重组EB病毒BHRF1蛋白对裸鼠脾细胞程序性死亡的抑制作用
作者：朱振宇 谢强 潘景轩 戴克胜 张清秀 马涧泉
单位：戴克胜 张清秀 马涧泉 朱振宇 中山医科大学生物化学教研室；谢 强 潘景轩 中山医科大学 病理生理学教研室 (广州 510089)
关键词：细胞死亡；地塞米松；小鼠；裸；爱波斯坦-巴尔病毒
中国病理生理杂志990209 摘 要 目的：观察适当浓度的EBV-BHRF 1重组蛋白(rBHRF1)抽提液有无拮抗裸鼠脾细胞程序性死亡(PCD)作用。方法：用1×10-6mol/L地塞米松作用18 h、43℃加热10 min及无血清培养48 h等方法诱导脾细胞发生PCD，预先加入终浓度为2mg/L的rBHRF1蛋白起拮抗作用。结果：未加rBHRF1的对照组细胞发生典型的PCD，即细胞DNA的电泳出现PCD特征性的梯形(ladder)DNA降解片段；电镜观察显示核凝缩，但细胞膜及细胞器结构基本保持正常。若与适当浓度的rBHRF1预培养8 h，再用上述方法处理，则因有重组蛋白的保护而未出现DNA降解片段及PCD的形态学变化。结论：初步显示rBHRF1具有抑制脾细胞发生PCD的功能。
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Apoptosis in nude mice spleen cells was inhibited by recombinant EBV-BHRF1 protein
ZHU Zhen-Yu, XIE Qiang, PAN Jing-Xuan, DAI Ke-Sheng, ZHANG Qing-Xiu,MA Jian-Quan
Department of Biochemistry, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou (510089)
Abstract AIM：To observe if recombinant EBV-BHRF1 protein(rBHRF1) could inhibit the programmed cell death (PCD) of nude mice spleen cells. METHODS: PCD models of nude mice spleen cells were set up by induction under 3 factors, i.e.①cultured with 1×10-6mol/L dexmethasone for 24 h, ②43℃ for 10 min and ③in the absence of fetal calf serum for 48 h. And 2mg/L(terminal concentration) rBHRF1 was added 8h before the 3 kind of PCD induction factors. RESULTS: Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from the model cells showed the typical oligonucleosomal pattern of PCD. The cell's chromatin condensed, but cell membrane and mitochondrial were preserved under electron microscopy. PCD of nude mice spleen cells could be inhibited when the cells were cultured with a proper concentration of rBHRF1 for 8 h previously. CONCLUSION: rBHRF1 could suppress the PCD induced by these 3 factors.
, 百拇医药
MeSH Cell death; Dexamethasone; Mice, nude; Epstein-Barr virus
程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，又称凋亡(apoptosis)，是目前非常活跃的研究领域之一[1]。Bcl-2基因产物能拮抗多种因素引起的PCD[2]。EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)与人类的多种疾病密切相关，如以珠江流域为高发中心的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)、伯基特淋巴瘤及传染性单核细胞增多症等。EBV的BHRF1基因产物与Bcl-2有38%同源性，在细胞内的定位也相似[3]，但其重组的原核表达产物是否具有抑制多种诱导因素所引起的免疫细胞PCD作用尚未见报道。本室根据EBV全基因序列[4]用PCR方法获得了EBV的BHRF1全基因片段(592bp)，克隆于pBV 221载体，并获得原核表达产物重组EBV-BHRF1蛋白质(rBHRF1)[5]。本研究观察该rBHRF1提取液对地塞米松(dexamethasone, DEX)、43℃加热及无小牛血清培养所诱导的裸鼠脾细胞凋亡的影响。
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材料与方法
(一)实验材料：1.实验动物：6周龄的BALB/c系裸鼠，共18只(每次6只，重复2次实验)，雌雄兼用，购于本校实验动物中心，在该中心无特殊病原体(specific-pathogen free, SPF)条件下喂养。2.DEX.为Sigma公司产品。3.RPMI-1640培养液，购于Gene公司。
(二)实验方法：1.无菌取脾，按常规方法制备脾细胞，细胞终浓度为3×106个/mL，经台盼蓝染色检查，死细胞小于5%，分成3组(各分实验组和对照组)备用。2.实验组加入重组蛋白抽提液(终浓度为2mg/L)，而对照组加入不含BHRF1片段的空白质粒转化的菌体抽提液。在37℃，体积分数为5% CO2培养8h后，第一组加1×10-6mol/L地塞米松作用，继续培养18h[6]；第二组在43℃作用10min；第三组在无小牛血清培养液中继续培养48h，常规方法收集各组细胞。3.DNA裂解片段抽提方法及常规透射电镜检测参见朱振宇等[6]及潘景轩等[7]方法。
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结 果
(一)裸鼠脾细胞PCD模型的建立：在10-6mol/L地塞米松作用18h、43℃加热10min及无血清培养48h等方法处理后，抽提细胞DNA，经琼脂糖凝胶电泳显示均出现PCD特征性的梯形(ladder)DNA降解片段，片段大小为180bp或其整倍数(见图1)。常规透射电镜下观察，细胞核凝缩，细胞膜及线粒体膜等结构基本保持完整，但未见有凋亡小体出现(见图2A)。而加入rBHRF1的细胞结构则基本保持正常(见图2B)。
(二)rBHRF1对裸鼠脾细胞PCD的影响：实验组因有rBHRF1的保护，其DNA降解片段明显少于各对照组(图3)，也很少出现上述PCD形态学变化。初步表明rBHRF1提取液对DEX、43℃加热及无血清培养等多种因素所诱导的裸鼠脾细胞PCD具有明显的抑制作用。
讨 论
, http://www.100md.com 细胞凋亡和坏死是细胞死亡的两种方式。与细胞坏死不同，细胞凋亡的主要特征是核固缩和染色质的有控降解，它是正常组织清除对机体无益细胞的一种主要方式，无论在生物个体生长发育过程中，还是在保持机体正常组织的平衡、稳定方面均具有重要作用[8]。机体内的细胞凋亡受抑或过度均可导致一系列疾病的发生，有效调控细胞凋亡已成为临床治疗的目标之一[1]。已证实Bcl-2基因产物能拮抗多种因素所引起的PCD，处在PCD基因调控的中心位置[3]。EBV-BHRF1基因与Bcl-2有38%同源性，其表达产物在细胞中的定位也相同，有人推测它与Bcl-2蛋白质一样具有拮抗多种因素引起的细胞凋亡作用[2]。本研究结果显示，EBV-BHRF1全基因的原核表达产物rBHRF1在终浓度为2mg/L，预培养48h，具有抑制1×10-6mol/L DEX作用18h、43℃加热10min及无血清培养48h所诱导的裸鼠脾细胞程序性死亡的作用。rBHRF1拮抗上述因素所诱导的PCD的具体机制尚不明确，其作用的时效、量效关系及其抑制PCD的作用是否具有普遍性等问题均有待于将该重组蛋白纯化后进一步的研究来确定。纯化定量后rBHRF1有望用于临床上多种因PCD过度所引起的疾病如早老性痴呆(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)和再生障碍性贫血(aplastic anemia)等的治疗。
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Fig 1 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from nude mice spleen cells
lane 1: pBR 322/Bst NI, 1857, 1060, 929, 383 bp;lane 2: incubated with 1×10-6mol/L DEX at 37℃,5% CO2 for 18h; lane 3: at 43℃ for 10 min； lane 4:incubated in the absence of fetal calf serum (FCS) at 37℃, 5% CO2 for 48h
图1 用1×10-6mol/L DEX作用18h、43℃加热10min及无血清培养48h后裸鼠脾细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳结果
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Fig 2 Electron microscopy of nude mice spleen cells incubated with or without rBHRF1 at 43℃ for 10 min
Fig 2A Without rBHRF1: The chromatin condensed, but cell and mitochondrial were preserved
Fig 2B With rBHRF1 (2mg/L):The chromatin was normal, cell membrane and mitochondrial
图2 裸鼠脾细胞在有或无重组BHRF1条件下，经43℃加热10min后，电镜观察结果
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Fig 3 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from nude mice spleen cells
lane 1: pBR322/Bst NI, 1857, 1060, 929, 383 bp;lane 2: incubated with 1×10-6mol/L DEX at 37℃, 5% CO2 for 18 h;lane 3: lane 2 with rBHRF1; lane 4: lane 2 with control protein;lane 5: with rBHRF1 at 43℃ for 10 min; lane 6: control for lane 5;lane 7: incubated with rBHRF1 in the absense of FCS at 37℃, 5% CO2 for 48h; lane 8: control for lane 7
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图3 rBHRF1及对照蛋白质对1×10-6mol/L DEX作用18h、43℃加热10min及无血清培养48h后的裸鼠脾细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳结果影响
*广东省科委青年基金(950355)，华南生物中心及广东省卫生厅资助
参考文献
1 Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science, 1995, 267:1456.
2 Henderson S, Huen D, Rowe M, et al. Epstein-Barr virus-code BHRF1 protein, a viral homologue of bcl-2, protects human B cells from programmed cell death. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90:8479.
, 百拇医药
3 Miyashita T, Reed JC. Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis in a human leukemia cell line. Blood, 1993, 81(1):151.
4 Bear R, Bankier AT, Biggin M, et al. DNA sequence and expression of the B95-8 Epstein-Barr virus genome. Nature, 1984, 310:207.
5 朱振宇，陈尚武，戴克胜，等.EB病毒3种全基因的扩增、克隆及表达.中山医科大学学报，1998，19(1)：2.
6 朱振宇，潘景轩，赵群，等.地塞米松诱导裸鼠脾细胞凋亡的研究.中国病理生理杂志，1996，12(2)：113.
7 潘景轩，朱振宇，李惠玲，等.糖皮质激素诱导大鼠胸腺细胞程序性死亡研究.中国免疫学杂志，1996，14(2)：228.
8 Tomei LD, Cope FO. Apoptosis: the molecular basis of cell death. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1991. 1～313.
收稿日期：1997年8月25日
修稿日期：1998年3月2日, http://www.100md.com
单位：戴克胜 张清秀 马涧泉 朱振宇 中山医科大学生物化学教研室；谢 强 潘景轩 中山医科大学 病理生理学教研室 (广州 510089)
关键词：细胞死亡；地塞米松；小鼠；裸；爱波斯坦-巴尔病毒
中国病理生理杂志990209 摘 要 目的：观察适当浓度的EBV-BHRF 1重组蛋白(rBHRF1)抽提液有无拮抗裸鼠脾细胞程序性死亡(PCD)作用。方法：用1×10-6mol/L地塞米松作用18 h、43℃加热10 min及无血清培养48 h等方法诱导脾细胞发生PCD，预先加入终浓度为2mg/L的rBHRF1蛋白起拮抗作用。结果：未加rBHRF1的对照组细胞发生典型的PCD，即细胞DNA的电泳出现PCD特征性的梯形(ladder)DNA降解片段；电镜观察显示核凝缩，但细胞膜及细胞器结构基本保持正常。若与适当浓度的rBHRF1预培养8 h，再用上述方法处理，则因有重组蛋白的保护而未出现DNA降解片段及PCD的形态学变化。结论：初步显示rBHRF1具有抑制脾细胞发生PCD的功能。
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Apoptosis in nude mice spleen cells was inhibited by recombinant EBV-BHRF1 protein
ZHU Zhen-Yu, XIE Qiang, PAN Jing-Xuan, DAI Ke-Sheng, ZHANG Qing-Xiu,MA Jian-Quan
Department of Biochemistry, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou (510089)
Abstract AIM：To observe if recombinant EBV-BHRF1 protein(rBHRF1) could inhibit the programmed cell death (PCD) of nude mice spleen cells. METHODS: PCD models of nude mice spleen cells were set up by induction under 3 factors, i.e.①cultured with 1×10-6mol/L dexmethasone for 24 h, ②43℃ for 10 min and ③in the absence of fetal calf serum for 48 h. And 2mg/L(terminal concentration) rBHRF1 was added 8h before the 3 kind of PCD induction factors. RESULTS: Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from the model cells showed the typical oligonucleosomal pattern of PCD. The cell's chromatin condensed, but cell membrane and mitochondrial were preserved under electron microscopy. PCD of nude mice spleen cells could be inhibited when the cells were cultured with a proper concentration of rBHRF1 for 8 h previously. CONCLUSION: rBHRF1 could suppress the PCD induced by these 3 factors.
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MeSH Cell death; Dexamethasone; Mice, nude; Epstein-Barr virus
程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，又称凋亡(apoptosis)，是目前非常活跃的研究领域之一[1]。Bcl-2基因产物能拮抗多种因素引起的PCD[2]。EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)与人类的多种疾病密切相关，如以珠江流域为高发中心的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)、伯基特淋巴瘤及传染性单核细胞增多症等。EBV的BHRF1基因产物与Bcl-2有38%同源性，在细胞内的定位也相似[3]，但其重组的原核表达产物是否具有抑制多种诱导因素所引起的免疫细胞PCD作用尚未见报道。本室根据EBV全基因序列[4]用PCR方法获得了EBV的BHRF1全基因片段(592bp)，克隆于pBV 221载体，并获得原核表达产物重组EBV-BHRF1蛋白质(rBHRF1)[5]。本研究观察该rBHRF1提取液对地塞米松(dexamethasone, DEX)、43℃加热及无小牛血清培养所诱导的裸鼠脾细胞凋亡的影响。
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材料与方法
(一)实验材料：1.实验动物：6周龄的BALB/c系裸鼠，共18只(每次6只，重复2次实验)，雌雄兼用，购于本校实验动物中心，在该中心无特殊病原体(specific-pathogen free, SPF)条件下喂养。2.DEX.为Sigma公司产品。3.RPMI-1640培养液，购于Gene公司。
(二)实验方法：1.无菌取脾，按常规方法制备脾细胞，细胞终浓度为3×106个/mL，经台盼蓝染色检查，死细胞小于5%，分成3组(各分实验组和对照组)备用。2.实验组加入重组蛋白抽提液(终浓度为2mg/L)，而对照组加入不含BHRF1片段的空白质粒转化的菌体抽提液。在37℃，体积分数为5% CO2培养8h后，第一组加1×10-6mol/L地塞米松作用，继续培养18h[6]；第二组在43℃作用10min；第三组在无小牛血清培养液中继续培养48h，常规方法收集各组细胞。3.DNA裂解片段抽提方法及常规透射电镜检测参见朱振宇等[6]及潘景轩等[7]方法。
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结 果
(一)裸鼠脾细胞PCD模型的建立：在10-6mol/L地塞米松作用18h、43℃加热10min及无血清培养48h等方法处理后，抽提细胞DNA，经琼脂糖凝胶电泳显示均出现PCD特征性的梯形(ladder)DNA降解片段，片段大小为180bp或其整倍数(见图1)。常规透射电镜下观察，细胞核凝缩，细胞膜及线粒体膜等结构基本保持完整，但未见有凋亡小体出现(见图2A)。而加入rBHRF1的细胞结构则基本保持正常(见图2B)。
(二)rBHRF1对裸鼠脾细胞PCD的影响：实验组因有rBHRF1的保护，其DNA降解片段明显少于各对照组(图3)，也很少出现上述PCD形态学变化。初步表明rBHRF1提取液对DEX、43℃加热及无血清培养等多种因素所诱导的裸鼠脾细胞PCD具有明显的抑制作用。
讨 论
, http://www.100md.com 细胞凋亡和坏死是细胞死亡的两种方式。与细胞坏死不同，细胞凋亡的主要特征是核固缩和染色质的有控降解，它是正常组织清除对机体无益细胞的一种主要方式，无论在生物个体生长发育过程中，还是在保持机体正常组织的平衡、稳定方面均具有重要作用[8]。机体内的细胞凋亡受抑或过度均可导致一系列疾病的发生，有效调控细胞凋亡已成为临床治疗的目标之一[1]。已证实Bcl-2基因产物能拮抗多种因素所引起的PCD，处在PCD基因调控的中心位置[3]。EBV-BHRF1基因与Bcl-2有38%同源性，其表达产物在细胞中的定位也相同，有人推测它与Bcl-2蛋白质一样具有拮抗多种因素引起的细胞凋亡作用[2]。本研究结果显示，EBV-BHRF1全基因的原核表达产物rBHRF1在终浓度为2mg/L，预培养48h，具有抑制1×10-6mol/L DEX作用18h、43℃加热10min及无血清培养48h所诱导的裸鼠脾细胞程序性死亡的作用。rBHRF1拮抗上述因素所诱导的PCD的具体机制尚不明确，其作用的时效、量效关系及其抑制PCD的作用是否具有普遍性等问题均有待于将该重组蛋白纯化后进一步的研究来确定。纯化定量后rBHRF1有望用于临床上多种因PCD过度所引起的疾病如早老性痴呆(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)和再生障碍性贫血(aplastic anemia)等的治疗。
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Fig 1 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from nude mice spleen cells
lane 1: pBR 322/Bst NI, 1857, 1060, 929, 383 bp;lane 2: incubated with 1×10-6mol/L DEX at 37℃,5% CO2 for 18h; lane 3: at 43℃ for 10 min； lane 4:incubated in the absence of fetal calf serum (FCS) at 37℃, 5% CO2 for 48h
图1 用1×10-6mol/L DEX作用18h、43℃加热10min及无血清培养48h后裸鼠脾细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳结果
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Fig 2 Electron microscopy of nude mice spleen cells incubated with or without rBHRF1 at 43℃ for 10 min
Fig 2A Without rBHRF1: The chromatin condensed, but cell and mitochondrial were preserved
Fig 2B With rBHRF1 (2mg/L):The chromatin was normal, cell membrane and mitochondrial
图2 裸鼠脾细胞在有或无重组BHRF1条件下，经43℃加热10min后，电镜观察结果
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Fig 3 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from nude mice spleen cells
lane 1: pBR322/Bst NI, 1857, 1060, 929, 383 bp;lane 2: incubated with 1×10-6mol/L DEX at 37℃, 5% CO2 for 18 h;lane 3: lane 2 with rBHRF1; lane 4: lane 2 with control protein;lane 5: with rBHRF1 at 43℃ for 10 min; lane 6: control for lane 5;lane 7: incubated with rBHRF1 in the absense of FCS at 37℃, 5% CO2 for 48h; lane 8: control for lane 7
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图3 rBHRF1及对照蛋白质对1×10-6mol/L DEX作用18h、43℃加热10min及无血清培养48h后的裸鼠脾细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳结果影响
*广东省科委青年基金(950355)，华南生物中心及广东省卫生厅资助
参考文献
1 Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science, 1995, 267:1456.
2 Henderson S, Huen D, Rowe M, et al. Epstein-Barr virus-code BHRF1 protein, a viral homologue of bcl-2, protects human B cells from programmed cell death. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90:8479.
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3 Miyashita T, Reed JC. Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis in a human leukemia cell line. Blood, 1993, 81(1):151.
4 Bear R, Bankier AT, Biggin M, et al. DNA sequence and expression of the B95-8 Epstein-Barr virus genome. Nature, 1984, 310:207.
5 朱振宇，陈尚武，戴克胜，等.EB病毒3种全基因的扩增、克隆及表达.中山医科大学学报，1998，19(1)：2.
6 朱振宇，潘景轩，赵群，等.地塞米松诱导裸鼠脾细胞凋亡的研究.中国病理生理杂志，1996，12(2)：113.
7 潘景轩，朱振宇，李惠玲，等.糖皮质激素诱导大鼠胸腺细胞程序性死亡研究.中国免疫学杂志，1996，14(2)：228.
8 Tomei LD, Cope FO. Apoptosis: the molecular basis of cell death. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1991. 1～313.
收稿日期：1997年8月25日
修稿日期：1998年3月2日, http://www.100md.com