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编号:10271351
谷氨酰胺对缺氧复氧损伤人小肠上皮细胞谷胱甘肽的影响
http://www.100md.com 《中国病理生理杂志》 1999年第2期
     作者:戴定威 吴圣楣 戚秋芬 李 敏 陈惠金 蔡 威

    单位:上海市儿科医学研究所 上海第二医科大学附属新华医院(上海200092)

    关键词:肠;小;上皮;细胞;低氧;谷氨酰胺;丙二醛

    中国病理生理杂志990211 摘 要 目的:探讨谷氨酰胺(GLN)对缺氧复氧损伤人小肠上皮细胞(IEC)内还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的影响。方法:采用原代培养人IEC作为实验模型,用荧光法测定体外培养IEC内GSH和MDA含量。结果:正常对照组GSH含量最高,在对照组加入GLN并不影响GSH含量(P>0.05)。缺氧60 min或90 min复氧30 min损伤IEC细胞内GSH含量均显著低于正常对照组(P<0.05),预先应用GLN可显著阻止缺氧复氧损伤IEC细胞GSH含量下降(P<0.05)。相反,正常对照组MDA含量最低,缺氧60 min复氧30 min IEC细胞内MDA水平显著高于正常对照组(P<0.01),预先应用GLN可显著降低缺氧复氧损伤IEC细胞内MDA水平(P<0.05)。结论:补充GLN可维持缺氧复氧损伤IEC细胞GSH水平,减轻细胞膜脂质过氧化。
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    Effects of glutamine on intracellular reduced glutathione in cultured human intestinal epithelial cells with anoxia/reoxygenation

    DAI Ding-Wei, WU Sheng-Mei, QI Qiu-Fen, LI Min, CHEN Hui-Jin, CAI Wei

    Shanghai Institute for Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai (200092)

    Abstract AIM:To study the effects of glutamine on intracellular reduced glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) in cultured human intestinal epithelial cells with anoxia/reoxygenation (A/R) in vitro.METHODS: Human intestinal epithelial cells in primary culture was used as a model and intracellular GSH and MDA were determined by using fluorometric method.RESULTS: Normal control group had the highest GSH level and there was no difference between NS vs 2 mmol/L glutamine group (P>0.05)。 With 60 min or 90 min of anoxia followed 30 min of reoxygenation, GSH levels were significantly lowered in NS groups compared to those in glutamine groups (P<0.05). Normal control group had the lowest MDA level. With 60 min of anoxia followed 30 min of reoxygenation, MDA level was significantly higher in A/R group compared to that in glutamine group (P<0.05). CONCLUSIONS: Glutamine supplementation might partially preserve GSH levels and lessen lipid peroxidation of cell membrane in human IEC during A/R in vitro.
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    MeSH Intestine, small; Epithelium; Cells; Anoxia; Glutamine; Malondialdehyde

    缺血所致小肠损伤的主要原因之一是再灌注时生成氧自由基(oxygen free radical, OFR),OFR直接和多聚不饱和脂肪酸作用导致细胞膜脂质过氧化和细胞死亡[1]。还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)是机体抗OFR损伤的重要物质。谷氨酰胺(glutamine, GLN)是合成GSH的必需物质,肠上皮通过代谢GLN生成大量合成GSH的前体物质谷氨酸,因此,GLN可能是通过维持细胞内GSH水平而发挥细胞保护作用。本实验采用原代培养人胎小肠上皮细胞(intestinal epithelial cell, IEC),观察GLN对缺氧复氧(anoxia/reoxygenation, A/R)损伤人IEC细胞内GSH水平和细胞膜脂质过氧化的影响。

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    一、材料:

    1.试剂和药品:粗胶原酶Ⅺ型、胰蛋白酶、表皮生长因子、胰岛素、肝素、山梨醇、邻苯二甲醛(o-phthaladehyde, OPT)等为Sigma产品,Dulbecco改良Eagle氏培养基、胎牛血清、谷胺酰胺(glutamine, GLN)为Gibco产品,中性蛋白酶Ⅰ型(Boehringer mannheim,德国),青霉素(上海第二制药厂),链霉素(上海第三制药厂),硫代巴比妥酸、1,1,3,3-四甲氧基丙烷均为Fluka AG Buchs公司产品。

    2.实验仪器:Queue细胞培养箱(Queun Systems, USA),RF-540型荧光分光光度计(日本)。

    二、方法:

    1.IEC细胞培养:采用本实验室建立的人胎IEC分离培养方法[2]
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    2.缺氧复氧模型的复制:取原代培养d 10, IEC,以质量分数为0.25%胰蛋白酶消化,离心洗涤去胰蛋白酶,细胞用新鲜培养液稀释为2×109/L。台盼蓝染色细胞存活率为98%。再种植在24孔板中,每孔1 mL细胞悬液。按文献方法造成IEC缺氧复氧损伤[3]。即吸去24孔内90%培养液,以减少气体弥散距离,剩余培养液能维持细胞存活。将之置入一密闭容器中,负压抽吸其中空气,换入纯氮气,密闭后置入培养箱中培养60min或90 min(缺氧),再取出24孔板,加培养液至原含量,将之置入培养箱中培养30min(复氧)。对照组细胞直接置培养箱中培养,培养箱条件均为37℃、体积分数为95% O2、5%CO2

    3.实验分组:实验设正常对照组、缺氧60min复氧30min损伤组(简称A/R 60min)、缺氧90min复氧30min损伤组(A/R 90min),其中各组又设生理盐水(NS)对照组和GLN处理组,每组4孔。各组在缺氧复氧损伤前分别加入GLN (2mmol/L)或等量生理盐水。
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    4.GSH含量测定:取0.5mL细胞悬液,用荧光法测定IEC细胞内GSH含量,参考沈惠麒等方法略加修改[4]

    5.MDA含量测定:TBA荧光法[5],测定条件λex=515nm,λem=550nm。

    6.统计分析:实验数据均以±s表示,组间差异比较采用双侧t检验(a=0.05)。

    结 果

    (一)结果见表1。在培养液中加入2 mmol/L GLN对无缺氧复氧损伤IEC细胞GSH含量无影响。缺氧60 min复氧30 min后IEC细胞内GSH含量显著低于无缺氧复氧损伤IEC细胞GSH含量,GLN处理组GSH含量显著高于缺氧复氧组。缺氧90 min复氧30 min后IEC细胞内GSH含量进一步下降,但加入GLN组GSH含量显著高于缺氧复氧组。
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    表1 GLN对缺氧复氧损伤IEC细胞GSH的影响

    Tab 1 Effects of GLN on intracellular GSH in human IEC with

    anoxia/reoxygenation (μg/106 cells, ±s,n=4) Control group

    A/R group

    A/R 60 min

    A/R 90 min

    NS

    10.64±2.08
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    7.01±1.29

    6.10±1.09

    GLN

    10.68±2.24

    8.55±1.32

    8.12±1.23

    P<0.05,vs control group

    (二)缺氧60min复氧30min后IEC细胞内MDA含量显著高于对照组(1.41±0.12 vs 1.08±0.10,P<0.01),预先应用GLN组MDA水平显著低于缺氧复氧组(1.21±0.11 vs 1.41±0.12 P<0.05)。
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    讨 论

    在小肠缺血再灌注时,氧在多种酶(黄嘌呤氧化酶、NADPH、细胞色素、P-450 还原酶等)的催化下发生电子还原,生成超氧阴离子(O2)并衍生出一系列的氧自由基,这些自由基,特别是高度活泼的*OH,可导致脂质过氧化和/或使细胞某些酶活性丧失,引起细胞或组织损伤。GSH在细胞抗氧化损伤中起着极重要的作用。谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-px)催化GSH和H2O2反应生成H2O,使得O2通过中间体H2O2生成高度活性的膜过氧化剂*OH这个链被打断,从而保护细胞免受OFR的毒性损伤。GSH-px对H2O2的还原比过氧化氢酶更重要,后者只局限于细胞过氧化氢酶体部位。GSH还可直接和高活性OFR反应,不需要酶的催化。GSH在还原OFR的同时自身被氧化为GSSG,后者又通过GSSG还原酶的催化还原为GSH,以保持细胞内硫醇的平衡。缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, I-R)组织细胞内GSH显著下降[6~8],并发现,I-R组织细胞损伤程度和缺血前细胞内GSH量成反比[6,7]。静脉注射GSH可提高细胞内GSH水平,可明显减轻再灌注组织细胞的损伤[6]
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    GSH是谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的三肽。谷氨酸不能通过细胞膜,而GLN易于通过细胞膜,是细胞内谷氨酸的来源[7]。最近研究发现GLN缺乏可直接导致细胞GSH水平下降[7]。静脉或口服GLN可减轻放疗、化疗等病理状态下肠粘膜的损伤[9]。GLN对肠粘膜保护作用的机制尚不清楚,但可能与维持细胞抗氧化防御机制有关。离子辐射和一些化疗药物通过增强氧化剂的活性而损伤细胞。辐射所生成的OFR可直接作用于DNA而诱发细胞的损伤。组织对辐射的敏感性与组织细胞GSH含量成反比[10]。GSH量的变化也影响一些化疗药物(如阿霉素、博莱霉素等)的细胞毒性。这些资料提示:GLN通过维持细胞GSH水平而发挥保护细胞抗氧化损伤的作用。Hong等观察到补充GLN与组织中GSH量直接相关,并减轻肝脏组织氧化损伤,增加动物生存率[7]。Harward等报道补充GLN可明显增加I-R损伤小肠粘膜细胞GSH含量[8]

, 百拇医药     本实验结果显示:缺氧复氧损伤使IEC细胞内GSH含量显著下降,体外应用GLN可部分维持IEC细胞内GSH水平,并减轻缺氧复氧诱发的细胞膜脂质过氧化。表明:提供GLN有益于减轻小肠I-R损伤,GLN是否对严重的小肠I-R损伤具有防治作用尚需进一步研究。

    *上海市高等学校青年科学基金资助(96QB43)

    参考文献

    1 Schoenberg MH, Berger HG. Reperfusion injury after intestinal ischemia. Crit Care Med, 1993, 137:6.

    2 戴定威,吴圣楣,廖贤平,等.人胎小肠上皮细胞体外培养研究.上海第二医科大学学报,1996, 16:321.

    3 Batych RE, Chuknyiska RS, Balkley GB, et al. The primary localization of free radical generation after anoxia/reoxygenation in isolated endothelial cells. Surgery, 1987, 102:122.
, http://www.100md.com
    4 沈惠麒,赵利英,曲青山,等.组织中谷胱甘肽的荧光测定法.中华劳动卫生职业病杂志,1988,6:103.

    5 翁玉椿,王秀平,卢泳才,等.细胞和细胞膜内过氧化脂质的微量定量.细胞生物学杂志,1985,7:142.

    6 Jennische E. Possible influence of glutathione on postischemic liver injury. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand, 1984, 92:55.

    7 Hong RW, Rounds JD, Helton WS, et al. Glutamine preserves liver glutathione after lethal hepatic injury. Ann Surg, 1991, 215:114.
, http://www.100md.com
    8 Harward TS, Coe D, Souba WW, et al. Glutamine preserves gut glutathione levels during intestinal ischemia/reperfusion. J Surg Res, 1994, 56:351.

    9 戴定威,吴圣楣.谷胺酰氨在肠道的代谢及其对肠粘膜的保护作用.国外医学临床生物化学与检验学分册,1995,16:253.

    10 Bump EA, Yu NY, Brown JM. Radiosensitization of hypoxic tumor cells by depleting intracellular glutathione. Science, 1983, 217:544.

    收稿日期:1997年4月1日

    修稿日期:1998年3月3日, 百拇医药