院检验医学系(温州325027);金丽琴 温州医学院基础部生化教研室;陈国荣 温州医学院基础部病理教研室;蔡 勤 中国科学院上海生物工程研究中心

    关键词:过氧化脂质类;酸性磷酸酶;巨噬细胞;佐剂;免疫

    中国病理生理杂志990212 摘要 目的和方法:用生理盐水灌洗大鼠的腹腔和肺泡,收集腹腔与肺泡巨噬细胞,37℃培养2 h后测定脂质过氧化物的含量和酸性磷酸酶的活力。结果:腹腔和肺泡巨噬细胞内脂质过氧化物的水平与酸性磷酸酶的活力均可被环磷酰胺和细脚拟青霉所调节,其中环磷酰胺使脂质过氧化物水平升高,酸性磷酸酶活力降低,细脚拟青霉则反之,使脂质过氧化物水平下降,酸性磷酸酶活力升高。结论:巨噬细胞内脂质过氧化物水平与酸性磷酸酶活力呈负相关,且可被免疫抑制剂和免疫激活剂所调节。
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    Effects of immunomodulators on lipid peroxides level and

    acid phosphatase activity in macrophages of rats

    LU Jian-Xin, JIN Li-Qin, CHEN Guo-Rong, CHEN Xi-Xian, LU Yong-Sui, CAI Qin

    Department of Clinical Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College, Wenzhou (325027)

    Abstract AIM and METHODS:The relation and regulation of lipid peroxides (LPO) level and acid phosphatase (ACP) activity in peritoneal macrophage (PMΦ) and alveolar macrophage (AMΦ) of rats were studied. After PMΦ and AMΦ of rats were irrigated by normal saline and collected by centrifuge and 2 h in a humidified incubator at 37 ℃, LPO level and ACP activity in PMΦ and AMΦ were detected by biochemical methods. RESULTS: The ACP activity was decreased, while the LPO level was increased in the PMΦ and AMΦ of rats administered with cyclophosphamide. However, the ACP actvity was increased, while the LPO level was decreased in the PMΦ and AMΦ of rats administered orally with paecilomyces tenuipes water extract .CONCLUSION: The level of LPO was negatively related to the activity of ACP, and it was regulated by immunomodulators.
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    MeSH Lipid peroxides; Acid phosphatase; Macrophages; Adjurants, immunologic

    脂质过氧化物(lipid peroxides, LPO)被认为是由细胞膜相结构中的多不饱和脂肪酸过氧化而产生的,有研究报道LPO可能是一种非特异性的免疫抑制剂[1]。酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)被认为是巨噬细胞(macrophages, MΦ)的标志酶,ACP活力的高低反映了MΦ被激活的程度[2]。本文拟研究大鼠腹腔巨噬细胞(perritoneal macrophage, PMΦ)和肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage, AMΦ)内LPO水平与ACP活力的相关性,以及免疫抑制剂环磷酰胺与免疫激活剂细脚拟青霉(paecilomyces tenuipes,PT)对LPO水平与ACP活力的调控作用。

    材料和方法
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    1.细脚拟青霉及其水提取物制备:细脚拟青霉由浙江省科学院亚热带作物研究所陈祝安研究员培养提供。取该菌菌丝体干粉,加适量双蒸馏水置沸水浴中回流提取3次,每次20min,合并3次滤液并用双蒸馏水稀释成20%浓度(W/V)的菌丝体水提取物,经蔡氏滤器0.45μm微孔滤膜(无菌)过滤后分装备用。

    2.动物分组及处理:采用SD大鼠40只(由本院实验动物室提供)。体重(207.8±19.1) g,随机均分为4组,每组雌雄各半,分笼饲养。NS组(normal saline)为正常对照组,每只每天用1mL生理盐水灌胃:PT组,每只每天用1mL 20% PT菌丝体水提取物灌胃;CP组(cyclophosphamide,环磷酰胺),每只每天用1mL NS 灌胃,d 15起给环磷酰胺(ip),剂量为20mg/kg体重,每天1次,连续7d;PTCP组(paecilomyces tenuipes+cyclophosphamide)为细脚拟青霉加环磷酰胺组,每只每天用1mL 20%PT菌丝体水提取物灌胃,d 15起同CP组给环磷酰胺(ip)。各组大鼠在同等条件下用复合饲料饲养21d。
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    3.PMΦ与AMΦ的灌洗与培养:股动脉放血处死大鼠,无菌室内常规消毒后,每只大鼠腹腔注射灭菌的NS 20mL,轻轻按揉腹部3 min后,抽回腹腔液15mL,2000r/min离心15min,收集沉淀的PMΦ;然后,每只大鼠经气管内注入灭菌的NS 5mL,抽回约4mL,重复5次,合并后于2000 r/min离心15min,收集沉淀的AMΦ;PMΦ和AMΦ均用Hanks液洗涤1次,再用含10%小牛血清的RPMI 1640细胞培养液调节MΦ浓度至2×106/mL,并以每瓶2mL分装后置37℃培养箱培养2h,弃上清及非贴壁的细胞,贴壁的即为MΦ。

    4.LPO含量测定:取上述贴壁的PMΦ与AMΦ,用Hanks液轻轻洗涤1次后,每瓶加双蒸馏水2 mL,经-30℃、+30℃反复冻融5次,每次30min,制成破碎的MΦ悬液,取破碎的MΦ悬液0.3 mL加入0.67%硫代巴比妥酸醋酸溶液2.5mL,充分摇匀后置沸水浴30min,流水冷却后加正丁醇2.5 mL,充分摇匀后置722分光光度计于532nm波长下比色测定[3]
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    5.ACP活力测定:取上述破碎的MΦ悬液0.5mL,以磷酸苯二钠为底物,4-氨基安替比林及铁氰化钾为显色剂测定[4]。ACP活力单位定义为:每升破碎的MΦ悬液(2×109个MΦ)在37℃、pH 4.9的条件下与磷酸苯二钠作用60min产生1mg酚为1个活力单位(U)。

    6.主要试剂:TEP(1,1,3,3-tetraethoxypropane)、RPMI 1640细胞培养液均购自Sigma公司,硫代巴比妥酸(CP)由上海第二化工厂生产,正丁醇(AR.)由杭州双林化工试剂厂生产,环磷酰胺由上海第十二制药厂生产(批号为940508),其余均为国产分析纯试剂。

    7.数据统计:数据用±s表示,用t检验分析各组间差异的显著性,并作LPO与ACP间的相关性分析。
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    结 果

    一、PMΦ内LPO与ACP的相关性及调节:

    表1所示的是各组大鼠PMΦ内LPO水平与ACP活力单位,经相关性分析表明各组大鼠PMΦ内LPO水平与ACP活力之间均呈显著的负相关,相关系数分别为rNS=-0.939(P<0.01)、rPT=-0.942(P<0.01)、rCP=-0.977(P<0.01)、rPTCP=-0.785(P<0.05)。表1的数据还显示:环磷酰胺可导致PMΦ内LPO水平显著升高,ACP活力单位显著地下降;细脚拟青霉不仅对环磷酰胺所致的PMΦ内LPO水平升高和ACP活力下降具有抑制作用,而且对正常大鼠PMΦ内LPO水平与ACP活力也具有调节作用,表现为使LPO水平下降和使ACP活力显著地升高。

    表1 腹腔巨噬细胞内脂质过氧化物水平与酸性磷酸酶活力
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    Tab 1 The level of lipid peroxides and the activity of acid

    phosphatase in the peritoneal macrophage (±s,n=10) Group

    Lipid peroxides(nmol/L)

    Acid phosphatase(U)

    NS

    46.1±12.7

    4.72±1.12

    PT
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    32.5±10.5*

    7.96±1.74**

    CP

    58.4±11.3*

    2.20±1.12**

    PTCP

    40.7±10.8△△

    4.74±1.26△△

    *P<0.05, **P<0.01, vs NS group;

    △△P<0.01, vs CP group
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    二、AMΦ内LPO与ACP的相关性及调节:

    表2所示的是各组大鼠AMΦ内LPO水平与ACP活力单位,经相关性分析表明,各组大鼠AMΦ内LPO水平与ACP活力之间也呈显著的负相关,相关系数分别为rNS=-0.981(P<0.01)、rPT=-0.986(P<0.01)、rCP=-0.998(P<0.01)、rPTCP=-0.979(P<0.01)。表2的数据也显示:环磷酰胺(ip)可引起大鼠AMΦ内LPO水平显著升高而ACP活力显著降低;细脚拟青霉不仅可阻止环磷酰胺对AMΦ内LPO的上调和ACP的下调作用,而且对正常大鼠AMΦ也具有调节作用,表现为使LPO水平显著降低而ACP活力显著升高。

    表2 肺泡巨噬细胞内脂质过氧化物水平与酸性磷酸酶活力

    Tab 2 The level of lipid peroxides and the activity of
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    acid phosphatase in the alveolar macrophage (±s,n=10) Group

    Lipid peroxides(nmol/L)

    Acid phosphatase(U)

    NS

    53.2±14.4

    5.76±1.36

    PT

    30.4±16.3**

    8.14±1.40**
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    CP

    77.2±25.0*

    4.18±1.52**

    PTCP

    51.2±15.4

    5.66±1.16△△

    *P<0.05, **P<0.01, vs NS group;

    P<0.05, vs CP group讨 论

    MΦ是一种具有多种功能的免疫细胞,不仅参与机体的特异性免疫反应和非特异性免疫反应,而且还参与机体的抗肿瘤免疫监视作用。但在正常情况下,MΦ处于休止状态,活力较低,即处于未激活状态。有研究表明:未激活的MΦ不但不能杀伤肿瘤细胞,而且还会促进肿瘤细胞在体内的增殖、转移及帮助肿瘤细胞逃避激活的MΦ的免疫监视作用,只有激活的MΦ能抑制肿瘤细胞的生长、转移,并且有强大的胞内杀菌作用和胞外溶瘤作用[5,6]。因此,可以认为MΦ的激活是MΦ实现其多种功能的基础。
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    由于MΦ内ACP活力被免疫抑制剂下调,被免疫激活剂上调,因此MΦ内的ACP被认为是MΦ激活的标志[2,7]。本研究显示的环磷酰胺可使MΦ内ACP活力降低,细脚拟青霉可使MΦ内ACP活力升高的结果,也证实了MΦ的激活受免疫抑制剂和免疫增强剂的调节。

    MΦ在物质代谢过程中可产生大量的O2-和H2O2,当MΦ被激活时,O2-和H2O2被释放出来[8],通过O2-和H2O2使肿瘤细胞或微生物细胞的膜相结构中的多不饱和脂肪酸过氧化产生LPO,导致膜相结构的破坏,从而起到溶瘤或杀菌的作用,这可能是激活的MΦ实现其非特异性免疫功能的机制之一,然而,当MΦ未被激活时,代谢产生的O2-和H2O2不能释放,于是堆集在MΦ内,结果使细胞内的膜相结构中的多不饱和脂肪酸发生过氧化,产生LPO[8,9]。在本研究中环磷酰胺可使MΦ内LPO水平升高,这可能就是由于环磷酰胺抑制了MΦ的激活之故,而细脚拟青霉使MΦ内LPO水平降低是因为细脚拟青霉激活了MΦ。
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    在实验中发现MΦ内LPO水平与ACP活力之间呈明显负相关。环磷酰胺和细脚拟青霉均可调节MΦ内LPO水平和ACP活力,但不改变LPO与ACP间的相关性,此外,在PMΦ和AMΦ中LPO与ACP间的相关性未见差异。鉴于本研究的结果,我们认为MΦ内LPO水平可以作为评判MΦ是否被激活的另一标志物。

    *浙江省教委、省卫生厅科研基金资助

    参考文献

    1 杨振中,苗健.脂质过氧化与瘤宿主的免疫抑制.中国免疫学杂志,1986,2(6):347.

    2 吕建新,陈国荣,金丽琴,等.蜂花粉对小鼠腹腔巨噬细胞酶活性的影响.免疫学杂志,1993,9(2):94.

    3 吕建新,金丽琴,胡云良,等.蜂花粉水提取物对实验性胃粘膜GSH与LPO水平变化的影响.中国病理生理杂志,1996,12(5):478.
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    4 金丽琴,吕建新,胡云良,等.细脚拟青霉对大鼠血清及组织中脂质过氧化物和还原型谷胱甘肽水平的影响.中国病理生理杂志,1997,13(4):379.

    5 Fidler IJ. The in situ induction of tumoricidal activity in alveolar macrophages by liposmes containing muramyl dipeptide is a thymus-independent process. J Immunol, 1981, 127:1719.

    6 Fishman M, Gunther G. Induction of tumor cell resistance to macrophage-mediated lysis by preexposure to non-activated macrophages. Cell Immunol, 1986, 99:241.
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    7 Cohn ZA. The activation of mononuclear phagocytes:Fact, fancy, and future. J Immunol, 1978, 121:813.

    8 Wing EJ, Ampel NM, Waheed A, et al. Macrophage colonystimulating factor (M-CSF) enhances the capacity of murine macrophages to secrete oxygen reduction products. J Immunol, 1985, 135:2052.

    9 Drath DB, Karnovsky ML. Superoxids production by phagocytic leukocytes. J Exp Med, 1975, 141:257.

    收稿日期:1997年1月29日

    修稿日期:1997年9月4日, http://www.100md.com